一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株c2及其應用
【專利摘要】一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2及其應用，屬于食品安全檢測技術領域。本發(fā)明通過鉻完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過間接競爭ELISA篩選和三次亞克隆，得到重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2。此細胞株分泌的單克隆抗體可識別重金屬三價鉻離子，特異性好和靈敏度高，可以用于食品安全中重金屬鉻的殘留檢測。本發(fā)明獲得的抗三價鉻離子單克隆抗體細胞株C2，對Cr3+?EDTA有較好的檢測靈敏度和特異性（IC50值為5ng/mL）。該細胞株C2分泌的抗體穩(wěn)定性好：雜交瘤細胞凍存于液氮中至少保存5年，純化的抗體在?20℃冰箱中至少可存放2年；抗體特異性高：其與Fe3+的交叉反應率為1.12%，與其他金屬離子暫未發(fā)現(xiàn)交叉反應。CGMCC No.1202020160120
【專利說明】
一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2及其應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2及其應用，屬于食品安全檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]絡(chromium，Cr)是一種過渡元素，自然界中不存在游離態(tài)的絡，主要以三價和六價鉻鹽的形式存在。三價鉻是人體必需的微量元素，鉻缺乏會增加患心血管疾病的風險，但過量的鉻會損害人體健康。六價鉻的毒性是三價鉻的100倍。六價鉻進入人體后，會引發(fā)氧化應激、染色體畸變、細胞凋亡、多種DNA損傷，從而造成機體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。六價鉻還被認為是一種強致癌物。因此，我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定飲用水鉻離子含量不得超過SOng/mUGB 2762-2012《食品中污染物限量》中規(guī)定糧食食品絡離子含量不超過1000ng/mL，果蔬類不超過500ng/mL，動物性肉蛋不超過1000ng/mL。
[0003]鉻化合物廣泛應用于制革、冶金、紡織品生產(chǎn)以及鍍鉻行業(yè)中，環(huán)境中的鉻污染日趨嚴重，鉻超標事件屢有發(fā)生。重金屬鉻的檢測受到廣泛關注。
[0004]目前常用的鉻檢測方法有電感耦合等離子體質譜法、電化學分析法、石墨爐原子吸收光譜法等儀器檢測方法，檢測耗時長、費用高，難以用于現(xiàn)場檢測。因此建立一種快速簡便的鉻化合物檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高檢測靈敏度和高特異性的單克隆抗體是免疫學檢測的前提。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株對鉻離子具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株C2。
[0006]本發(fā)明的技術方案，一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.12020。
[0007]重金屬鉻單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCCN0.12020的重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2分泌產(chǎn)生。
[0008]所述重金屬鉻單克隆抗體的應用，其可用于食品安全中重金屬鉻的殘留檢測。
[0009]本發(fā)明提供的細胞株C2的制備基本步驟為:
I)完全抗原的合成:取卜(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸1mg溶于ImL二甲基亞砜中形成A液；1mg牛血清蛋白溶于ImL pH9.0的1mM HBS緩沖液中形成B液；取10yL A液逐滴加入B液中，調節(jié)pH9.0，攪拌24h;用超濾管離心，得到1_(4_異硫氰芐基)乙烯基二胺_N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白；取150yL lmg/mL硝酸鉻標液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N ’，N ’ -四乙酸-牛血清蛋白中，調節(jié)pH6?7攪拌5h;用超濾管離心，得到檢測抗原(包被原)鉻-卜(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白。用雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸將鉻離子偶聯(lián)到匙孔血藍蛋白上，制成免疫抗原；
2)小鼠的免疫:三價鉻離子免疫抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。最后一次用完全免疫原(不含佐劑)沖擊免疫;通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；
3)細胞融合與細胞株建立:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株C2;
4)雜交瘤細胞株性質的鑒定:通過ELISA法測定靈敏度和特異性。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗三價鉻離子單克隆抗體雜交瘤細胞株C2，對Cr3+-EDTA有較好的檢測靈敏度和特異性(IC5q值為5yg/L)。該細胞株C2分泌的抗體穩(wěn)定性好:雜交瘤細胞凍存于液氮中至少保存5年，純化的抗體在-20°C冰箱中至少可存放2年;抗體特異性高:其與Fe3+的交叉反應率為1.12%，與其他金屬離子暫未發(fā)現(xiàn)交叉反應。
[0011 ]生物材料樣品保藏:單克隆細胞株C2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.12020，保藏日期2016年I月20日。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0013]本發(fā)明通過用三價鉻離子免疫原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELI SA和間接競爭ELI SA篩選細胞上清，最終得到了對Cr3+-EDTA有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株C2。
[0014]實施例1:雜交瘤細胞株C2的制備
(I)完全抗原的合成:取1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸1mg溶于ImL二甲基亞砜中形成A液；1mg牛血清蛋白溶于ImL pH9.0的1mM HBS緩沖液中形成B液；取10yL A液逐滴加入B液中，調節(jié)pH9.0，攪拌24h;用超濾管離心，得到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺_N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白；取150yL lmg/mL硝酸鉻標液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N ’，N ’ -四乙酸-牛血清蛋白中，調節(jié)pH6?7攪拌5h;用超濾管離心，得到檢測抗原(包被原)鉻-1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白。用雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸將鉻離子偶聯(lián)到匙孔血藍蛋白上，制成免疫抗原。
[0015](2)動物免疫:選擇健康的6?8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取三價鉻離子免疫抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭ELISA方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0016](3)細胞融合:在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG(聚乙二醇，分子量為4000)方法進行細胞融合，具體步驟如下:
a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；
b、收集SP2/0細胞，懸浮于RPM1-1640基礎培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；
C、將脾細胞和SP2/0細胞按照計數(shù)比1:10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間Imin，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50\似1'的1?^1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37°(:、5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0017](4)細胞篩選與細胞株建立:在細胞融合的第3天對融合細胞進行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。
[0018]篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細胞孔，第二步選用Cr3+-EDTA為標準品，用間接競爭ELISA對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對Cr3+-EDTA標準品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，獲得細胞株C2o
[0019](5)單克隆抗體的制備與鑒定:取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL; 7天后每只小鼠腹腔注射I X 16雜交瘤細胞C2，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0020]使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體對Cr3+-EDTA的IC5q分別為:5yg/L，說明對Cr3+-EDTA有很好的靈敏度，可用于三價鉻離子免疫分析檢測。
[0021](6)抗體應用:將雜交瘤細胞株C2通過體內腹水制備的單克隆抗體應用于水中三價鉻離子的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測，具體步驟如下:
6.1包被:將包被原(Cr3+-1TCBE-BSA)用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋為1.0yg/mL，I OOyL/孔加入酶標板，37 °C反應2h ；
6.2洗滌:將板內溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min ；
6.3封閉:拍干后，加入200yL /孔封閉液，37°C反應2h;洗滌后烘干備用；
6.4加樣:加入Cr3+-EDTA和抗體:用含ImM EDTA的ΙΟμΜ HBS緩沖液倍比逐級稀釋Cr3+，每孔加入50yL，再加入稀釋一定倍數(shù)的抗體溶液50yL，37 °C反應0.5h;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠 IgG，10yL /孔，37°C 反應0.5h ；
6.5顯色:將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入10yL的TMB顯色液，37 °C避光反應15min；
6.6終止和測定:每孔加入50yL終止液以終止反應，然后用酶標儀測定各孔的OD45Q值；
6.7結果判讀:以OD45q值大于或等于陰性對照孔的2.1倍(S卩P/N彡2.1)所對應的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELI SA效價，計算抑制率?？贵wI C5o=5ng/ mL。結果表明，制備的抗體能較好的識別Cr3+-EDTA。
[0022](7)溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調pH值至9.6，加雙蒸水定容至I OOOmL，4 °C貯存?zhèn)溆茫?br>磷酸鹽緩沖液(PBS):8.0Og NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4.12 H2O,溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調pH到7.2?7.4，定容至100mL; PBST:含0.05% 吐溫 20的PBS;
HBS 緩沖液:8.0Og NaCl, 0.2g KCl，HEPES(4_ 羥乙基哌嗪乙磺酸)2.386g，溶于 800mL 純水中，用NaOH或HCl調pH到7.2?7.4，定容至100mL;
TMB顯色液:A液:Na2HPO4.12H20 18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至 1000mL;B液:60mgTMB溶于10mL乙二醇中。A、B液按體積比1:5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0023]綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內容所作的等效變化與修飾，都應為本發(fā)明的技術。
【主權項】
1.一株重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.12020。2.重金屬鉻單克隆抗體，其特征在于:它由所述保藏編號為CGMCCN0.12020的重金屬鉻單克隆抗體雜交瘤細胞株C2分泌產(chǎn)生。3.權利要求2所述重金屬鉻單克隆抗體的應用，其特征在于:用于食品安全中重金屬鉻的殘留檢測D
【文檔編號】C12N5/20GK106011077SQ201610480745
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】胥傳來, 鄒淑珍, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強, 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明, 馬偉
【申請人】江南大學