單克隆抗體純化工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別是涉及單克隆抗體的純化工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1997年，美國基因泰克公司成功研發(fā)出第一個(gè)人源化的單克隆抗體藥物，邁出了 單抗藥物產(chǎn)業(yè)化的第一步。短短10多年歷史，抗體藥物呈現(xiàn)出銳不可擋的發(fā)展態(tài)勢，有幾 個(gè)數(shù)字可以說明抗體藥物的地位和發(fā)展前景：2010年全球治療用單抗藥物的銷售總額達(dá) 到 440億美元，如果加上100億美元的單抗診斷和研究試劑，單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到 550億美元，2011年單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到628億美元。而在此前的2009年和2008 年，該數(shù)字分別為400億美元和370億美元(數(shù)據(jù)來源于國家統(tǒng)計(jì)局)。當(dāng)前，幾乎所有大型 制藥公司都有單抗研發(fā)項(xiàng)目。
[0003] 雖然世界經(jīng)濟(jì)下滑風(fēng)險(xiǎn)趨勢的加大對單克隆抗體藥物的增長有所影響，但單克隆 抗體藥物的興起已經(jīng)不可阻擋，隨著單克隆抗體藥物研究的不斷深入，新藥的不斷推出，未 來，全球單克隆抗體藥依舊會保持較高的增長率。分析預(yù)測，到2015年，全球單克隆抗體藥 銷售額有望達(dá)980億美元左右。然而，目前抗體藥物單批產(chǎn)量最高才達(dá)到千克級，而抗體藥 物的單劑用量是微克、毫克級。可見抗體藥物的價(jià)值遠(yuǎn)超過黃金。如此昂貴的產(chǎn)品，制造工 藝就顯得格外重要，工藝的任何不完善都可能造成極大的損失。
[0004] 抗體藥物的制造又以下游工藝最為復(fù)雜繁瑣。下游工藝包含多個(gè)步驟，目前常用 的是親和層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析的液相色譜分離方法。雖然都是采用這 幾種層析方法，但是具體的參數(shù)不同、填料選擇不同都會產(chǎn)生完全不同的結(jié)果。
[0005] 親和層析作為層析分離的第一步，一般作用是捕獲發(fā)酵上清中的產(chǎn)品?；谔禺?性免洗吸附的原理，經(jīng)過親和層析后的產(chǎn)品一般可以達(dá)到大于80%的單體純度，同時(shí)還能 保證較高的回收率。然而抗體藥物不僅需要保證單體純度，還需要盡可能的減少宿主蛋白 和DNA的殘留。大多數(shù)抗體產(chǎn)品的純化工藝都把宿主蛋白（HCP)和DNA的去除依托在后續(xù) 步驟，但從絕對去除量上來看，未和層析才是去除宿主蛋白和DNA最多的步驟，所以在未和 層析這步去除盡可能多的宿主蛋白和DNA會大大減輕后續(xù)步驟的壓力。
[0006] 親和層析洗脫收集液經(jīng)過低pH病毒滅活后，用堿性緩沖液中和時(shí)一般會較混濁， 這種情況一般為少量殘留的HCP和DNA在pH4 - 6時(shí)產(chǎn)生共沉淀導(dǎo)致。如果將這部分雜質(zhì) 去除可能會稍微降低一點(diǎn)回收率但卻可以去除更多的HCP和DNA，同時(shí)也更有利于提高后 續(xù)除病毒過濾膜的載量，從而降低成本。
[0007] 陽離子交換層析主要用于去除高聚物，同時(shí)能進(jìn)一步去除宿主蛋白和DNA。常規(guī)的 方法是低鹽上樣后，用高鹽洗脫，選擇適合的鹽濃度將目的蛋白洗脫，從而達(dá)到分離效果。 但是常規(guī)洗脫模式分辨率較低，只能稍許提高目的蛋白純度，對于與目的蛋白電荷差異較 小的酸堿性類似物分離效果較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種單克隆抗體純化工藝方法，它可以提高單克 隆抗體產(chǎn)品的純度。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的單克隆抗體純化工藝方法，步驟包括：
[0010] 1)親和層析；
[0011] 2)調(diào)節(jié)親和層析洗脫液的pH值至3. 3~3. 8,進(jìn)行病毒滅活；
[0012] 3)調(diào)節(jié)pH值至中性，進(jìn)行深層過濾；
[0013] 4)陰離子交換層析；
[0014] 5)陽離子交換層析。
[0015] 較佳的，步驟1)的親和層析在上樣后，洗脫前，用pH值5. 0~5. 5、濃度1~3M的 高濃度鹽溶液洗滌層析柱。例如，可以先用20mM檸檬酸-檸檬酸鈉(或醋酸-醋酸鈉）和 IM氯化鈉的混合溶液洗滌層析柱，再用20mM檸檬酸-檸檬酸鈉(或醋酸-醋酸鈉）洗滌層 析柱。其中，氯化鈉也可以用氯化鉀或硫氰酸鉀代替。
[0016] 步驟3)所述深層過濾可以采用0. 1~0. 5 μπι孔徑的二級深層過濾器。
[0017] 較佳的，步驟5)的陽離子交換層析在洗脫前，可以先用高pH值的緩沖液（pH值 6. 0~9. 0)洗滌陽離子交換層析柱，然后在目的蛋白峰出來前換成低pH值的平衡液。
[0018] 與現(xiàn)有純化方法相比，本發(fā)明的單克隆抗體純化工藝方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效 果：
[0019] 1.通過在親和層析中加入洗滌步驟，有效地去除了高聚物、片段、HCP和DNA等雜 質(zhì)，提高了抗體純度，同時(shí)避免了多次稀釋和調(diào)節(jié)pH。
[0020] 2.通過在親和層析洗脫液低pH滅活并中和后，加入深層過濾步驟，進(jìn)一步去除了 宿主蛋白、DNA和高聚物，提高了抗體的純度。經(jīng)過濾澄清處理的產(chǎn)品后期納濾去除病毒時(shí) 載量較高，不容易堵塞。而沒有經(jīng)過深層過濾的產(chǎn)品后期納濾易堵膜，進(jìn)行去病毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 時(shí)也很難通過。
[0021] 3.通過在陽離子交換層析中，增加高pH鹽洗滌步驟，去除酸性和堿性雜質(zhì)，使產(chǎn) 品的CEX主峰純度提高了至少5%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例，對本 發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明。實(shí)施例中涉及的各項(xiàng)指標(biāo)采用以下檢測方法：SEC (單體 純度)采用分子排阻高效液相色譜法檢測，CEX (電荷純度)采用陽離子交換高效液相色譜法 檢測，殘留HCP采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，殘留DNA采用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測，殘留ProA (蛋白質(zhì)A)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。
[0023] 實(shí)施例1赫賽汀單克隆抗體純化
[0024] 1.蛋白質(zhì)A親和層析
[0025] 步驟1，用3倍柱體積的注射用水淋洗層析柱，然后用3倍柱體積的NaOH (50mM) 和NaCl (IM)的混合溶液消毒層析柱，再用3倍柱體積的注射用水淋洗層析柱。
[0026] 步驟2,用5倍柱體積的緩沖液（20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉+150mM NaCl， PH7.4)平衡層析柱。
[0027] 步驟3,上樣，讓樣品在柱上保留4分鐘。
[0028] 步驟4,用20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉+150mM NaCl，pH7. 4淋洗至A280基線， 然后用5倍柱體積的緩沖液（20mM檸檬酸-檸檬酸鈉 +IM NaCl，pH5. 5)洗滌層析柱，再用 3倍柱體積的緩沖液（20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH5. 5)洗滌層析柱。
[0029] 通過在步驟4中增加兩次緩沖液洗滌步驟，大大減少了親和層析洗脫液中HCP的 殘留。未增加洗滌步驟前，親和層析洗脫液中HCP的殘留量一般在IO 3Ppm級別，增加洗滌 步驟后，HCP殘留量降低60%-80%，具體數(shù)據(jù)見表1 :
[0030] 表1親和層析加入洗滌步驟后的HCP殘留量
[0032] 由表1可見，親和層析加入適當(dāng)?shù)南礈觳襟E后，HCP殘留量顯著降低，從8374ppm降 低至 2520ppm。
[0033] 步驟5,用緩沖液（20m