流感抑制組合物和方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2008年6月25日的中國專利申請200880021890. 7"流感抑制 組合物和方法"的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉參照
[0003] 本申請要求2007年6月25日提交的U.S.臨時申請系列No. 60/937, 120的權(quán)益， 其是2004年11月3日提交的U.S.臨時申請系列No. 10/578, 013的部分繼續(xù)，其要求了 2003年11月4日提交的U.S.臨時申請系列No. 60/517, 181的權(quán)益，在此將每篇全部引入 作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及包含肽的對預(yù)防或抑制由流感病毒引起的細(xì)胞的病毒感染有效的組 合物，以及用其治療或預(yù)防流感感染的方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 所有的病毒都必須結(jié)合并侵入到它們的目標(biāo)細(xì)胞以進(jìn)行復(fù)制。對于有包膜病毒， 包括具有I類膜融合蛋白的RNA病毒，該過程包括（a)病毒體結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞，（b)病毒的包 膜與原生質(zhì)膜或內(nèi)在細(xì)胞膜融合，（c)病毒包膜和細(xì)胞膜在融合區(qū)的去穩(wěn)定作用以產(chǎn)生融 合孔，（d)病毒RNA通過孔傳遞，和（e)通過病毒RNA的細(xì)胞功能的修飾。
[0006] 上述步驟（b)和（c)，包括病毒膜和細(xì)胞膜的融合，通過病毒跨膜糖蛋白（融合蛋 白）與目標(biāo)細(xì)胞的表面蛋白和膜的交互作用來介導(dǎo)。這些交互作用引起了融合蛋白的構(gòu)象 變化，這導(dǎo)致了病毒融合肽插入目標(biāo)細(xì)胞膜中。該插入后接著在融合蛋白內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)一步的 構(gòu)象變化，這使得病毒胞膜和細(xì)胞膜變得接近，并且導(dǎo)致該兩個膜雙層的融合。
[0007] 如果融合過程被破壞，病毒不能在其宿主中傳播和繁殖?？梢酝ㄟ^將肽和肽模擬 物同源物定向到融合蛋白序列、識別融合蛋白的抗體、和對抗融合蛋白的其他因素來實(shí)現(xiàn) 該融合過程的故意破壞。
[0008] 血球凝集素2(HA2)是流感病毒的包膜蛋白，其是原型RNA病毒的I類融合蛋白， 而流感病毒是一種正粘液病毒。HA2包含氨基端疏水區(qū)域，認(rèn)為是融合肽，它在血球凝集素 前體蛋白分裂過程中被暴露。逆轉(zhuǎn)錄病毒跨膜蛋白包含若干個除融合蛋白外與HA2已知結(jié) 構(gòu)相同的結(jié)構(gòu)特性，包括延伸的氨基端螺旋（N-螺旋，通常稱為"七肽重復(fù)區(qū)"或"亮氨酸拉 鏈"），羧基端螺旋（C-螺旋）和鄰近跨膜結(jié)構(gòu)域的芳香族基序。這五個結(jié)構(gòu)域中至少存在 四個就能將病毒包膜蛋白限定為I類融合蛋白。
[0009] 圖1顯示了I類病毒六個科的融合蛋白中的五個之前所述的結(jié)構(gòu)域。融合蛋白起 始于疏水融合肽，終止于錨肽，并且結(jié)合了延伸的氨基端α螺旋（N-螺旋，通常稱為"七肽 重復(fù)區(qū)"或"亮氨酸拉鏈"），羧基端α螺旋（C-螺旋），以及有時鄰近病毒包膜的芳香族基 序。同時顯示了各病毒科是第六個結(jié)構(gòu)域，在此認(rèn)為是融合起始區(qū)域（FIR)，這是本發(fā)明人 所發(fā)現(xiàn)的，并且公開于U.S.系列No. 10/578, 013中。
[0010] 每年約10至20%的美國民眾遭受季節(jié)性流感。雖然大部分人在一至兩周內(nèi)復(fù)原， 但是年弱的、年老的以及患有慢性病癥的個人可能發(fā)展成為流感后肺炎和其它致命的并發(fā) 癥。流感的病原體是流感病毒，是一種正粘液病毒，其通過分段病毒基因組的再分布和突變 過程容易發(fā)展成新的毒株。
[0011] 甲型流感病毒的高毒性毒株可以產(chǎn)生傳染病和流行病。近幾年來，已經(jīng)出現(xiàn)了能 夠引起高死亡率的禽類甲型流感病毒亞型H5N1的高致病毒株。由于流感病毒對公共衛(wèi)生 的威脅以及作為生物危害的潛在因素，發(fā)展治療法以控制季節(jié)性流感和增加的大流行感冒 的威脅是高度優(yōu)先考慮的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防流感感染和/或預(yù)防流感人到人傳播的肽、肽類似 物、肽衍生物和藥物組合物。本發(fā)明的肽包含野生型流感血球凝集素2蛋白或其變體的融 合起始區(qū)（FIR)的流感病毒-細(xì)胞融合抑制部分。通過在野生型血球凝集素2蛋白序列的 氨基酸殘基序列中的選定取代，變體不同于野生型蛋白。
[0013] 在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離肽由選定的野生型流感血球凝集素2蛋白或 其變體的一部分的8至40個連續(xù)的氨基酸殘基組成。血球凝集素2蛋白的該部分包含蛋白 的融合起始區(qū)（FIR)和FIR的氨基端和羧基端上至多五個氨基酸殘基。該部分還至少包括 序列YNAELL(SEQIDN0:1)或其不同于SEQIDN0:1 -個或多個氨基酸取代的變體，其一 個或多個氨基酸取代選自Y1S、Y1T、Y1W、Y1A、N2Q、A3L、A3I、A3V、E4D、E4K、E4R、E4H、L5I、 1^5￥、1^5八、1^61、1^6￥和1^6八。
[0014] 在該第一個實(shí)施方案中，變體通過上述選定的野生型蛋白的一部分氨基酸序列中 一個或多個氨基酸取代而不同于野生型序列。該取代可以選自其它野生型流感血球凝集 素2蛋白的相應(yīng)氨基酸殘基或野生型殘基的保守取代，優(yōu)選地用于變體維持Wimley-White 界面親水性分布特征，變體在至少一個野生型血球凝集素2氨基酸序列的相應(yīng)區(qū)域的 Wimley-White界面親水性分布特征的局部最大值和局部最小值的約5個氨基酸殘基內(nèi)的 分布特征中具有局部最大值和局部最小值。優(yōu)選地，選定的野生型序列的變體與野生型序 列具有至少50 %的序列同一性。
[0015] 在第二個實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含來自殘基72至131區(qū)域中的蛋白片段的野 生型甲型流感或乙型流感血球凝集素2蛋白的FIR的8至40個氨基酸殘基部分，或其通過 在野生型序列中一個或多個殘基取代而不同于野生型序列的殘基72-131的變體。變體中 的取代選自其它野生型血球凝集素2蛋白相應(yīng)的氨基酸殘基或其保守取代，優(yōu)選選擇用于 保持肽的Wimley-White親水性分布特征的整體形態(tài)，即維持變體的Wimley-White親水性 分布特征，該變體在對應(yīng)野生型血球凝集素2氨基酸序列的Wimley-White界面親水性分布 特征的局部最大值和局部最小值的約5個氨基酸殘基的分布特征中具有局部最大值和局 部最小值。優(yōu)選，該實(shí)施方案中的變體通過保守取代不同于野生型序列。
[0016] 在第三個實(shí)施方案中。本發(fā)明的肽由SEQIDNO:2(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY NAELLVALENQHTIDLTDS)或其變體的氨基酸序列的8至40個連續(xù)的氨基酸殘基組成。SEQ IDNO:2包含野生型甲型流感亞型H3(SEQIDNO:19)的血球凝集素2蛋白的氨基酸殘基 72-113。該8至40個氨基酸殘基包含SEQIDN0 :2或其變體的至少氨基酸殘基23至28。 在該實(shí)施方案中，變體通過選自E1D、E1N、E1Q、V2G、V2S、V2T、V2I、V2L、V2A、V2M、V2C、E3D、 E3N、E3Q、G4T、G4S、G4K、G4R、G4H、G4Q、G4N、R5K、R5H、R5Q、R5N、I6L、I6V、I6A、I6M、I6C、Q7N、Q7E、Q7D、Q7G、Q7S、Q7T、D8E、D8N、D8Q、D8M、D8C、L9I、L9V、L9A、L9M、L9C、E10D、E10N、 E10Q、E10I、E10L、E10V、E10A、E10M、E10C、K11R、K11H、K11D、K11E、K11N、K11Q、Y12W、Y12K、 Y12R、Y12H、V13I、V13L、V13A、V13G、V13T、V13S、V13M、V13C、E14D、E14K、E14R、E14H、D15E、 D15R、D15N、D15Q、T16G、T16S、T16A、T16Q、T16N、K17F、K17R、K17M、K17C、K17I、K17V、K17L、 K17A、I18L、I18V、I18A、I18T、I18S、I18G、I18Q、I18N、D19E、D19N、D19Q、L20I、L20V、L20A、 L20C、L20M、W21Y、W21A、S22T、S22G、S22A、S22M、S22C、Y23W、Y23S、Y23T、Y23A、N24Q、N24D、 N24E、A25I、A25V、A25L、A25M、E26D、E26K、E26R、E26H、L27A、L27I、L27V、L27M、L28I、L28V、 L28A、L28M、V29I、V29L、V29A、V29M、A30I、A30L、A30V、A30M、A30C、L31I、L31V、L31A、L31M、 L31C、E32D、E32N、E32Q、N33Q、N33Q、Q34E、N33E、Q34E、Q34D、Q34G、Q34S、Q34T、H35K、H35R、 H35N、H35Q、T36S、T36G、I37L、I37V、I37A、I37M、I37C、D38E、D38N、D38Q、L39F、L39I、L39V、 L39M、L39C、L39A、L39E、L39D、L39N、L39Q、T40H、T40R、T40K、T40S、T40G、T40A、T40M、D41E、 D41N、D41Q、S42G、S42T、S42I、S42L、S42V、S42A、S42M和S42C的一個或多個氨基酸取代不 同于SEQIDNO:2。
[0017] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是由序列SEQIDNO:3-13任意至少8個連 續(xù)的氨基酸殘基組成的肽，其代表了野生型甲型流感血球凝集素2(HA2)或乙型流感血球 凝集素（HB)蛋白的FIR部分。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽由SEQIDNO:3-13任一的變 體的至少8個氨基酸連續(xù)殘基組成。在該可選的實(shí)施方案中，變體通過類似于上述第三個 實(shí)施方案中描述的一個或多個氨基酸取代，優(yōu)選地保守取代，不同于選定的序列。
[0018] 當(dāng)本發(fā)明的肽，這里指的是流感抑制劑-3(F3)施用到白鼬的鼻腔時，可以有效地 阻止動物中流感的發(fā)展，以及動物到動物的流感傳播。F3的氨基酸序列與大多數(shù)甲型流感 H3亞型病毒的殘基84-99相同，包括當(dāng)前在人類中傳播的A/H3N2毒株。在體外，在低nM范 圍（< 5nM)內(nèi)用IC50的免疫蝕斑分析中，F(xiàn)3還可以有效對抗重組體H5N1流感病毒和乙 型流感的兩個毒株（B/上海/361/2002和B/上海/10/2003)。已知這些不同甲流和乙流菌 株的多樣性，F(xiàn)3很可能能有效對抗大部分流感病毒。
[0019] 在其它方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明肽的類似物（例如，環(huán)狀肽，或包含非天然氨 基酸的肽），肽的衍生物，或者肽或類似物，其中肽或類似物包含結(jié)合肽殘基的非-HA2-衍 生基團(tuán)（例如，脂質(zhì)或非流感HA2肽序列）和對本發(fā)明的肽、類似物或衍生物特異性的分離 抗體（即，能夠特異性和選擇性地結(jié)合）。
[0020] 本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明的肽、類似物、衍生物或抗體在治療或預(yù)防流感感 染的治療方法中的用途。該用途包括本發(fā)明的肽、類似物、衍生物或抗體用于制備治療流感 的藥物的用途。本發(fā)明的肽、類似物、衍生物和抗體可以與藥物學(xué)上可接受的載體結(jié)合包含 于藥物組合物中。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示了在先鑒定的I型病毒的6個科的融合蛋白區(qū)域，以及被認(rèn)為是融合起 始區(qū)（FIR)的第六個結(jié)構(gòu)域。
[0022] 圖 2 顯示了HA2變體H1(SEQIDNO:17)、H2(SEQIDNO:18)、H3(SEQIDN0 :19)、 H4(SEQIDNO:20)、H5(SEQIDNO:21)、H6(SEQIDNO:22)、H7(SEQIDNO:23)、H9(SEQID N0:24)、H10(SEQIDN0:25)、H13(SEQIDN0:26)、H14(SEQIDN0:27)、H15(SEQIDNO: 28)和H16(SEQIDNO:29)的序列對比。
[0023] 圖3顯示了乙型流感血球凝集素2,B/Yamagata/16/1988(SEQIDNO:30)的氨基 酸殘基序列。
[0024] 圖4顯示了甲型流感和乙型流感血流凝集素2蛋白的殘基72-113,特別是甲型流 感亞型H1(SEQIDN0:17)、H2(SEQIDN0:18)、H3(SEQIDN0:19)、H4(SEQIDN0:20)、 H5(SEQIDNO:21)、H6(SEQIDNO:22)、H7(S