專利名稱：：一種單克隆抗體,能生產(chǎn)該抗體的細(xì)胞系及該抗體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于對具有分子量約為20,000的人生長激素進(jìn)行測定的單克隆抗體；一種能生產(chǎn)該單克隆抗體的細(xì)胞系和一種借助于該單克隆抗體對具有分子量約為20,000的人生長激素進(jìn)行的靈敏的免疫測定方法。眾所周知，在人體中存在兩種主要的人生長激素(有時(shí)稱為“hGH’)；具有分子量約為22,000(稱為“22khGH”)和約為20,000(稱為“20khGH”)的肽激素。22khGH是一種具有191個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，而20khGH是一種具有176個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。20khGH和22khGH兩者原本都是由一個(gè)單個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)，所以他們的氨基酸序列非常相似，所不同的是20khGH的結(jié)構(gòu)是在22khGH的N-末端缺失了第32位到第46位的15個(gè)氨基酸。眾所周知，一位正常分泌的成年人，早晨的hGH水平低于約5納克/毫升的基礎(chǔ)水平。過去的研究表明人體中存在的22khGH遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于20khGH；具體地說，20khGH能夠達(dá)到總hGHs的5到20％。血液的hGHs水平變化恒定而且大，即，在一天中有明顯變化并在運(yùn)動(dòng)或睡覺時(shí)增高。然而，通過測定從人腦垂體提取的hGHs已經(jīng)得到如上所述的20khGH和22khGH的定量比例。所以，在人體天然分泌動(dòng)力學(xué)中他們之間的定量比例仍然未知并且是否在一個(gè)短時(shí)間內(nèi)變化也是未知的。作為一種藥物，22khGH已經(jīng)市售，并且比20khGH研究更深入。最近報(bào)道了20khGH的生物學(xué)活性；它的生長促進(jìn)活性與22khGH相當(dāng)，在異常葡萄糖耐藥性方面其誘導(dǎo)性更低并且是更不可致糖尿病的(Lewis，U.J.等人，Endocriniol.Japan，34，73-85(1987))。這表明當(dāng)一種人生長激素用作藥物時(shí)，20khGH比22khGH具有更小的不利藥物反應(yīng)的危險(xiǎn)性。所以，作為對具有生長激素缺陷成人的替代療法的一種藥物，20khGH的用途越來越受到關(guān)注(HisaoSeno，IgakuNoAyumi，165，247-251(1993))。然而，在本發(fā)明人最近首先建立制備方法之前還沒有生產(chǎn)大量純凈20khGH的成功例子，所以，還沒有得到足夠量和純化的20khGH用于實(shí)施各種研究。所以20khGH還沒有應(yīng)用于臨床。另外，由于還沒有研制出檢測20khGH的靈敏的免疫測定方法，一個(gè)長時(shí)間內(nèi)還難于決定20khGH和22khGH的活性和分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。過去對20khGH的研究主要處在利用少量從活體提取的20khGH進(jìn)行的分子或細(xì)胞水平上，并且還沒有20khGH的臨床研究。下文將描述hGHs的測定方法?，F(xiàn)有幾種已知的人血液或尿中的hGHs的測定方法可解釋hGHs的生物學(xué)作用(例如，Hashida和Ishikawa等人，Clinica.Chimica.Acta，162，229-235(1987))。對于作為一種藥物開發(fā)hGHs，在臨床試驗(yàn)中測定精確的分泌動(dòng)力學(xué)包括人體中hGHs的一個(gè)基線血液水平是必要的。另外，要求測定方法靈敏而沒有誤差。由于22khGH已經(jīng)應(yīng)用于臨床，存在有能夠測定早晨22khGH的基線血液水平(低于5納克/毫升)的免疫測定方法。例如，對于22khGH，在日本專利待公開No.273496/88(JP-A63-273496)中已經(jīng)公開了利用一種特異于22khGH的抗體的免疫測定方法。該專利說明書敘述了它與20khGH的交叉反應(yīng)性為15％，然而，由于沒有說明用于該方法的標(biāo)準(zhǔn)20khGH的純度水平，上述百分比可能是十分可疑的。另一方面，以前所有的20khGH的免疫測定的例子是在運(yùn)動(dòng)負(fù)荷下的一個(gè)較高的20khGH分泌值(1納克/毫升)測定的。由于沒有足夠的交叉反應(yīng)性和靈敏性任何以前的測定方法只在細(xì)胞水平調(diào)查人20khGH，即，不具有一個(gè)足夠的靈敏度來測定它的基線血液水平。已知的20khGH的免疫測定如下。有一種測定方法，其中一個(gè)20khGH的值是通過從與所有hGHs反應(yīng)的抗體的測定值中減去與22khGH特異性反應(yīng)的一個(gè)抗體的測定值得到的(Eur.J.Appl.Physiol.，62，130-134(1991))。作者假定除了22khGH以外，hGHs將含有20khGH。近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了hGH的幾種變體，它們類似于20khGH，作為總hGHs與一種抗體反應(yīng)，因此，作者可能把變異體當(dāng)作20khGH進(jìn)行測定，所以20khGH的測定值肯定是十分不精確的。MarioMellado等人已經(jīng)公開了一種特異于20khGH的單克隆抗體(臨床內(nèi)分泌學(xué)和代謝雜志，81，1613-1618(1996))，他們描述了與22khGH的交叉反應(yīng)性低于1％，沒有給出一個(gè)在人體液中確定20khGH的具體例子。正如后面討論的，利用這篇文章的單克隆抗體在理論上闡明20khGH在人體中的分泌動(dòng)力學(xué)是不可能的。所以，還沒有靈敏的免疫測定方法，能夠測定20khGH的分泌動(dòng)力學(xué)。測定20khGH的分泌動(dòng)力學(xué)意味著在一個(gè)相當(dāng)?shù)偷慕咏幕€血液水平上能夠精確測定20khGH。對于22khGH的免疫測定，在接近它的基線血液水平的相當(dāng)?shù)退缴线M(jìn)行精確測定的情況是相似的。然而，對于20khGH，存在交叉反應(yīng)性和靈敏性的內(nèi)在問題，但對于22khGH卻沒有。所以，與22khGH的免疫測定不同，提供一個(gè)20khGH的靈敏的免疫測定是困難的。交叉反應(yīng)性是當(dāng)與一種抗體反應(yīng)的表位也與另一個(gè)抗體反應(yīng)時(shí)觀察到的現(xiàn)象。在22khGH的免疫測定中應(yīng)該考慮到交叉反應(yīng)性。然而，由于下面的原因，它不是顯著的問題首先，血液中含有的22khGH比20khGH高許多(5到20倍)。其次，正如上面所述，22khGH有一個(gè)含有15個(gè)氨基酸的獨(dú)特序列。所以，如果可以制備一種能夠識(shí)別該獨(dú)特序列作為表位的單克隆抗體，那么可以容易地制備一種可以與22khGH特異地反應(yīng)并且是足夠靈敏的單克隆抗體。在另一方面，對于20khGH的免疫測定，由于下面的原因，解決交叉反應(yīng)性和靈敏性的問題是困難的。首先，在血液中，20khGH比22khGH少得多(1/5到1/20)。這顯然意味著一個(gè)20khGH的靈敏的免疫測定需要具有比22khGH的一個(gè)靈敏的免疫測定高10倍的靈敏性。進(jìn)一步，與22khGH的交叉反應(yīng)性顯著影響測定的精確度。其次，20khGH與22khGH的不同在于它不具有一個(gè)獨(dú)特的氨基酸序列。無論如何，在22khGH的15個(gè)氨基酸缺失的末端之間的連接片段，即，在N-末端的第31位苯丙氨酸和第32位天冬酰胺(22khGH的N-末端第47位氨基酸)相互鄰接的序列，可以認(rèn)為是20khGH的一個(gè)獨(dú)特氨基酸序列。Lewis等人已經(jīng)用一種與清蛋白偶聯(lián)的含有一個(gè)該氨基酸序列的鄰近區(qū)域(一個(gè)20khGH的N-末端的第28到第38位的氨基酸序列)的多肽免疫接種一種動(dòng)物并試圖制備一種識(shí)別該多肽為一個(gè)表位的單克隆抗體，但是沒有成功(LewisU.J.etal，EndocrinolJapan，Vol.34，pp.73-85(1987))。第三，為了制備與22khGH較少交叉反應(yīng)但是足夠靈敏的一種單克隆抗體，分離大量生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞然后從中篩選生產(chǎn)所需要的單克隆抗體的細(xì)胞是必要的。此外，在這種情況下，應(yīng)該充分地免疫接種用于制備生產(chǎn)抗體的細(xì)胞的動(dòng)物，這需要大量純20khGH。目前，還不能通過商業(yè)途徑獲得20khGH并幾乎沒有制備的方法。在這樣一種情況下，得到適于免疫接種動(dòng)物的量的20khGH是困難的。在本發(fā)明之前，用20khGH適當(dāng)免疫接種一種動(dòng)物制備生產(chǎn)抗體的細(xì)胞是困難的。因而，得到生產(chǎn)所需要單克隆抗體的細(xì)胞是十分困難的。所以，與一種特異于22khGH的單克隆抗體不同，得到一種特異于20khGH的單克隆抗體是困難的，所以利用單克隆抗體建立20khGH的靈敏免疫測定方法是困難的。下面將基于上面Mellado等人描述的方法來敘述在20khGH的靈敏免疫測定中的交叉反應(yīng)性和靈敏性的問題。Mellado等人描述與20khGH反應(yīng)的單克隆抗體具有低于1％的與22khGH的交叉反應(yīng)性。如果利用一種具有1％的交叉反應(yīng)性的單克隆抗體對一個(gè)含有5納克/毫升的22khGH和250pg/毫升的20khGH的樣品進(jìn)行免疫測定，測量值將是5000pg/毫升×0.01+250pg/毫升＝300pg/毫升，與真正值相比誤差為20％，這表明確定一個(gè)基線血液水平是不可行的。另外，Mellado等人描述免疫測定的測量靈敏度為4納克/毫升。由于一個(gè)正常成年人血液中20khGH的一個(gè)最高水平約為1納克/毫升，所以Mellado等人描述的免疫測定不能測定20khGH的基線血液水平。換句話說，該方法不能解釋人血液中20khGH的分泌動(dòng)力學(xué)。正如上述所述，Mellado等人還沒有解決上面在20khGH的免疫測定中的交叉反應(yīng)性和靈敏性問題。所以，Mellado等人敘述的單克隆抗體及其免疫測定不能用于作為藥物開發(fā)20khGH的臨床研究。為了解決這些問題，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)提供20khGH的一種靈敏的免疫測定方法，它可用于研制作為藥物的20khGH，能確定20khGH的基線血液水平，并能使我們解釋20khGH的分泌動(dòng)力學(xué)。所以，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體和它的制備方法；一種能夠生產(chǎn)該抗體的細(xì)胞系；和一種利用該抗體能精確和直接定量人血液中20khGH的20khGH的免疫測定方法。本發(fā)明人已經(jīng)計(jì)劃制備所需要的單克隆抗體，進(jìn)行下面的改進(jìn)以解決上面問題。首先，制備了大量的純20khGH，并給一種動(dòng)物重復(fù)地給藥以便充分地免疫接種。其次，作為篩選程序，我們用一個(gè)液體系統(tǒng)中的“夾心”免疫測定代替先前在一個(gè)固體系統(tǒng)中的免疫測定。由于這些改進(jìn)，我們已經(jīng)成功地制備了一種與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體，進(jìn)一步，我們已經(jīng)建立了一種能夠利用該單克隆抗體在一個(gè)接近它的基線血液水平的水平上特異確定20khGH的靈敏測定方法以完成本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體；一種生產(chǎn)該單克隆抗體的細(xì)胞系；和利用該單克隆抗體進(jìn)行的20khGH的免疫測定。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明還提供了一種與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體，和制備該單克隆抗體的方法。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行的免疫測定。本發(fā)明的單克隆抗體與現(xiàn)有技術(shù)中的那些相比，與22khGH的交叉反應(yīng)性顯著降低并且與20khGH有高親和性。所以，由于能夠進(jìn)行曾經(jīng)是不可行的20khGH的基線血液水平的測定，利用本發(fā)明的單克隆抗體的免疫測定可能是解釋20khGH的分泌動(dòng)力學(xué)的有效途徑。由于20khGH將用作象治療生長損傷的一種藥物，所以本發(fā)明的免疫測定可用于開發(fā)20khGH作為藥物。圖1顯示在一個(gè)“夾心”免疫測定中20khGH和22khGH與MTC6A單克隆抗體的反應(yīng)性。下面將對本發(fā)明作詳細(xì)描述。與本發(fā)明的單克隆抗體反應(yīng)的激素20khGH，是一個(gè)含有176個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，它們包括那些起源于人腦垂體和人血液的；和通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的那些。有兩種類型的已知20khGH，其中N-末端的第14位氨基酸是絲氨酸或蛋氨酸，并且兩者都可以用于本發(fā)明。與本發(fā)明的單克隆抗體不反應(yīng)的激素22khGH，是一種含有191個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，它們包括那些起源于人腦垂體和人血液的；和通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的那些。本發(fā)明的單克隆抗體與20khGH特異反應(yīng)，但與22khGH基本上不反應(yīng)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，一種與20khGH特異反應(yīng)但與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體具有與22khGH的特別低的交叉反應(yīng)性并且在測定20khGH時(shí)它與22khGH的反應(yīng)性產(chǎn)生的誤差可忽略，即在后面說明的一個(gè)“夾心”免疫測定中它的交叉反應(yīng)性低于0.1％，優(yōu)選地低于0.03％。本發(fā)明的單克隆抗體的球蛋白類型不受限制，只要與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)，例如，IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。從生產(chǎn)該抗體的一個(gè)細(xì)胞系可以制備本發(fā)明的單克隆抗體。生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的細(xì)胞系不受限制，只要它能生產(chǎn)一種與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體，并且例如，可以通過將產(chǎn)生抗-20khGH抗體的一種細(xì)胞與一種骨髓瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合得到的雜交瘤來獲得該細(xì)胞系。這樣一個(gè)雜交瘤包括MTC6A菌株(FERMBP-5913)。具體地說，生產(chǎn)與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，可以由下面的細(xì)胞融合技術(shù)制備。可以用于制備本發(fā)明的細(xì)胞株的方法的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞包括脾細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞?？赡苡玫降目乖◤哪X垂體提取或由基因重組技術(shù)生產(chǎn)的20khGH。被免疫接種的動(dòng)物可以是一種象小鼠和大鼠的哺乳動(dòng)物?？梢杂贸Ｒ?guī)方法用抗原給動(dòng)物給藥。例如，用一種象完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑與用20khGH作為抗原制備一種懸浮液或乳劑并且給動(dòng)物施用幾次，例如，通過靜脈注射，皮下注射，皮內(nèi)注射，或腹膜注射進(jìn)行免疫接種。從免疫接種的動(dòng)物中取出象脾細(xì)胞的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，然后根據(jù)已知方法(G.Kohler等人，自然學(xué)，256，495(1975))將它與骨髓瘤細(xì)胞融合以提供本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞。對于小鼠，可以用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞株包括P3X63Ag8，P3U1和Sp2/0菌株。如聚乙二醇和Sendai病毒的融合催速劑可以用于細(xì)胞融合，如常規(guī)方法可將次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基用于細(xì)胞融合后的雜交瘤的篩選。用例如，限制稀釋方法，將細(xì)胞融合制備的雜交瘤克隆，然后通過用20khGH和22khGH的免疫測定(即，JenotropineTM(SumitomoPharm.))進(jìn)行篩選以提供生產(chǎn)與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體的細(xì)胞系。通過(1)把與人生長激素特異反應(yīng)的抗體(稱為“抗-hGH抗體”)與一個(gè)不溶載體偶聯(lián)形成一個(gè)hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體，(2)把hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體與20khGH反應(yīng)形成一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH偶聯(lián)產(chǎn)物，(3)把該偶聯(lián)產(chǎn)物與上面雜交瘤的培養(yǎng)基中的單克隆抗體反應(yīng)形成一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH-20khGH單克隆抗體的復(fù)合物，(4)把該復(fù)合物與一個(gè)酶標(biāo)記的抗體偶聯(lián)形成一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH-20khGH單克隆抗體-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，和(5)利用上面具有酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物確定標(biāo)記該抗體的酶的活性以篩選雜交瘤細(xì)胞，從而完成本發(fā)明的細(xì)胞株的篩選。下面將詳細(xì)敘述利用免疫測定的篩選。第一步，把一個(gè)抗-hGH抗體偶聯(lián)到一個(gè)不溶載體上形成抗-hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體。不溶載體可以包括微滴板，塑料珠，玻璃珠和磁性微顆粒。抗-hGH抗體與20khGH和22khGH都反應(yīng)，可以是單克隆或多克隆的。通過親和層析純化的抗-hGH兔多克隆抗體是優(yōu)選的，具體地說是F(ab’)2片段或Fab’片段以減少非特異吸附。通過已知的化學(xué)偶聯(lián)方法可以把抗體與這些不溶載體偶聯(lián)，但可以通過物理吸附適當(dāng)?shù)嘏悸?lián)。具體地說，把抗-hGH抗體溶解于碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液中，在溶液中加入上面的不溶載體，在0℃到室溫保留混合物至少一小時(shí)，然后用如Tris-Hcl緩沖液或含有吐溫20(聚氧化乙烯-三梨醇-單月桂酸酯)和疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液洗滌該混合物以除去未偶聯(lián)的抗體。第二步，把第一步中制備的抗-hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體與適當(dāng)量的20khGH反應(yīng)，形成一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH偶聯(lián)產(chǎn)物，其中20khGH與抗體偶聯(lián)不溶載體特異偶聯(lián)。第三步，根據(jù)上面的方法在上面第二步中制備的偶聯(lián)產(chǎn)物中加入雜交瘤的培養(yǎng)基以便和培養(yǎng)基中的單克隆抗體反應(yīng)，從而在抗-hGH-抗體偶聯(lián)不溶載體上產(chǎn)生一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH-抗-20khGH單克隆抗體的夾心復(fù)合物。第四步，把上面第三步中制備的夾心復(fù)合物與抗免疫接種的動(dòng)物的抗體的一種酶標(biāo)記抗體(稱為“酶標(biāo)記抗體”)反應(yīng)，確定夾心復(fù)合物中抗-20khGH單克隆抗體的量。用于免疫測定的抗免疫接種的動(dòng)物的抗體的一種抗體可以是單克隆或多克隆的，特別是一種由親和層析純化的多克隆抗體。標(biāo)記酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，葡葡糖氧化酶和β-半乳糖苷酶?？梢杂萌魏我阎姆椒?，用這些酶的任何一種對抗免疫接種的動(dòng)物的抗體的抗體進(jìn)行標(biāo)記，例如用高碘酸氧化酶的糖鏈形成一個(gè)醛基基團(tuán)，然后，例如把抗-hGH抗體的一個(gè)氨基酸與之偶聯(lián)；在酶中引入一個(gè)適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)如順丁烯二酰亞胺基團(tuán)和硫化吡啶基團(tuán)并把引入基團(tuán)與抗-hGH抗體的Fab’片段中的巰基基團(tuán)偶聯(lián)。第五步，定量測定第四步中制備的夾心復(fù)合物的酶活性，其中該復(fù)合物結(jié)合了酶標(biāo)記抗體。酶活性依賴于雜交瘤的培養(yǎng)基中與20khGH反應(yīng)的單克隆抗體的量?？梢酝ㄟ^加入一種如酶底物的物質(zhì)來確定活性。當(dāng)然，上述免疫測定的篩選可以是下面程序；把抗免疫接種的動(dòng)物抗體的抗體與不溶載體偶聯(lián)形成偶聯(lián)于抗免疫接種的動(dòng)物抗體的抗體上的不溶載體，把偶聯(lián)產(chǎn)物與雜交瘤的培養(yǎng)基中的單克隆抗體反應(yīng)，然后與適當(dāng)量的20khGH反應(yīng)，并利用免疫測定檢測已經(jīng)與雜交瘤培養(yǎng)基中的單克隆抗體反應(yīng)的20khGH以選擇出產(chǎn)生與20khGH強(qiáng)烈反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞，由于具有利用上面免疫測定的篩選過程相當(dāng)?shù)男Ч?，這也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。通過用常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)或腹水形成技術(shù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞并從得到的培養(yǎng)上清液或腹水中純化單克隆抗體，從而用由此得到的雜交瘤細(xì)胞制備本發(fā)明所需要的單克隆抗體。可采用常規(guī)的方法從培養(yǎng)上清液或腹水中純化單克隆抗體；例如，硫酸銨分級分離，凝膠過濾，離子交換層析，親和層析或任何合適的以上方法的組合。利用一種單克隆抗體進(jìn)行的本發(fā)明的20khGH的免疫測定方法利用了該單克隆抗體；例如，酶免疫測定，放射免疫測定，熒光免疫測定和發(fā)光免疫測定，優(yōu)選的是酶免度測定。優(yōu)選的酶免疫測定就是所謂的“夾心”免疫測定，其中單克隆抗體與一個(gè)不溶載體偶聯(lián)形成一個(gè)單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體，它用于測定方法?；凇皧A心”免疫測定，敘述本發(fā)明的測定過程。在步驟(1)中，本發(fā)明的單克隆抗體與一個(gè)不溶載體偶聯(lián)形成一個(gè)單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體，然后與含有人生長激素的測試溶液反應(yīng)形成一種偶聯(lián)產(chǎn)物，該產(chǎn)物中只有20khGH與單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體偶聯(lián)。不溶載體可以包括微滴板，塑料珠，玻璃珠和磁性微顆粒。通過一個(gè)已知的化學(xué)偶聯(lián)過程可以把單克隆抗體與這些不溶載體偶聯(lián)，但可以用物理吸附適當(dāng)?shù)嘏悸?lián)。具體地說，把本發(fā)明的單克隆抗體溶解于象碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液中，在溶液中加入上面的不溶載體，在0℃到室溫保留混合物至少一小時(shí)，然后用如Tris-Hcl緩沖液與含有吐溫20(聚氧化乙烯-三梨醇-單月桂酸酯)和疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液洗滌該混合物以除去未偶聯(lián)的抗體。然后，把所得到的單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體與含有人生長激素的測試溶液反應(yīng)以便與測試溶液中的20khGH偶聯(lián)。在步驟(2)中，將步驟(1)中制備的偶聯(lián)產(chǎn)物與酶標(biāo)記的抗-hGH抗體(稱為“抗-hGH酶-標(biāo)記抗體”)反應(yīng)，在單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體上形成本發(fā)明的抗-20khGH-單克隆抗體-20khGH-抗-hGH酶標(biāo)記抗體的“夾心”復(fù)合物。用于抗-hGH酶標(biāo)記抗體的抗-hGH抗體可以是僅與20khGH反應(yīng)并識(shí)別不被上面20khGH單克隆抗體識(shí)別的表位的一種抗體，或者是與20khGH和22khGH都反應(yīng)的抗體，同樣可以是單克隆或多克隆的。特別是，一個(gè)優(yōu)選的抗-hGH抗體可以是一個(gè)由親和層析純化的抗-hGH兔多克隆抗體；具體地說，F(xiàn)(ab’)2片段和Fab’片段是符合需要的。標(biāo)記酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。通過已知的方法如用高碘酸氧化酶的糖鏈形成隨后與如抗-hGH抗體的一個(gè)氨基酸偶聯(lián)的醛基，可以用任何這些酶將抗-hGH抗體或該抗體的F(ab’)2片段或Fab’片段進(jìn)行標(biāo)記；在酶中引入一個(gè)適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)象順丁烯二酰亞胺基團(tuán)和硫化吡啶基團(tuán)并把引入的基團(tuán)與抗-hGH抗體的Fab’片段中的巰基基團(tuán)偶聯(lián)。在步驟(3)中，對在步驟(2)中制備的“夾心”復(fù)合物的酶活性進(jìn)行定量測定。由于酶活性依賴于最初已經(jīng)反應(yīng)的20khGH的量，所以只有測試溶液中的20khGH可以被定量測定。通過加入如酶底物的物質(zhì)可以確定酶活性。也可以利用抗-hGH生物素標(biāo)記抗體代替抗-hGH酶標(biāo)記抗體在單克隆抗體偶聯(lián)不溶載體上形成本發(fā)明的抗-20khGH單克隆抗體20khGH-抗-hGH生物素標(biāo)記抗體的“夾心”復(fù)合物，把復(fù)合物與酶標(biāo)記抗生物素蛋白或酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)，形成本發(fā)明的抗-20khGH單克隆抗體-20khGH-抗-hGH生物素標(biāo)記抗體-酶標(biāo)記抗生物素蛋白或酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白的“夾心”復(fù)合物，然后確定“夾心”復(fù)合物中的酶活性來確定其活性。在上面的“夾心”免疫測定中，當(dāng)然可以將本發(fā)明的抗-20khGH單克隆抗體和抗-hGH酶標(biāo)記抗體的順序替換來確定活性。由于這樣的程序具有與上面“夾心”免疫測定相當(dāng)?shù)男Ч?，它可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的免疫測定中，作為測定對照的樣品可以包括人血液，人尿，以及這些已經(jīng)進(jìn)行了如稀釋，純化和pH調(diào)節(jié)的處理。用于研制本發(fā)明的免疫測定的校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)20khGH可以是由基因重組技術(shù)制備的20khGH。上面本發(fā)明的免疫測定可以特異地確定20khGH。本發(fā)明的免疫測定特別靈敏，最大測量靈敏度為0.001納克/毫升。所以，本發(fā)明的免疫測定可以僅在它的人基線血液水平范圍附近直接且精確地定量測定20khGH。實(shí)施例通過下面的實(shí)施例將具體地解釋本發(fā)明，但不以此限制本發(fā)明。實(shí)施例1抗-20khGH單克隆抗體的制備(1)免疫接種用基因重組技術(shù)(JP-A6-269292)制備的純20khGH作為抗原接種Balb/c小鼠(5周齡，雌性)總共免疫五次。在第一次免疫接種中，腹膜內(nèi)注射給藥100微克與完全弗氏佐劑(Difco)混合的20khGH。然后，以兩星期的間歇以50微克與不完全弗氏佐劑(Difco)混合的20khGH給藥三次。在最后的免疫接種中，在第4次免疫接種兩星期后，在尾部靜脈注射50微克的20khGH的生理鹽水溶液，再過三天之后，將免疫接種鼠的脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合。(2)用細(xì)胞融合技術(shù)制備產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞以約5∶1到10∶1的比例將免疫接種脾細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8混合，然后，用50％(w/v)的聚乙二醇溶液(GIBCO，平均分子量4000)作為融合催速劑以常規(guī)技術(shù)融合細(xì)胞。以1×106細(xì)胞/毫升的脾細(xì)胞的水平，在包括含有20％的胎牛血清(GIBCO)和次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)的IMDM培養(yǎng)基中懸浮融合細(xì)胞。把懸浮液的等分試樣(0.1毫升)加入一個(gè)96孔的微滴板(Comi納克)。在一個(gè)CO2溫育箱中(37℃，5％CO2)培養(yǎng)融合細(xì)胞，以3-5天的間歇替換一半培養(yǎng)基。這樣，有選擇地培養(yǎng)了在HAT培養(yǎng)基中增殖的雜交瘤細(xì)胞。(3)篩選通過免疫測定篩選其中觀察到集落的孔，確定在其上清液中是否含有抗20khGH的抗體。在一個(gè)96孔的微滴板(Greiner)中加入溶于0.1M碳酸鹽緩沖液中的抗-hGH兔多克隆抗體(10微克/毫升)的等分試樣(50微升)，然后在4℃保留過夜以待凝固。用洗液(含有0.02％疊氮化鈉和0.05％吐溫20的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0))洗滌平板，然后在平板中加入封閉液1(含有0.5％牛血清白蛋白的PBS)的等分試樣(100微升)進(jìn)行封閉。在除去封閉液1后，在96孔的48個(gè)孔和另外48個(gè)孔中分別加入溶于封閉液1中的20khGH(10納克/毫升)的等分試樣(50微升)和溶于封閉液1中的22khGH(商標(biāo)名Genotropin；SumitomoPharm.)(10納克/毫升)的等分試樣(50微升)，然后在室溫振搖2小時(shí)。在用洗液洗滌平板后，在20khGH孔和22khGH孔中加入上面(2)的觀察到集落的孔的上清液的等分試樣(50微升)，然后在室溫振搖2小時(shí)。在洗滌之后，在孔中加入用封閉液1稀釋500倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-鼠Igs抗體(DAKO)的等分試樣(100微升)，然后在室溫振搖2小時(shí)。在用洗液洗滌之后，在孔中加入一個(gè)底物溶液(含有0.6％對-硝基苯磷酸和0.5mM氯化鎂的9.6％二乙醇銨緩沖液(pH9.6))的等分試樣(50微升)，然后在室溫振搖30分鐘。在反應(yīng)溶液中，加入3N氫氧化鈉的等分試樣(50微升)淬滅反應(yīng)，用免疫讀數(shù)器(NipponIntermed)測定405納米處的吸光值，以便篩選與20khGH比與22khGH反應(yīng)更強(qiáng)烈的集落用于克隆。(4)雜交瘤的克隆通過有限的稀釋將產(chǎn)生與20khGH比與22khGH反應(yīng)更強(qiáng)烈的抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆三次，以便提供一個(gè)雜交瘤MTC6A菌株，它產(chǎn)生與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的抗體。根據(jù)微生物寄存的布達(dá)佩斯條約，MTC6A菌株已經(jīng)于1996年5月30日保藏于1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaragi，日本，國際貿(mào)易和工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)的國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERMBP-5913。(5)確定雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的亞類用一個(gè)確定鼠單克隆抗體同型的測試紙(ISOStrip；Berli納克erMannheim)確定所獲得的雜交瘤MTC6A菌株產(chǎn)生的抗-20khGH單克隆抗體的亞類。MTC6A菌株生產(chǎn)的抗-20khGH單克隆抗體的亞類重鏈為IgG1，輕鏈為k。(6)制備單克隆抗體培養(yǎng)MTC6A菌株并增殖，對一個(gè)2周前已經(jīng)用異十八烷處理的Balb/c小鼠腹膜接種1×107細(xì)胞。10到14天后，從鼠的腹腔中取出腹水。利用蛋白質(zhì)A(BIORAD)，通過親和層析純化收集的腹水得到MTC6A單克隆抗體，即本發(fā)明的20khGH單克隆抗體。參考實(shí)施例1制備抗-hGH兔多克隆抗體和抗-hGH標(biāo)記抗體(1)免疫接種首先，把100微克基因重組(JP-A6-269292)制備的純20khGH與完全弗氏佐劑(Difco)混合并在兔子背部的幾個(gè)點(diǎn)以混合物給藥免疫接種。然后，以同樣的方法，2星期的間隔，總共重復(fù)免疫接種該動(dòng)物5次。(2)純化抗血清對從上面(1)中免疫接種的兔子中得到的兔抗血清進(jìn)行硫酸鈉分級分離(18％飽和度)，并使之通過用17.5mM磷酸緩沖液(pH6.3)平衡過的DEAE-纖維素(DE-52；Whattman)。收集不吸附餾份得到一個(gè)抗-hGH兔多克隆抗體IgG餾份。(3)制備抗-hGH標(biāo)記抗體用0.1M的含有0.1M氯化鈉的檸檬酸緩沖液(pH4.5)將上面(2)中得到的抗-hGH兔多克隆抗體IgG餾份透析，用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH到3.7，在抗-hGH兔多克隆抗體IgG餾份中加入3％胃蛋白酶，在37℃消化3.5小時(shí)。通過用1MTris溶液調(diào)節(jié)pH到7.5-8.0淬滅反應(yīng)。用含有2mM四乙酸乙二銨二鈉和0.1M氯化鈉的0.05M的磷酸緩沖液(pH6.5)平衡過的S-200SF柱(Pharmacia)凝膠過濾混合物，收集對應(yīng)于一個(gè)起始洗脫峰的餾份。在收集餾份中加入1/50量的0.2M的2-巰基乙胺溶液，并在37℃反應(yīng)混合物90分鐘。然后，用含有2mM四乙酸乙二銨二鈉和0.1M的氯化鈉的0.05M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡過的SephadexG-25柱(Pharmacia)凝膠過濾該混合物，收集對應(yīng)于一個(gè)起始洗脫峰的餾份(Fab’餾份)。獨(dú)立地，把5mg辣根起源的過氧化物酶(TOYOBOCo.，Ltd.；稱為“POD”溶解于0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)中。在混合物中加入溶于50微升二甲基甲酰銨中的4.0mgN-琥珀酰亞銨-4-(馬來酰亞銨甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸鹽，并在30℃保留混合物60分鐘。用含有2mM四乙酸乙二銨二鈉和0.1M的氯化鈉的0.05M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡過的SephadexG-25柱(Pharmacia)凝膠過濾混合物，收集對應(yīng)于一個(gè)起始洗脫峰的餾份(偶聯(lián)二硫代吡啶基的POD餾份)。在上面Fab’餾份中加入等摩爾量的偶聯(lián)硫代吡啶基POD餾份，在4℃保留混合物過夜。用含有0.1M氯化鈉的0.1M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡過的S-200SF柱凝膠過濾混合物，收集對應(yīng)于一個(gè)起始洗脫峰的餾份(POD-標(biāo)記的抗-hGHFab’餾份)。把牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑以0.1％的水平處理該餾份，在4℃儲(chǔ)存直到使用。實(shí)施例2MTC6A單克隆抗體的抗原特異性用免疫測定方法評估按照實(shí)施例1得到的MTC6A單克隆抗體的抗原特異性。所用的抗原是基因重組(JP-A6-269292)生產(chǎn)的純化20khGH，和其類似肽激素物，人催乳素(稱為“hPRL”；UCBBIOPRODUCTS)和人纖毛體馬莫調(diào)理素(稱為“hCS”；CHEMICON)。在一個(gè)96孔微滴板(Greiner)上以適當(dāng)?shù)臐舛?0到5000納克/毫升)固化每種抗原，然后與MTC6A單克隆抗體的溶液反應(yīng)以進(jìn)行估計(jì)。結(jié)果是，本發(fā)明的MTC6A單克隆抗體與hPRL或hCS，hGH的類似肽激素不反應(yīng)。結(jié)果概括在表1。表1MTC6A單克隆抗體的抗原特異性</tables>+反應(yīng)-不反應(yīng)實(shí)施例3在“夾心”免疫測定中MTC6A單克隆抗體與20khGH和22khGH的反應(yīng)性對按照實(shí)施例1得到的MTC6A單克隆抗體與20khGH和22khGH的反應(yīng)性進(jìn)行評估。用PBS稀釋MTC6A單克隆抗體到10微克/毫升，在一個(gè)96孔的微滴板(Greiner)中加入該溶液的等分試樣(50微升)，在4℃保留微滴板過夜。用洗液(含有0.05％吐溫20的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0))洗滌平板，并用封閉液2(4倍稀釋的溶于PBS中的BlockAce(Yukijirushi))進(jìn)行封閉。除去封閉液2后，在96孔的48個(gè)孔和另外48個(gè)孔中分別加入溶于封閉液2中的適當(dāng)濃度(0-2納克/毫升)的20khGH的等分試樣(100微升)和溶于封閉液2中的適當(dāng)濃度(0-30納克/毫升)的22khGH(Genotropin；SumitomoPharm.)的等分試樣(100微升)，然后在室溫振搖2小時(shí)。在用上面提到的洗液洗滌平板后，在孔中加入在抗體稀釋劑(在PBS中稀釋10倍的BlockAce(Yukijirushi))中稀釋500倍的參考實(shí)施例1的POD標(biāo)記的抗-hGH抗體Fab’餾份的等分式樣(100微升)，然后在室溫振搖微板2小時(shí)。在洗滌后，在孔中加入底物溶液(含有65微克/毫升四甲基聯(lián)苯胺的0.04％的過氧化氫)的等分試樣(50微升)，在室溫振搖平板30分鐘。在反應(yīng)溶液中，加入1N硫酸的等分試樣(50微升)淬滅反應(yīng)，并用免疫讀數(shù)器(NipponIntermed)測定450納米的吸光值。結(jié)果表示在圖1。MTC6A單克隆抗體與即使在高于普通血液水平的30納克/毫升的22khGH也不反應(yīng)，但與20khGH即使在10pg/毫升時(shí)也進(jìn)行反應(yīng)。所以，估計(jì)它的交叉反應(yīng)性可能是0.03％。實(shí)施例4用MTC6A單克隆抗體確定人血液中20khGH用MTC6A單克隆抗體確定人血液中的20khGH。用PBS稀釋MTC6A單克隆抗體到10微克/毫升，在一個(gè)96孔的微滴板(Greiner)中加入該稀釋液的等分試樣(50微升)，在4℃保留平板過夜。在用洗液(含有0.05％吐溫20的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0))洗滌平板后，用封閉液2(用PBS稀釋4倍的BlockAce(Yukijirushi))進(jìn)行封閉。除去封閉液2后，在平板中加入通過將人血清與封閉液2或含有500或1000pg標(biāo)準(zhǔn)20khGH的封閉液2以9∶1的比例混合制備的一種測試液的等分式樣(100微升)，在室溫振搖平板2小時(shí)。在用洗液洗滌后，在平板中加入用抗體稀釋劑(用PBS稀釋10倍的BlockAce(Yukijirushi)稀釋500倍的參考實(shí)施例1的POD標(biāo)記抗-hGH抗體Fab’部分的稀釋液的等分試樣(100微升)，然后在室溫振搖微滴板2小時(shí)。洗滌之后，在平板中加入底物溶液(含有0.67mg/毫升1，2-苯二銨(DAKO)的0.1％檸檬酸-磷酸緩沖液(pH5.0)的等分式樣(100微升)，在室溫振搖平板30分鐘。在反應(yīng)溶液中，加入1N硫酸的等分試樣(100微升)淬滅反應(yīng)，用免疫讀數(shù)器(NipponIntermed)測定490納米的吸光值，與校正曲線比較確定20khGH的水平。標(biāo)準(zhǔn)曲線已經(jīng)通過利用封閉液2稀釋的標(biāo)準(zhǔn)20khGH代替上面的測試液如上所述進(jìn)行測定得到。表2顯示了測定中校正曲線和變異系數(shù)的值，表3顯示了測試液的測定值和所加的20khGH的回收率。表220khGH的校正曲線</tables>表3加入的20khGH的回收率</tables>權(quán)利要求1.一種單克隆抗體，它與一種具有分子量約為20000的人生長激素(20khGH)特異反應(yīng)，而與一種具有分子量約為22000的人生長激素(22khGH)基本上不反應(yīng)。2.如權(quán)利要求1中所述的單克隆抗體，它具有與22khGH的交叉反應(yīng)性低于0.1％并且更低。3.如權(quán)利要求1或2中所述的一種生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞系。4.如權(quán)利要求3中所述的一種細(xì)胞系，它通過包括下面步驟的方法得到(a)用20khGH免疫接種一種哺乳動(dòng)物；(b)把來自免疫接種的哺乳動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞；(c)用酶免疫測定篩選雜交瘤細(xì)胞；和(d)將通過篩選選定的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆。5.如權(quán)利要求4中所述的細(xì)胞系，其中篩選包括下面步驟(c-1)把一個(gè)與人生長激素反應(yīng)的抗體與一個(gè)不溶載體偶聯(lián)形成抗-hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體；(c-2)把20khGH與抗-hGH-抗體偶聯(lián)的不溶載體偶聯(lián)形成一個(gè)抗-hGH-抗體-20khGH偶聯(lián)產(chǎn)物；(c-3)把上面(c-2)中制備的偶聯(lián)產(chǎn)物與通過培養(yǎng)步驟(b)中得到的雜交瘤細(xì)胞制備的培養(yǎng)基中的20khGH反應(yīng)，形成一個(gè)抗-hGH抗體-20khGH-20khGH單克隆抗體的復(fù)合物；(c-4)把上面(c-3)中得到的復(fù)合物與一個(gè)酶標(biāo)記抗體偶聯(lián)，形成一個(gè)包括抗體-20khGH-20khGH抗體復(fù)合物-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物；和(c-5)利用上面(c-4)中得到的復(fù)合物測定酶活性，從而根據(jù)測定結(jié)果選擇雜交瘤細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5中所述的細(xì)胞系，它是雜交瘤FERMBP-5913。7.生產(chǎn)單克隆抗體的方法，包括步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞系和從所得到的培養(yǎng)物中純化與20khGH特異反應(yīng)而與具有分子量約為22,000的人生長激素(22khGH)基本上不反應(yīng)的單克隆抗體。8.生產(chǎn)單克隆抗體的方法，所述單克隆抗體與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)，該方法通過培養(yǎng)如權(quán)利要求4-6的任何一個(gè)所述的細(xì)胞系和從所得到的培養(yǎng)物中純化該單克隆抗體。9.如權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。10.如權(quán)利要求4-6所述的任何細(xì)胞系生產(chǎn)的單克隆抗體。11.一種檢測20khGH的免疫測定方法，它利用如權(quán)利要求1或2中所述的單克隆抗體進(jìn)行。12.如權(quán)利要求11中所述的免疫測定方法，其中20khGH的免疫測定方法是一個(gè)酶免疫測定。13.如權(quán)利要求12中所述的免疫測定方法，它是包括下面步驟的“夾心”酶免疫測定(a)把一個(gè)含有人生長激素的測試液與一個(gè)單克隆抗體偶聯(lián)不溶載體反應(yīng)，其中與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體與不溶載體偶聯(lián)形成一個(gè)偶聯(lián)產(chǎn)物，其中只有20khGH與單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體特異偶聯(lián)；(b)把上面(a)中得到的偶聯(lián)產(chǎn)物與一個(gè)其中的抗體與人生長激素特異反應(yīng)的抗-hGH酶標(biāo)記抗體反應(yīng)，在單克隆抗體偶聯(lián)的不溶載體上形成一個(gè)抗-20khGH單克隆抗體-20khGH-抗-hGH酶標(biāo)記抗體的“夾心”復(fù)合物；和(c)確定用于標(biāo)記上面步驟(b)中得到的“夾心”復(fù)合物的酶的活性。14.如權(quán)利要求13中所述的免疫測定方法，它測定人血液或人尿或它的處理樣品中的20khGH。全文摘要從用20khGH免疫接種的動(dòng)物中制備了能夠生產(chǎn)特異于具有20,000分子量的人生長激素(20khGH)的抗體的動(dòng)物細(xì)胞。把該動(dòng)物細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合生產(chǎn)與20khGH特異反應(yīng)而與22khGH基本上不反應(yīng)的單克隆抗體。單克隆抗體用于20khGH的免疫測定。文檔編號(hào)G01N33/53GK1180107SQ9711495公開日1998年4月29日申請日期1997年6月18日優(yōu)先權(quán)日1997年6月18日發(fā)明者池田一郎,河野直子,慎野正,橋本吉秀申請人:三井東壓化學(xué)株式會(huì)社