專利名稱：單克隆抗IgM抗體，它們的生產(chǎn)和用途，以及產(chǎn)生同樣物質(zhì)的雜交瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)和單克隆抗體產(chǎn)生領(lǐng)域。更特定地，它涉及單克隆抗IgM抗體，產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤，從這些抗體制得的免疫化學(xué)物質(zhì)，以及那些免疫化學(xué)物質(zhì)的用途。
自從Kohler和Milstein發(fā)表了描述生產(chǎn)單克隆抗體的報告后，生產(chǎn)能產(chǎn)生預(yù)先決定特異性的抗體的不朽淋巴細(xì)胞的技術(shù)得到了發(fā)展，該發(fā)展對臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究，以及適用于很大范圍的病理學(xué)疾病的診斷和治療的治療性方法有重要的影響。
抗體是免疫系統(tǒng)應(yīng)答抗原刺激物產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。這些蛋白與抗原分子上的特定位點(表位)特異性結(jié)合。多克隆抗體從用抗原免疫的動物衍生，它們在多重位點(表位)與抗原結(jié)合。在另一方面，單克隆抗體是一個特異性的限定的抗體組，它們從產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞的單個克隆(單克隆)衍生。與多克隆抗體相反，單克隆抗體僅與在抗原分子上的一個特異性表位結(jié)合。
雖然產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)已存在一些時間了，但是現(xiàn)有的方法費時，費力，而且常常產(chǎn)生雖然對靶抗原有特異性，但對該抗原具較低親和力的抗體，因此，在各種應(yīng)用中具有局限的用途。
在產(chǎn)生有用的及臨床上相關(guān)單克隆抗體所遇到的困難中，有一個是從雜交瘤獲得的IgM亞型抗體的豐富性，雜交瘤是通過體內(nèi)或體外標(biāo)準(zhǔn)免疫方法產(chǎn)生的。IgM亞型抗體通常是低親和力的，較難純化，而且常常含由雜交瘤產(chǎn)生的大多數(shù)抗體。另外，在分泌IgM和IgG的雜交瘤細(xì)胞的混合培養(yǎng)物中，分泌IgM的細(xì)胞的生長常常超過分泌IgG的雜交細(xì)胞。
生產(chǎn)雜交瘤的費力步驟的部分是消除在細(xì)胞融合后產(chǎn)生的生產(chǎn)IgM的雜交瘤細(xì)胞。這通常是這樣完成的，通過有限稀釋克隆細(xì)胞，使個體細(xì)胞生長成克隆，獨個測試每個克隆來確定產(chǎn)生IgG亞型抗體的克隆。通常，然后進(jìn)一步分析產(chǎn)生IgM的雜交瘤細(xì)胞以確定所產(chǎn)生的抗體的抗原特異性。
雖然已報道了抗在IgM抗體上表位的抗體，所有至今測的抗體與IgG亞型抗體也有反應(yīng)性。
申請人及他人公開了將細(xì)胞毒性試劑與抗體相連以產(chǎn)生“免疫毒素”的方法。最近注意集中在由單克隆抗體通過異-二重功能試劑與細(xì)菌或植物源的毒素的酶活性部分(A鏈)結(jié)合產(chǎn)生的免疫毒素上(Nevelle，D.M.and Youle，R.J.，Immunol Rev(1982)6275-91;Ross，W.C.J.，et al.，European J Biochem(1980)104;Vitteta，E.S.，et al.，Immunol Rev(1982)62158-183;Raso，V.，et al.，Cancer Res(1982)42457-464;Trowbridge，I.W and Domingo，D.L.，Nature(Cond)(1981)294171-173。
本發(fā)明的一個主要方面是關(guān)于大鼠單克隆抗體，它們(a)與IgM亞型抗體選擇性結(jié)合;
(b)是IgGs;
(c)不與IgG1與IgG2亞型結(jié)合。
這些抗體的較佳實施例是命名做2G10的，及其功能性等同物。產(chǎn)生上述抗體的大鼠×大鼠雜交瘤以及這些雜交瘤的后代是本發(fā)明的其它方面。
本發(fā)明還包括制備如上定義的雜交瘤的方法，包括使大鼠腫瘤細(xì)胞與從用鼠IgM亞型免疫原免疫的大鼠獲得的大鼠脾細(xì)胞融合，然后選擇如上所定產(chǎn)生抗體的雜交瘤。
本發(fā)明進(jìn)一步包括產(chǎn)生如上限定的抗體的方法，包括培養(yǎng)具有產(chǎn)生這種抗體能力的雜交瘤，或通過上述方法任意地制備的雜交瘤。
本發(fā)明的另一個方面涉及免疫毒素及它們的制備方法，通過結(jié)合(a)上述單克隆抗體，及(b)細(xì)胞毒性部分或磁珠。
本發(fā)明的另一個部分涉及上述單克隆抗體的標(biāo)記衍生物，抗體由可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，衍生物可用于定靶，特異性選擇或分類。
本發(fā)明的另一個方面涉及殺死產(chǎn)生IgM雜交瘤或B細(xì)胞的方法，通過使細(xì)胞與細(xì)胞殺傷有效量的一個或多個上述免疫毒素接觸。
本發(fā)明的其它方面是直接或間接免疫分析，以測定細(xì)胞是否產(chǎn)生IgM抗體，或測定抗體是否是IgM異型。這些分析涉及使細(xì)胞與單克隆抗體或其標(biāo)記衍生物孵育。當(dāng)使用標(biāo)記衍生物時，可以直接讀出在細(xì)胞上標(biāo)記二元免疫復(fù)合體的存在。當(dāng)使用未標(biāo)記抗體時，細(xì)胞進(jìn)一步與抗單克隆抗體的標(biāo)記抗體孵育，然后讀出在細(xì)胞上標(biāo)記三元免疫復(fù)合體的存在。


圖1說明在雜交瘤上清液中篩選IgM特異性抗體。
圖2說明抗體2G10的劑量依賴性特異性結(jié)合。
圖3說明在2G10結(jié)合上增加吸收鼠免疫球蛋白的作用。
圖4表示在間接ELISA中2G10選擇性識別鼠IgM。
圖5通過SDS-PAGE說明2G10抗體的純度。
圖6通過烏赫特朗氏免疫擴(kuò)散表示大鼠2G10抗體亞綱特征。
圖7說明運用2G10與表達(dá)IgM亞綱抗體的細(xì)胞結(jié)合。
圖8說明在凝膠過濾基質(zhì)上免疫毒素(2G10與gelonin的結(jié)合物)的洗脫圖。
圖9通過SDS-PAGE說明2G10-gelonin免疫毒素的純度。
圖10說明免疫毒素(2G10-gelonin)與鼠IgM特異性結(jié)合。
為使這兒描述的本發(fā)明更易被充分理解，給出以下詳盡描述。
如這兒所用，術(shù)語“單克隆抗體”指具有同源抗體群的抗體組合物。關(guān)于抗體源或它制造的方式并不受限制。
如其中所用，關(guān)于擴(kuò)增的大鼠單克隆抗-鼠IgM抗體，術(shù)語“功能性等同物”指單克隆抗體，它(a)交叉阻斷擴(kuò)增的單克隆抗體;(b)選擇性與鼠IgM抗體結(jié)合;(c)具有G異型;以及(d)不同IgG1或IgG2異型結(jié)合。
如這兒所用，關(guān)于本發(fā)明的產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，術(shù)語“后代”包括親代雜交瘤的所有衍生物，后代及子孫，這種雜交瘤產(chǎn)生親本生產(chǎn)的單克隆抗鼠IgM抗體，不管年代或核型一致性。
本發(fā)明可被用來生產(chǎn)與任何種類IgM抗體結(jié)合的抗體。本發(fā)明所教的僅需用于獲取穩(wěn)定及連續(xù)地產(chǎn)生針對免疫種類的抗IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞系。較佳地，本發(fā)明的抗IgM單克隆抗體針對鼠或人IgM。
用來制取本發(fā)明雜交瘤的抗體產(chǎn)生融合伙伴是通過用鼠IgM抗體免疫大鼠而產(chǎn)生的。用免疫原量的在弗氏佐劑中的鼠IgM抗體給大鼠皮下及腹膜內(nèi)接種，然后再用相似量的在佐劑中的免疫原以提升。在最后提升幾天后從免疫大鼠獲取脾，然后從此制備細(xì)胞懸浮液用于融合中。
用常規(guī)體細(xì)胞雜交技術(shù)(Kohler，B.and Milstein，C.，Nature(1975)256495-497[as modified by Buck，D.W.，et al，In Vitro(1982)18377-381]從脾細(xì)胞和大鼠腫瘤對應(yīng)物中制備雜交瘤。在雜交中可用可得到的大鼠骨髓瘤，如YB2/0和Y3-Ag1.2.3.基本上，融合腫瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的技術(shù)涉及使用如聚乙二醇的融合原。融合后，從融合培養(yǎng)基中分離細(xì)胞并生長在選擇性生長培養(yǎng)基中，如HAT培養(yǎng)基，以去除未雜交親代細(xì)胞。如果需要的話，擴(kuò)增雜交瘤，通過傳統(tǒng)免疫檢測方法(如放射性免疫分析，酶免疫分析，或熒光免疫分析)，將免疫劑IgG1，IgG2和IgM(鼠IgM抗體)用作抗原，分析上清液中抗鼠IgM活性。進(jìn)一步鑒定陽性克隆以測定它們是否達(dá)到了本發(fā)明抗體的標(biāo)準(zhǔn)。
可在體內(nèi)或體外用已知方法生長產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤。單克隆抗體可以從培養(yǎng)基或體液中分離，如案子中所述，傳統(tǒng)免疫球蛋白純化步驟，如硫酸銨沉淀，凝膠電泳，滲析，層析法，以及超過濾，如果需要的話。
單克隆抗體的重要特征是(1)它們的免疫球蛋白類別，(2)它們對鼠IgM抗體的選擇性，及(3)它們在鑒別和與產(chǎn)鼠IgM雜交瘤細(xì)胞結(jié)合上的用途。
給定抗體的選擇性和范圍通過測試它抗(1)生產(chǎn)IgG1，IgG2，和IgM的雜交瘤細(xì)胞及(2)IgG1，IgG2和IgM抗體欄來測定。在選擇所述抗體時，超初篩選了約162個生長的雜交瘤培養(yǎng)物。9個克隆與鼠IgM抗體反應(yīng)，但不與IgG反應(yīng)。選擇其中一個克隆以進(jìn)一步鑒定。
用N-琥珀酰亞胺酰-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)或亞氨基硫醇烷(IT)作為偶合劑使表示可接受選擇性和范圍的抗體與gelonin連接。測試結(jié)合物抗Igm和IgG包被板(圖11)以測定在化學(xué)偶聯(lián)到毒素后是否仍保存了抗體特異性。
在以下的實施例中進(jìn)一步詳細(xì)提供該抗體的特征。
本發(fā)明單克隆抗體的免疫化學(xué)衍生物中具有重要意義的是免疫毒素(抗體和細(xì)胞毒性部分的結(jié)合物)以及標(biāo)記的(如放射標(biāo)記，酶標(biāo)記，磁標(biāo)記或熒光染料標(biāo)記的)衍生物，其中標(biāo)記提供了鑒別和/或分類包括標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物的方法。
免疫毒素的細(xì)胞毒性部分可能是細(xì)胞毒性藥物，或細(xì)菌或植物源的酶活性毒素，或這種毒素的酶活性片段(“A”鏈)。較佳是酶活性毒素及其片段，它們的例子是gelonin，白喉A鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素A鏈(來自Pseudomonas aeruginosa)，蓖麻蛋白A鏈，相思豆素A鏈，modeccin A鏈，alpha-sarcin，Aleurites fordii蛋白，dianthin蛋白，Phytoiacca americana蛋白(PAPⅠ，PAPⅡ，及PAP-S)，momordica charantia抑制劑，curtin，巴豆毒素，saponaria officianalis抑制劑，mitogellin，restrictocin，phenomycin，以及enomycin。最佳是gelonin?？捎酶鞣N二重功能蛋白偶聯(lián)劑制得單克隆抗體和這種細(xì)胞毒性部分的結(jié)合物。這些試劑的例子有SPDP，IT，亞氨酸酯的二重功能衍生物，如二甲基adipimidate-HCl，活性酯如二琥珀酰亞胺酰辛二酸酯，醛如戊二醛，二-疊氮基化合物如二(p-azidopenzoyl)己二胺，二-重疊化衍生物如二(對二氨基苯甲酰基)乙二胺，雙異氰酸酯如2，6-雙異氰酸芐撐酯，及二-活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。
當(dāng)用來殺死產(chǎn)生鼠IgM抗體的體外雜交瘤時，加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中的結(jié)合物典型是以至少約10nm的濃度。體外使用的制劑和給藥形式是不嚴(yán)格的。通常使用與培養(yǎng)物或擴(kuò)散培養(yǎng)基相適的含水制劑。通過常規(guī)技術(shù)可以讀出細(xì)胞毒性，以測定產(chǎn)IgG雜交瘤細(xì)胞的存在或其程度。
當(dāng)體內(nèi)應(yīng)用以壓制產(chǎn)IgM細(xì)胞時，免疫毒素以治療有效量給予免疫動物(即消除或減少產(chǎn)IgM脾細(xì)胞的量)。通常它們是非腸道地，較佳是靜脈內(nèi)給藥。劑量及劑量制度依賴于要壓制的產(chǎn)IgM細(xì)胞的特性，特定免疫毒素的特征，如它的治療指數(shù)，以及作用的起始。給予的免疫毒素量典型地在約0.1到約10毫升/千克體重的范圍之內(nèi)。
非腸道給藥時，免疫毒素將與藥學(xué)上可接受的非腸道賦形劑一起制成單位劑量可注射型(溶液，懸浮液，乳狀液)。這些賦形劑生來是非毒性的，且是非治療性的。這些賦形劑的例子是水，鹽水，林格溶液，葡萄糖溶液，以及5%人血清白蛋白，也可用非水質(zhì)賦形劑如固化油及油酸乙酯。脂質(zhì)體可被用作載體。賦形劑可含少量的添加劑如能增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，如緩沖液和保存劑。免疫毒素在這種賦形體中典型地被制成約1毫克/毫升到10毫克/毫升的濃度。
用于消除產(chǎn)IgM雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性放射性藥物可以通過使高線性能量轉(zhuǎn)移(LET)放射同位素(如Y，Pt)與抗體結(jié)合而制備。其中所用術(shù)語“細(xì)胞毒性部分”意思包括這種同位素。
用于制備抗體標(biāo)記譯本的標(biāo)記包括可直接檢測的部分，如熒光染料和放射性標(biāo)記，以及必須反應(yīng)或衍生才可被檢測的部分，如酶。這些標(biāo)記的例子是32P，125I，3H，14C，熒光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，7-羥基香豆素，熒光素，2，3-二氫二氮雜萘二酮，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，溶菌酶以及葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶?？贵w可通過已知方法與這些標(biāo)記連接。例如，偶聯(lián)劑如醛，碳化二亞胺，二馬來酰亞胺，imidate，琥珀酰亞胺，二-重氮化benzadine及其類似物可被用來使抗體同上述描述過的熒光的，化學(xué)發(fā)光的及酶標(biāo)記相連結(jié)?？贵w也可用磁珠標(biāo)記以用于磁分類方法中。
抗體和標(biāo)記抗體可在各種細(xì)胞分類方法中運用，以使產(chǎn)IgM雜交瘤細(xì)胞與產(chǎn)IgG雜交瘤細(xì)胞分離，或者從含這些細(xì)胞的培養(yǎng)物中消除產(chǎn)IgM雜交瘤細(xì)胞。
常用的分析技術(shù)包括直接和間接分析。直接分析包括使雜交瘤或未知異型抗體與本發(fā)明的標(biāo)記抗體孵育。如果樣品中含有產(chǎn)IgM細(xì)胞，標(biāo)記抗體將與這些細(xì)胞結(jié)合。在洗滌細(xì)胞以去除非結(jié)合不標(biāo)記抗體后，讀樣品以檢測標(biāo)記免疫復(fù)合體的存在。在間接分析中，細(xì)胞樣品與不標(biāo)記單克隆抗體孵育。樣品然后用抗單克隆抗體(如標(biāo)記抗大鼠抗體)的標(biāo)記抗體處理，洗滌并讀數(shù)以測標(biāo)記三元復(fù)合物的存在。
為診斷應(yīng)用或分析以測定IgM異型的存在，抗體典型地被分配在診斷盒形式中。這些試劑盒將典型地包含標(biāo)記或未標(biāo)記型的抗體在合適的容器中，孵育和洗滌試劑，標(biāo)記抗大鼠抗體如果診斷盒是用于間接分析，以及依賴于標(biāo)記特性的底物或衍生化試劑。也可包括IgM抗原對照和指導(dǎo)。
以下實施例提供了本發(fā)明代表性單克隆抗體的制備、定性及應(yīng)用的詳盡描述。這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1大鼠抗鼠IgM單克隆抗體的來源和定性從Dr.Joanne Trial，Department of Immunology，M.D.Anderson Cancer Center獲得命名作58.6的大鼠雜交瘤。原來，58.6細(xì)胞系分泌大鼠抗體。細(xì)胞系不穩(wěn)定而且在四次傳代培養(yǎng)后，58.6細(xì)胞停止產(chǎn)生任何抗體。細(xì)胞的一個原先種族然后通過有限稀釋而克隆，以獲得穩(wěn)定且連續(xù)產(chǎn)生IgM抗體的細(xì)胞系。
A)通過有限稀釋的克隆58.6細(xì)胞在Iscove′s，培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3天，在含5%CO2空氣的潮濕大氣環(huán)境中，當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)物達(dá)到50%融合時，離心收獲細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。細(xì)胞在50%新鮮培養(yǎng)基和50%條件培養(yǎng)基(其中58.6細(xì)胞生長7天的培養(yǎng)基)稀釋，然后，約1個孔一個細(xì)胞放入96孔板上。當(dāng)在孔中的單個細(xì)胞長成小群落(約12天)，去除培養(yǎng)基，如實施例2所述分析抗IgM抗體。擴(kuò)增陽性細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)抗體，冷凍細(xì)胞群，進(jìn)一步特異化抗體。當(dāng)進(jìn)一步給細(xì)胞系類型及產(chǎn)生抗體的特異性特征時，合適的細(xì)胞系重克隆并擴(kuò)增以冷凍細(xì)胞原種，注射入樸日斯烷處理裸鼠以產(chǎn)生腹水。
B.冷凍雜交細(xì)胞當(dāng)固定于T75瓶的雜交細(xì)胞達(dá)到70%融合時，離心收集細(xì)胞并將球狀離心物重懸浮于0.9毫升的胎牛血清中。冷凍前瞬間將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冷凍小瓶中，將0.1毫升二甲亞砜加入到每個小瓶中。小瓶儲藏在液氮中。
C)腹水液體的產(chǎn)生約107雜交瘤細(xì)胞在無血清介質(zhì)中洗滌，腹膜內(nèi)注入裸鼠，這些裸鼠在7到14天前被注入0.5毫升樸日斯烷。通常在1到3周內(nèi)形成腹水，用計量針從膜腹腔內(nèi)收集腹水。液體收集入含5毫升PBS與20mM EDTA的試管中。在2000×g離心10分鐘后，收集上清液，使之在疊氮化鈉中成0.1%，分成小的分樣品在4℃貯存或在-20℃冰凍。這種液體提供單克隆抗體的豐富來源(約5-10毫克/毫升)。
實施例2產(chǎn)生大鼠抗鼠IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞的選擇和分析選擇在2周內(nèi)生長密度約500-1000細(xì)胞的雜交瘤群落進(jìn)行進(jìn)一步分析。為測定哪一個雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生與鼠IgM抗體結(jié)合的抗體，根據(jù)Voller等人(ref)的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測這些群落的雜交瘤培養(yǎng)基中大鼠抗鼠IgM的存在。100毫克1毫克/毫升純化鼠IgM或IgG蛋白質(zhì)(Sigma chemical Company，St.Louis，MO.)在包被緩沖液(50mM NaHCO3，pH9.8)中稀釋，通過在潮濕室中4℃孵育，在96孔微滴定板上吸收過夜。同含0.2%Tween-20的磷酸緩沖液鹽水(PBS-Tween)將孔洗滌三次。洗滌后并且輕輕在紙巾上拍打去除孔中所有液體遺跡后，將100微克雜交瘤上清液加入包被IgM的孔中，然后在室溫孵育2小時。板用PBS-Tween再次洗滌，并在室溫與在PBS-Tween中的過氧化酶結(jié)合羊抗-大鼠IgG的100微升11000稀釋液孵育。在如上述對孔再次洗滌后，它們與100微升1mM ABTS(2，2-連氮基-二(3-ethyl-benzthiazoline磺酸)在0.1M檸檬酸鈉緩沖液pH4.2在37℃反應(yīng)20-60分鐘(緩沖液含0.03%過氧化氫)。在MicroElisa Reader上于405nm測量光密度。
為估測由抗-IgM抗體識別的表位是在抗體的重鏈或輕鏈上，測試了9份雜交瘤上清液與IgM-lambda及IgM-Kappa蛋白質(zhì)包被板的結(jié)合。雜交瘤IC2和2G10二個與IgM-Kappa及IgM-lambda包被孔結(jié)合都同樣地好，表明抗IgM抗體的結(jié)合特異性在IgM抗體的重(mu)鏈上。測試的其它7個抗體也同鼠IgM結(jié)合，這由圖1上的結(jié)果表示。如圖1A和1B所見，測試的9個不同雜交瘤和包覆IgM-Kappa或IgM-lambda板中的一種結(jié)合。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析以測量與每個板結(jié)合的大鼠免疫。發(fā)現(xiàn)所有抗體均與IgM-K和IgM-1包被孔結(jié)合。在最高度結(jié)合抗體中，選擇1C2和2G10以進(jìn)一步研究。因為其生長和產(chǎn)抗體的特征，最后選擇了抗體2G10。這給出0.3±0.03(標(biāo)準(zhǔn)誤差)的光密度。用沒有大鼠單克隆抗體的培養(yǎng)基的背景是0.06光密度單位(O.D.)。保存下與抗鼠IgM抗體反應(yīng)超過或等于0.3 O.D.的孔。
在各種條件下通過ELISA測試大鼠單克隆2G10抗體的特異性。為測定2G10對IgM vs IgG的選擇性識別，使100毫微克鼠IgM-lambda蛋白或IgG3-lambda蛋白質(zhì)吸附在微滴定板(100微升)上，與增加濃度的2G10抗體孵育。如圖2所示，當(dāng)抗體劑量在2-1000毫微克范圍內(nèi)，2G10與IgM包被微滴定板結(jié)合程度大于與IgG包被板結(jié)合。在50毫微克及以下的2G10抗體劑量下，在IgG包被板上測不出結(jié)合，而IgM-包被孔上的結(jié)合由2G10識別。
也檢查了在微滴定板上增加免疫球蛋白包被濃度的作用，以及抗體2G10的識別。如圖3所表示，2G10抗體(以在10微升中的100毫微克的劑量加入)孵育在IgG3和IgM包被孔中。在所有的包被濃度下，表示出與IgM包被板選擇性結(jié)合。在10000毫微克IgM或IgG(IgG3-Kappa與IgM-Kappa相比)的包被濃度下，通過ELISA，測到IgM包被板比IgG包被板上的反應(yīng)性大10倍，2G10抗體再次顯示了與IgM的選擇性結(jié)合。
也測試了抗體2G10在間接ELISA分析中選擇性識別IgM的能力。將抗原包被在微滴定板上，與含識別這些抗原的抗體的雜交瘤培養(yǎng)介質(zhì)孵育。在此分析中用了IgM和IgG1抗體亞綱。在抗原包被板與它們互相反應(yīng)抗體孵育后，在孔中加入增加濃度的大鼠2G10抗體，通過ELISA估評2G10的結(jié)合。如圖4所示，2G10敏感地并且選擇性地識別與其對應(yīng)抗原結(jié)合的IgM(閉合圓圈)，但在同樣條件下不能探測IgG(開放圓圈)，雖然IgG1的存在可以容易地用與所有鼠免疫球蛋白亞型有反應(yīng)性的抗體探測。這些結(jié)果表明2G10大鼠單克隆抗體對鼠IgM亞綱免疫球蛋白的選擇性識別。大鼠單克隆抗體也能識別在微微克劑量的IgM抗體，表明它對鼠IgM抗體的高度親和性。
實施例3大鼠抗鼠IgM抗體的鑒定各種亞型(IgM-Kappa和lambda，IgG1，IgG2和IgG3)的鼠免疫球蛋白包被在微滴定板上如實施例2所述，進(jìn)一步鑒定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的大鼠抗鼠IgM抗體的結(jié)合(在實施例2中是陽性的)。用Bio-Tek ELISA板讀數(shù)器，在405nm波長處讀出所有板。吸收值(與對照相比)被用作抗鼠IgM抗體存在的標(biāo)志。
實施例42G10大鼠單克隆抗體的純化和定性選擇定名為2G10的代表性大鼠抗鼠IgM單克隆抗體以進(jìn)一步定性。如實施例3中所顯示，2G10抗體對IgM kappa和lambda是陽性的。通過離心和硫酸銨分級純化抗體。
命名為2G10的代表性雜交瘤細(xì)胞系于1990年4月23日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，(羅克維爾，Md.美國)，保藏號為HB 10436。根據(jù)美國和該發(fā)明申請的其它國家的專利法和法規(guī)，保藏物是可得到的。保藏物的可得到性并不給予許可證來實施本發(fā)明，以破壞已申請的本發(fā)明，及該申請案的任何分案或繼續(xù)申請。
通過緩慢加入等體積90%飽和硫酸銨溶液，制得在硫酸銨液中45%飽和(鹽析)的2G10培養(yǎng)上清液(或來自裸鼠的腹水)。樣品在4℃被攪拌30分鐘，然后在20，000×g離心30分鐘。球狀物在40%飽和硫酸銨溶液中重懸浮，攪拌30分鐘，然后如上所述離心再成球狀物。球狀物在水中重懸浮，并對100體積PBS滲析。溶液的等分部分被用來測定蛋白質(zhì)含量(通過280nm的光密度)，純度(通過SDS-PAGE)，以及結(jié)合特異性(通過ELISA)。所剩的抗體溶液在-20℃冷凍直至需要時。
IgM抗體通過硫酸銨沉淀和凝膠過濾進(jìn)一步純化，過濾在含瓊脂糖，葡聚糖和/或丙烯胺的2.6×40厘米層析樹脂上進(jìn)行，用PBS/0.01%疊氮化鈉于室溫以1毫升/分鐘流速洗脫。
2G10大鼠單克隆抗體的亞綱由烏赫特朗尼氏方法測定(Ouchterlony and Nilsson(1958)in Handbook of Exp.Immun.Weir，ed.，Blackwell Scientific，London，pp 19.1-19.44)，用通過ICN Immunobiologicals(Lisle，IL.)商業(yè)上可得到的免疫擴(kuò)散診斷盒。
抗體2G10亞綱在評估怎樣純化此分子上有重要性。為進(jìn)行亞綱分析，運用烏赫特朗尼氏免疫擴(kuò)散技術(shù)診斷盒。簡要地說，在每個衛(wèi)星孔中，加入抗各種大鼠免疫球蛋白亞型的抗血清。在中央孔中，加入已知標(biāo)準(zhǔn)樣品或未知樣品，并允許它向半固體介質(zhì)擴(kuò)散。在特定抗血清位點的沉淀線表示了亞型。如圖6所示，含所有大鼠亞型抗體的陽性對照樣品表示出在所有亞型孔的反應(yīng)性。另一方面，2G10抗體僅與IgG2a亞型抗血清反應(yīng)，這表明大鼠抗體2G10是IgG2a抗體。
為評估商業(yè)上可得到的大鼠抗體與鼠IgM的結(jié)合，評估了大鼠單克隆抗體LO-MM-9(來自Serotec，cat＃MCA 199)抗鼠IgM的ELISA反應(yīng)性。在96孔板的各個孔中加入100ngmu-k，gamma-k，或gamma-l。然后加入各種量的LO-MM-9大鼠抗體，如先前所述進(jìn)行大鼠抗體的ELISA分析。如表1所示，該大鼠抗體與鼠IgM包被孔無結(jié)合。
表1商業(yè)上可得的大鼠抗體抗鼠IgM的評估鼠Ig的ELISA反應(yīng)性濃度 Mu-k gamma-k gamma-l1000ng 0.058 0.008 0.037500ng 0.034 0.004 0.031100ng 0.032 0.001 0.02150ng 0.030 0.001 0.02010ng 0.021 0.001 0.0025ng 0.018 0.001 0.0241ng 0.009 0.001 0.0200.1ng 0.020 0.001 0.023因此，認(rèn)為該抗體對進(jìn)一步研究是沒用的。另外，如圖6欄3所示，如SDS-PAGE測定，該抗體制劑含至少三個主要蛋白帶，以及至少5個少數(shù)蛋白帶。
實施例5大鼠抗鼠IgM與產(chǎn)生IgM細(xì)胞的結(jié)合為證明2G10大鼠抗鼠IgM抗體不僅同包被96孔板的純化IgM抗體結(jié)合，而且也同產(chǎn)生IgM抗體的細(xì)胞結(jié)合，在依次分泌IgG和IgM的10C1細(xì)胞和鼠238-57ADR雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。簡要地說，1×106細(xì)胞在500×g離心3分鐘，用PBS洗滌三次，然后在3毫升PBS中再懸浮。
熒光素結(jié)合親化純化F(ab)2片段山羊抗鼠免疫球蛋白IgM(Cappel)在PBS(1x)中以1∶100稀釋，在20微升細(xì)胞懸浮液中加入20-40微升。在黑暗中于室溫孵育15-20分鐘后，細(xì)胞用PBS洗滌二次，在500rpm離心3分鐘。
加入300微升多聚甲醛(1%在PBS中)的等分部分以固定細(xì)胞。細(xì)胞在4℃孵育直至由流動細(xì)胞讀數(shù)器分類。
間接染色時，雜交瘤細(xì)胞首先同大鼠抗鼠IgM抗體2G10孵育，洗滌，然后用熒光素F(ab)2片段山羊抗鼠免疫球蛋白IgM染色，由流動細(xì)胞計數(shù)器分類。
如表2和圖7所示，抗體2G10與在分泌IgM的鼠雜交瘤細(xì)胞表面的IgM特異性結(jié)合，而不與IgG分泌細(xì)胞結(jié)合。
表2IgM和IgG表達(dá)鼠雜交瘤細(xì)胞的FACS分析熒光素標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)IgG IgM處理 雜合體 雜合體0 0.87 0.37不相關(guān)大鼠IgG+FITC山羊抗大鼠 0.23 0.962G10大鼠抗鼠IgMAbY+FITC山羊抗大鼠 1.58 89.99如表2所示，無未處理細(xì)胞的背景熒光素。不相關(guān)大鼠IgG也不與IgG雜合體或IgG雜合體結(jié)合。2G10抗體與產(chǎn)生IgG雜交瘤細(xì)胞不結(jié)合(1.58%細(xì)胞陽性，圖7A和表2)。但是，如圖7B和表2中所示，90%產(chǎn)生鼠IgM抗體的細(xì)胞表現(xiàn)出與2G10抗體強烈結(jié)合。因此，由于識別在細(xì)胞表面的鼠IgM，產(chǎn)生了抗體2G10與細(xì)胞的結(jié)合。
受欣賞的是所檢查的抗體的性質(zhì)有效地是相應(yīng)雜交瘤的唯一相關(guān)特征，即出于本發(fā)明的目的，雜交瘤由它們產(chǎn)生具有上述性質(zhì)的特定抗體的能力來定性。
細(xì)胞毒性評估所述抗體與用如由Carlsson，J.，等人所述SPDP(Biochem J(1978)173723-737)處理的蓖麻蛋白毒素A鏈(RTA)結(jié)合，或與用亞氨基硫醇烷(IT)處理的結(jié)合。
實施例62G10與Gelonin偶聯(lián)制備在干燥DMF中的SPDP試劑(N-琥珀酰亞胺酰3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(6毫克/毫升)的原液。在裝有含1毫克2G10抗體的1毫升PBS溶液的12×75mm玻璃試管中，慢慢加入過量五倍摩爾量的SPDP(約10微升原液)。混合物在30分鐘內(nèi)于室溫每5分鐘使之成旋渦狀。
過量未反應(yīng)SPDP通過凝膠過濾在Sephadex G-25柱(1×24cm)上柱層析而從樣品中去除，該柱用含0.5mM EDTA的100mM磷酸鈉緩沖液pH7.0預(yù)平衡。收集各餾份(0.5毫升)，用Bradford染色結(jié)合分析來分析蛋白成分(Bradford，(1976)Anal.Biochem.72248-254)。用Bio-TEK Microplate自動讀數(shù)器監(jiān)測96孔板的吸收值(600nm)?？贵w在空體積處洗脫(餾份14-20)，收集這些組分并保持在4℃。
從gelonium multiflorum的種子中提取gelonin毒素，用Stirpe等人的方法純化到均勻(Stirpe et al.，J.Biol Chem.2556947-6953(1980))，在三乙胺氯氫化物(TEA/HCl)中加入1毫克純化了的gelonin(2毫克/毫升在PBS中)，至最終濃度為60mM TEA/HCl，調(diào)節(jié)pH到8.0。使溶液成1mM EDTA。加入2-亞氨基硫醇烷原液(0.5M在0.5M TEA/HCl中，pH8.0)至最終濃度為1mM，樣品于4℃在氮氣下孵育90分鐘。
過量2-亞氨基硫烷醇試劑通過在Sephadex G-25柱(1×24cm)上凝膠過濾去除，該柱用含50mM HCl和1mM EDTA的5mM二-三乙酸鹽緩沖液(pH5.8)預(yù)平衡。收集各餾份(0.5毫升)，在96孔微滴定板上用Bradford染色結(jié)合測試分析蛋白成分。Gelonin在餾份14-20洗脫，收集這些餾份，在4℃保藏。SPDP修飾抗體2G10與多5倍摩爾量的2-亞氨基硫醇烷修飾的gelonin混合。通過加入0.05M TEA/HCl緩沖液(pH8.0)調(diào)節(jié)混合物的PH至7，混合物于4℃在氮氣下孵育20小時。加入碘乙酰胺(0.1M在PBS中)至最終濃度為2mM以阻斷任何剩余的自由巰基，孵育在25℃繼續(xù)進(jìn)行1小時。
純化2G10 Gelonin復(fù)合物為去除低分子量的產(chǎn)物及非結(jié)合gelonin，將反應(yīng)混合物上樣在用PBS預(yù)平衡的sephadex S-300柱上。收集各餾份(1.0毫升)，用Bio-Rad染色結(jié)合測試分析50微升等分樣品中的蛋白組分。為去除未結(jié)合2G10，來自S-300柱的高分子量峰(餾份17-23)上樣在Blue Sepharose CL-6B(1×24cm)的親和層析柱上，該柱用含0.1MNaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)預(yù)平衡。在上樣后，用30毫升緩沖液洗滌柱，直至完全洗脫非結(jié)合抗體。柱用具有從0.1到2MNaCl的線性鹽梯度的10mM磷酸緩沖液pH7.2洗脫。通過先前所述的染料結(jié)合分析測定洗脫餾份中的蛋白質(zhì)組分。
含自由2G10抗體，2G10 gelonin和自由gelonin的偶聯(lián)混合物先在S-300柱上通過膠過濾純化。如圖8所示，檢測到一個高分子量峰(餾分25-42)，也檢測到一個較低分子量峰(餾份55-67)。收集餾份26-42以分析結(jié)合物純度和反應(yīng)性。
對純化的2G10 gelonin結(jié)合物進(jìn)行PAGE分析。在圖9中可見，2G10 gelonin偶聯(lián)混合物(欄3)含自由2G10，自由gelonin(箭頭)，2G10與1個gelonin分子偶聯(lián)(單體箭頭)，以及2G10與2個gelonin分子偶聯(lián)(二體箭頭)。如欄1中可見，最終純化的2G10 gelonin結(jié)合物大部分是2G10與1個gelonin分子偶聯(lián)，少量是2G10與2個gelonin分子偶聯(lián)。制劑沒有被自由gelonin或自由抗體污染。
為測定該2G10抗體與gelonin化學(xué)反應(yīng)及偶聯(lián)是否改善了2G10抗體對鼠IgM的識別，96孔板如圖2中所示包被上鼠IgG或IgM抗體。代替2G10抗體，將2G10 gelonin結(jié)合物以各種濃度加入孔中。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析以測定大鼠抗體。如圖10中所示，2G10gelonin結(jié)合物很快地與IgM包被板結(jié)合，只有少部分與IgG包被板結(jié)合。只有在測試的最高濃度(1000毫微克/孔)，2G10 gelonin結(jié)合物才較大程度地與IgG包被孔結(jié)合。相反，在相似的濃度，2G10 gelonin結(jié)合物大量地同IgM包被孔結(jié)合。因此，2G10 gelonin結(jié)合物對IgM的免疫反應(yīng)性被保存下來了。另外，2G10 gelonin結(jié)合物不與鼠IgG交叉反應(yīng)，因此2G10 gelonin結(jié)合物的選擇性也沒被改變。這個數(shù)據(jù)表明2G10 gelonin結(jié)合物應(yīng)該以抗體2G10的同樣方式與IgM包被鼠細(xì)胞結(jié)合。
實施例7生產(chǎn)ODC單克隆抗體A.體外免疫和單克隆抗體的生產(chǎn)現(xiàn)在用的生產(chǎn)鼠單克隆抗體的方案導(dǎo)致生產(chǎn)出分泌IgM亞綱的雜交瘤。為說明鼠單克隆抗體生產(chǎn)方案的典型結(jié)果，用了二個技術(shù)以生產(chǎn)抗大鼠蛋白質(zhì)鳥氨酸脫羧酶(ODC)的單克隆抗體。第一個技術(shù)涉及用ODC蛋白體外免疫鼠脾細(xì)胞，即在培養(yǎng)瓶中。
該技術(shù)使用25微克純化的大鼠肝ODC按Luben方法進(jìn)行(Luben and Mohler，(1980)Molec Immunol，17635-639)。
簡要地說，ODC蛋白質(zhì)與鼠細(xì)胞于37℃在胸腺細(xì)胞條件培養(yǎng)基(一種免疫球蛋白分泌細(xì)胞型的專一性生長因子的來源)存在下孵育72小時。用聚乙二醇作為融合劑使脾細(xì)胞與MPC骨髓瘤細(xì)胞融合。測試所得雜合體細(xì)胞的與ODC蛋白質(zhì)有反應(yīng)性的抗體的分泌。結(jié)果在表3中列出。
表3體外免疫和雜交瘤產(chǎn)生一覽產(chǎn)生一覽 議論所有孔固定 48 二個24孔板，1×106細(xì)胞/孔所有孔有活的雜合體/所 48/48 代表為1∶106的最小融有孔固定 合頻率第一個ELISA表明所有 48/48 在ELISA中，它們中的孔陽性 14個比上述對照介質(zhì)大4倍多對ODC活性沉淀陽性的 12/14 只測試了在ELISA中孔數(shù)/測試孔數(shù) 陽性最大的14個擴(kuò)增所有孔以克隆 12/48 局限于12個最好的克隆從12個原始多克隆孔收 70 最少從多克隆孔中收獲獲的所有單個ELISA陽 1個，最多18個性單克隆所有對ODC活性沉淀陽 50/70 加入的ODC沉淀活性性的單克隆/所有測試的 最多48%，最少4%所有分泌IgM的單克隆/ 70/70所有克隆所有分泌IgG的單克隆/ 0/70所有單克隆在用ODC蛋白起初篩選后，雜交瘤每次克隆和再次測試。獲得70個從幾個標(biāo)準(zhǔn)看與ODC蛋白質(zhì)反應(yīng)的雜交瘤。但是，如表3所示，所有克隆分泌IgM異型抗體，無一分泌IgG抗體。發(fā)現(xiàn)這些抗體在各種單克隆抗體應(yīng)用中具有有限的用途。
B.體內(nèi)免疫和單克隆抗體的生產(chǎn)所用生產(chǎn)單克隆抗體的第二個技術(shù)是通過注射純化的ODC蛋白質(zhì)免疫鼠。免疫后分離鼠脾細(xì)胞，使它們與P3×63Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞融合(如上所述用PEG)。分離克隆，測試其與ODC蛋白的反應(yīng)性，進(jìn)一步定性以用作專一性O(shè)DC識別試劑。測試結(jié)果在表4中顯示。
表4體內(nèi)免疫及種內(nèi)雜交瘤生產(chǎn)一覽生產(chǎn)一覽 議論所有孔固定 1200 96孔板上的許多孔中固定2.5×105細(xì)胞/孔所有孔中有活的雜合體 148 約固定的12%(約1∶107融合頻率)第一次ELISA所有孔陽 30/148 ELISA中，在結(jié)合ODC性 上其中6個比對照顯著高通過有限稀釋克隆的孔 30 所有陽性多克隆擴(kuò)增并且克隆從30個原來多克隆孔中 27 三個多克隆孔沒有產(chǎn)生獲得的所有個體ELISA 陽性單克隆陽性單克隆所有分泌IgM的單克隆/ 27/27 沒有評論測試數(shù)所有分泌IgG的單克隆/ 0/27測試數(shù)所有沉淀ODC活性的單 1/5 只有一個比對照介質(zhì)沉克隆/測試數(shù) 淀相當(dāng)多量的ODC活性發(fā)展了27個單克隆細(xì)胞系，它們中的100%分泌IgM亞綱抗體。以后再一次發(fā)現(xiàn)這些抗體不適于用作ODC專一性試劑。
實施例8FACS(流動活化細(xì)胞分類)方法在500×g離心分泌IgM雜交瘤細(xì)胞238-57 ADR3分鐘，用PBS洗滌三次，并在3毫升PBS中再懸浮。
熒光素結(jié)合親和純化的F(ab)2片段山羊抗鼠免疫球蛋白(Cap-pel)在PBS(1X)中以1∶100稀釋，將20-40微升加入到20微升細(xì)胞懸浮液中。
在室溫于黑暗中孵育15-20分鐘后，用PBS洗滌細(xì)胞二次，在500rpm離心3分鐘。
加入300微升聚甲醛(1%在PBS中)的等分試劑以固定細(xì)胞。細(xì)胞在40℃孵育直至被流動細(xì)胞計數(shù)器揀出。
間接染色時，雜交瘤細(xì)胞先與大鼠抗鼠IgM抗體2G10一起孵育，洗滌，然后用熒光素F(ab)2片段山羊抗鼠免疫球蛋白IgM染色，并由流動細(xì)胞計數(shù)器揀出。
實施例9磁細(xì)胞分離鼠雜交瘤細(xì)胞238-57ADR在含1%胎牛血清和0.1%慶大霉素的Iscove′s培養(yǎng)基中洗滌三次。細(xì)胞在500×g于室溫離心3分鐘然后計數(shù)。球狀物在0.5毫升培養(yǎng)基中再懸浮，在冰上與純化的濃度約0.425毫克/毫升(約用0.1毫升每106細(xì)胞/毫升)的大鼠抗-鼠IgM抗體(2G10)孵育60分鐘。在冷Iscove′s培養(yǎng)基中洗滌二次后，細(xì)胞在0.2毫升培養(yǎng)基中再懸浮并計數(shù)。磁珠在無血清培養(yǎng)基中用磁板洗滌三次。細(xì)胞球狀物與珠球狀物以20珠/細(xì)胞的比率混合。總體積不應(yīng)超過0.4毫升。細(xì)胞/珠混合物在冰上孵育0.5小時，每10分鐘震搖一次。
細(xì)胞/珠混合物在至少2毫升培養(yǎng)基中再懸浮，磁性地垂直于重力分離。一旦分離完成，不攪動磁性球狀物而去除上清液。珠在1-2毫升培養(yǎng)基中再懸浮，并在顯微鏡下觀察。
現(xiàn)在已充分描述了本發(fā)明，對本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，很明顯地可以不離開本發(fā)明的精神和范圍作許多修改和修飾。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于它(a)選擇性同IgM抗體結(jié)合；(b)不與IgG1或IgG2抗體結(jié)合；及(c)具有G異型。
2.一種大鼠單克隆抗體，其特征在于它(a)選擇性地同鼠IgM抗體結(jié)合;(b)不與IgG1或IgG2抗體結(jié)合;和(c)具G異型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于它與產(chǎn)生抗IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于它與產(chǎn)抗-鼠IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中的任一個所述的單克隆抗體，其特征在于它由下列雜交瘤中的一個所生產(chǎn)(a)2G10(b)1C2，或一種單克隆抗體，它與上述抗體中的任一個為功能性等同物。
6.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一個所述單克隆抗體的大鼠X大鼠雜交瘤，以及所述雜交瘤的后代。
7.一種雜交瘤，它是(a)HB10436;或其后代。
8.一種免疫毒素，其特征在于它是根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一個的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分的結(jié)合物。
9.一種殺死產(chǎn)生鼠IgM抗體細(xì)胞的方法，包括使所述細(xì)胞與殺死細(xì)胞有效量的免疫毒素接觸，如權(quán)利要求6中所定義。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到3中的任一個所述的單克隆抗體，用可探測標(biāo)記標(biāo)記。
11.一種收集產(chǎn)生IgG異型單克隆抗體的雜交瘤的方法，包括用權(quán)利要求1-3所述的任一個抗體處理雜交細(xì)胞群，使所述免疫復(fù)合細(xì)胞在細(xì)胞分類器中進(jìn)行分類，收集未與所述抗體復(fù)合的細(xì)胞。
12.一種制備免疫毒素的方法，包括使如權(quán)利要求1中的所述的抗體與細(xì)胞毒性部分結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明的一個主要方面涉及大鼠單克隆抗體，它(a)與IgM亞型抗體選擇性結(jié)合；(b)是IgGs；(c)不與IgG1或IgG2亞型結(jié)合。這些抗體中較佳實施例是命名做2G10的那個，以及其功能等同物。
文檔編號C07K16/42GK1057072SQ9110291
公開日1991年12月18日 申請日期1991年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月27日
發(fā)明者米切爾·G·羅森布勒姆, 尼克拉斯·J·多納托 申請人:研究發(fā)展基金會