本發(fā)明涉及組織工程及醫(yī)學(xué)再生領(lǐng)域，尤其是小鼠ECM的制備方法及得到不同來(lái)源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內(nèi)再生的方法。

背景技術(shù)：

卵巢疾病是目前困擾女性的一大難題，但目前的治療都會(huì)對(duì)卵巢造成一定的損傷。2008年，心臟移植的成功再生開(kāi)啟了ECM支架的研究熱潮。研究表明生物支架在物種間具有良好的保守性，并能很好的被異種宿主接受，在一定程度上降低了免疫排斥反應(yīng)。此外，天然的三維支架也能夠影響細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞的分化，同時(shí)也含有利于細(xì)胞募集、增殖和分化的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)和重建。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種小鼠ECM的制備方法及得到不同來(lái)源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內(nèi)再生的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種小鼠ECM的制備方法，包括以下步驟：

(1)取出小鼠的不同組織，將其置于不同濃度的洗滌劑中，處理不同的時(shí)間，然后使用滅菌水和PBS清洗洗滌劑，保證ECM中不含有洗滌劑；

(2)對(duì)制備的ECM進(jìn)行組織學(xué)分析和生化分析，優(yōu)選出最好的小鼠ECM。

所述步驟(1)中洗滌劑為SDS和Triton中的一種或兩種組合。

優(yōu)選,所述組織為小鼠卵巢組織。

所述步驟(2)包括對(duì)ECM的組織切片進(jìn)行H&E和DAPI染色，并對(duì)ECM的彈性蛋白、膠原和sGAG三種成分含量的測(cè)定以及殘留DNA量對(duì)比分析。

上述的小鼠ECM的制備方法制得不同來(lái)源的小鼠ECM。

一種小鼠卵巢體內(nèi)再生的方法，將獲得的小鼠ECM，移植回小鼠卵巢原位，不同時(shí)間點(diǎn)取出ECM，觀察其再生情況，并且對(duì)再生卵巢從再生效率、組織學(xué)分析、免疫組織化學(xué)分析、基因表達(dá)情況和生殖能力檢測(cè)五方面進(jìn)行分析鑒定。

所述小鼠ECM移植回小鼠卵巢原位的方法：腹腔注射麻醉受體小鼠，用手術(shù)剪刀在背中線中部開(kāi)口，用鑷子在背側(cè)將肌肉層扎破并伸入到體腔內(nèi)，夾出與卵巢相連的脂肪組織，撕破卵巢包膜，夾取出卵巢，將制備好的ECM重新放回到卵巢包膜中，將其放回到體內(nèi)，縫合傷口，做好標(biāo)記。

所述再生效率＝回收再生卵巢數(shù)量/移植小鼠卵巢數(shù)量×100％，計(jì)算再生效率；所述的組織學(xué)分析使用常規(guī)H&E染色的方法。

所述免疫組織化學(xué)分析包括使用脫蠟、脫水、微波加熱抗原修復(fù)、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、AP顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

所述基因表達(dá)情況采用PCR和qPCR兩種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證不同基因的表達(dá)情況；所述生殖能力檢測(cè)包括雌雄小鼠比例為2：1合籠，檢查陰栓，觀察其生仔情況。

本發(fā)明的有益效果是：首次成功的再生出小鼠卵巢，并且在移植四周后配對(duì)能夠成功的產(chǎn)生后代，進(jìn)一步為解決女性因卵巢功能停止造成的不孕癥提供了新的方法，為人類生殖做出新的貢獻(xiàn)。同時(shí)，脫細(xì)胞處理后的組織也在再生醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域中具有更廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，成本低廉，實(shí)驗(yàn)條件要求低，可操作性強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明處理后的ECM與再生的卵巢形態(tài)學(xué)和組織學(xué)對(duì)比照片。

圖2為不同基因的免疫組織化學(xué)表達(dá)情況照片。

圖3為不同基因在移植后不同時(shí)間的表達(dá)情況圖。

具體實(shí)施方式

以下是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，

本發(fā)明提供小鼠ECM的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：收集小鼠卵巢或其他組織器官，分別采用不同的洗滌劑，用不同的濃度處理不同的時(shí)間，制備小鼠ECM。

步驟二：使用無(wú)菌水和1xPBS清洗殘留的洗滌劑，兩種清洗液各洗八次，每?jī)尚r(shí)換一次液，最后在PBS中加入雙抗，4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟三：對(duì)制備的ECM進(jìn)行組織學(xué)分析和生化分析確定最佳處理?xiàng)l件。

所述洗滌劑為SDS和Triton中的一種或兩種組合。

所述不同的濃度洗滌劑和不同的處理時(shí)間是根據(jù)不同的組織來(lái)確定最佳的處理?xiàng)l件，例如卵巢組織的ECM使用的洗滌劑為(質(zhì)量體積百分比，克每毫升)1％、0.5％、0.2％的SDS，處理時(shí)間分別為6h、12h、20h。

所述的ECM的組織學(xué)分析是固定不同濃度、不同時(shí)間處理的ECM，制作石蠟組織切片，分別用H&E和DAPI染色方法對(duì)組織切片進(jìn)行染色，根據(jù)染色結(jié)果初步鑒定ECM內(nèi)的細(xì)胞是否去除干凈。

所述的ECM的生化分析包括測(cè)量ECM的彈性蛋白、膠原和sGAG三種成分在ECM中的含量以及殘留DNA的量。

所述的SDS是購(gòu)買于Sigma公司。

將上述步驟二得到的小鼠ECM采用背部開(kāi)口移植卵巢的方法，把支架移植到小鼠體內(nèi)，一個(gè)月后觀察小鼠卵巢再生情況。

所述的背部開(kāi)口移植卵巢的方法，包括如下步驟：腹腔注射麻醉劑，麻醉小鼠5分鐘后，使用消毒后的手術(shù)剪刀在小鼠背部開(kāi)口，扎破肌肉層，夾出與卵巢相連的脂肪組織。在卵巢包膜撕破一個(gè)小口，把卵巢剝離出來(lái)并取出來(lái)。最后挑取處理好的ECM，將其重新塞回到卵巢生長(zhǎng)的原部位，將所有組織重新夾回到體腔內(nèi)側(cè)，縫合傷口、做好標(biāo)記，觀察其術(shù)后情況。

所述的麻醉劑是購(gòu)買于Alfar的2.2.2-Tribromoethanol和Sigma的Tert-amylalcohol，儲(chǔ)液具體配置方法為在5g包裝的2.2.2-Tribromoethanol瓶中加入5ml Tert-amylalcohol，振搖至全部溶解。工作液為在35ml的生理鹽水中加入0.625ml儲(chǔ)液，充分混勻后用0.22um濾器過(guò)濾，貼好標(biāo)簽避光儲(chǔ)存于4℃。

所述的實(shí)驗(yàn)所需的小鼠均來(lái)自北京維通利華有限公司。

所述的觀察小鼠卵巢的再生情況包括，在移植手術(shù)5天、10天、15天、20天、25天、30天這六個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出小鼠移植后的ECM，并且進(jìn)一步用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、PCR等方法對(duì)再生卵巢組織進(jìn)行了驗(yàn)證。

所述的再生效率分析采用的分析公式為：再生效率＝回收再生卵巢數(shù)量/移植小鼠卵巢數(shù)量×100％。

所述的組織學(xué)分析取上述六個(gè)時(shí)間點(diǎn)移植后的小鼠再生的卵巢組織，固定之后制作石蠟組織切片，同樣采用H&E染色方法，與正常的卵巢組織切片對(duì)比，觀察不同時(shí)間點(diǎn)的卵巢組織形態(tài)學(xué)再生、發(fā)育情況。

所述的免疫組織化學(xué)分析是利用不同時(shí)間點(diǎn)制作好的石蠟組織切片，經(jīng)過(guò)脫蠟復(fù)水、抗原熱修復(fù)、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、AP顯色、核固紅復(fù)染、脫水透明、封片然后鏡檢，觀察不同抗體的表達(dá)情況。

所述的不同抗體的表達(dá)情況，抗體為blimp-1、stella、inhibinα、dazl、vasa、scp3、zp3、gdf9。上述抗體都購(gòu)買于santa公司。

所述的檢測(cè)基因的表達(dá)情況是采用PCR技術(shù)檢測(cè)回收的再生卵巢在不同時(shí)間點(diǎn)是否有blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、oct4、ddx4等基因的表達(dá)，同時(shí)還采用qPCR技術(shù)檢測(cè)上述基因的相對(duì)表達(dá)情況。

所述的產(chǎn)生后代的情況是成功產(chǎn)子兩代，共16只F1代小鼠。

本發(fā)明通過(guò)制作小鼠ECM以及小鼠卵巢原位移植技術(shù)，成功回收到不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠再生卵巢，并且配對(duì)后成功產(chǎn)生后代，證明移植后的小鼠ECM可以再生出卵巢。

具體實(shí)施例如下：

實(shí)施例一

1.小鼠卵巢支架的制備與分析

步驟一，小鼠卵巢支架的制備

將4周齡雌性小鼠頸椎處死后，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠腹部，然后剪開(kāi)腹部，沿雙角子宮及輸卵管找到卵巢。輕輕將卵巢包膜撕開(kāi)，用鑷子從脂肪與卵巢連接的根部輕輕取下卵巢，放置于無(wú)菌的PBS中清洗一下，然后在50ml無(wú)菌的離心管中預(yù)先配置好(質(zhì)量體積百分比，克每毫升)1％、0.5％、0.2％的SDS，將取到的卵巢放于離心管中。在搖床中回旋轉(zhuǎn)動(dòng)清洗小鼠卵巢，清洗時(shí)間分別為6h、12h、20h。SDS清洗完畢后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)把離心管中的SDS倒掉，倒入無(wú)菌水，清洗殘留在卵巢支架內(nèi)的SDS。每隔兩個(gè)小時(shí)換一次無(wú)菌水，總共換無(wú)菌水8次。為了使支架移植到體內(nèi)后與體內(nèi)的滲透壓保持一致，接著使用無(wú)菌PBS以同樣的方法也換8次液，結(jié)束時(shí)加入2000U/ml的雙抗，4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟二，小鼠卵巢支架的蠟塊制備

將制備好的小鼠卵巢支架放置于10％的中性甲醛中固定24小時(shí)后，先用水沖洗組織12h，放到50％的酒精中過(guò)夜，然后使用自動(dòng)脫水透明浸蠟機(jī)器，脫水、透明和浸蠟。其中脫水過(guò)程為75％乙醇1h——85％乙醇1h——95％乙醇40min——95％乙醇40min——100％乙醇40min——100％乙醇40min。透明過(guò)程為二甲苯Ⅰ(乙醇：二甲苯為1：1)40min——二甲苯Ⅱ40min——二甲苯Ⅲ40min。浸蠟過(guò)程為：石蠟Ⅰ(石蠟：二甲苯為1:1)1h——石蠟Ⅱ1h——石蠟Ⅲ1h。然后使用包埋機(jī)將支架包埋成蠟塊。

步驟三，小鼠卵巢支架的切片分析

(1)將制作好的支架蠟塊，使用石蠟切片機(jī)切成5mm的組織切片，52℃烘箱拷片過(guò)夜。進(jìn)行H&E染色，具體操作步驟為：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無(wú)水乙醇2min——無(wú)水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——蘇木素染色液5min——蒸餾水水洗10min——伊紅染色液1min30s——無(wú)水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。根據(jù)鏡檢結(jié)果判斷是否有細(xì)胞殘留在卵巢支架中。

(2)DAPI染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min，無(wú)水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——PBS中浸泡3min——滴加DAPI染液100ul——暗室作用15min吸去多余染色液——PBS洗2次，每次5min——封片——鏡檢。

(3)彈性蛋白染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無(wú)水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——70％乙醇2min——蒸餾水水洗3min——地衣紅室溫染色3h——70％酒精分化2min——85％、95％酒精各復(fù)水2min——二甲苯透明3min——封片——鏡檢。

(4)膠原染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無(wú)水乙醇2min——無(wú)水乙醇2min——95％乙醇2min——95％乙醇2min——水流沖洗2min——Weigert氏蘇木素染色10min——水流沖洗10min——Van Gieson染色液染色1min——棄染液，用95％酒精快速分化數(shù)秒鐘——無(wú)水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。

(5)sGAG染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無(wú)水乙醇2min——無(wú)水乙醇2min——95％乙醇2min——95％乙醇2min——水流沖洗1min——1％阿爾新藍(lán)染液染10～30分鐘——水流沖洗約10min至顏色分明為止——1％中性紅水溶液染細(xì)胞核1分鐘——水洗2min——95％乙醇1min——無(wú)水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。

(6)DNA含量測(cè)定：差量法稱量組織，設(shè)PCR管重量設(shè)為A、PCR管重量+組織重量設(shè)為B、組織重量設(shè)為C，則C＝B-A，兩者之差即組織的重量。按照差量法稱重分別稱重大約10mg左右的組織，組織稱重后將組織切碎，每管中加入1ml提前預(yù)冷的0.85％生理鹽水，用勻漿儀將組織打碎成細(xì)胞懸液。簡(jiǎn)短離心后即可按照Tiangen DNA提取試劑盒的基本流程提取DNA，260nm下測(cè)定吸光值，按照計(jì)算公式：DNA的干重含量(ng/mg)＝OD260x50x(10/0.52)x體積/組織重量，即每毫克組織中含有的DNA含量。接著使用3％LMP含有EB的凝膠對(duì)DNA進(jìn)行電泳分析，紫外光下鑒定DNA片段的長(zhǎng)度。

(7)sGAG的測(cè)定：同樣采取差量法稱取卵巢組織，稱取約20mg的組織樣品，每管中加入1ml配制好的木瓜蛋白酶于65℃水浴3h，10000g離心10min。試樣—取出10ul上清液于一新離心管中，去離子水加至100ul；空白試劑加入100ul去離子水；標(biāo)準(zhǔn)曲線加入試管中分別加入1、2、3、4、5ug的標(biāo)準(zhǔn)試劑。以上每管加入1ml Blyscan染料試劑，倒置混勻，搖床震蕩30min，12000rpm離心10min，倒出未結(jié)合的染料，加入250ul解離試劑，充分渦旋混合。12000rpm離心5min去除浮沫。吸取200ul試樣于96孔板中，656nm下測(cè)定OD值。

(8)彈性蛋白測(cè)定：差量法定量稱重10-20mg組織樣品并標(biāo)記好離心管，每管中加入750ul0.25M草酸置于95℃—100℃的水浴鍋中1h，將離心管冷卻至室溫，10000rpm離心10min，收集部分上清液，向離心管剩余的組織中繼續(xù)加入750ul 0.25M草酸再次加熱1h，收集兩次的上清液。檢測(cè)試樣加入500ulα-彈性蛋；空白試劑加入100ul去離子水；標(biāo)準(zhǔn)試劑加入12.5,25,50ul標(biāo)準(zhǔn)樣品。以上每管中加入等同體積的彈性蛋白沉淀試劑，渦旋混合后靜置15min，11000g離心10min后倒去上清液，加入1ml Sircol染料置于搖床中90min，11000g離心10min，倒出未結(jié)合染料后加入250ul解離試劑，渦旋混合。吸取200ul檢測(cè)試樣于96孔板中，513nm下測(cè)定OD值。

(9)膠原測(cè)定：按照以上的方法稱取組織重量在10mg左右，每管中加入1.3ml冷酸-胃蛋白酶(0.5M乙酸中0.1mg/ml胃蛋白酶)，4℃過(guò)夜。吸取1.0ml樣品加入100ul酸中和溶液，每管中加入冷分離和濃縮試劑(200ul/管)。倒置混勻，離心管放入試管架置于半冰半水的容器中，0-4℃下過(guò)夜。輕輕的移出試管，避免劇烈搖晃。12000rpm，10min離心從每管中緩慢吸出1000ul上清液棄去。檢測(cè)試樣加入100ul溶液；空白對(duì)照加入100ul/去離子水/0.5M乙酸//提取液；標(biāo)準(zhǔn)膠原加入5,10,15ug標(biāo)準(zhǔn)膠原。用空白試劑欄中的溶液加至100u，以上每管中加入1.0ml sircol染料，倒置混勻，將離心管置于搖床中30min，12000rpm 10min，小心翻轉(zhuǎn)并倒去未結(jié)合的染料溶液，小心將750ul冰-冷酸-鹽沖洗試劑加到球形的膠原-染料表面，12000rpm 10min離心，倒出沖洗試劑，用棉簽移出試管邊緣中剩余的液體，分別加入250ul堿試劑。離心管蓋上蓋，5min后漩渦混合，每管中吸取200ul樣品溶液加入96孔板中的每孔中，555nm測(cè)定吸光值。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出0.2％SDS處理12h的DNA濃度為15.6731ug/ml，脫細(xì)胞程度為93.94％，不含有完整DNA片段，損失了2/3的sGAG，彈性蛋白還保持比較好的水平，膠原保留值為10％，綜上所述此處理?xiàng)l件對(duì)支架損失最小，為最佳的處理?xiàng)l件。

2.小鼠卵巢支架原位移植與再生分析

步驟一小鼠卵巢原位取出

按腹腔注射0.015ml/g麻醉劑處理受體小鼠。用75％酒精棉球擦洗小鼠背部，使用消毒后的手術(shù)剪刀在在背中線中部開(kāi)口，然后使用手術(shù)鑷子在背側(cè)腎臟偏下的位置將肌肉層扎破，將鑷子伸入到體腔內(nèi)，夾出與卵巢相連的脂肪組織、卵巢、輸卵管和部分子宮角。在卵巢包膜的一側(cè)輕輕的撕破一個(gè)小口，把卵巢剝離出來(lái)。接著用鑷子夾取卵巢與脂肪連接的根部，將卵巢從其生長(zhǎng)部位取出。

步驟二小鼠卵巢支架原位移植

挑取處理好的卵巢支架，找到卵巢包膜的破口處，使用碘酒浸泡的脫脂棉幫助去除卵巢的傷口處先止血，然后將處理的支架組織重新塞回到卵巢生長(zhǎng)的原部位，接著把夾取出來(lái)的組織重新夾回到體腔內(nèi)側(cè)，縫合傷口、打完耳標(biāo)后，將手術(shù)后的老鼠放回到鼠籠里，觀察其術(shù)后情況。

步驟三小鼠卵巢再生分析

(1)再生效率的分析

小鼠卵巢原位移植支架一個(gè)月后回收再生的卵巢，記錄回收的數(shù)量并計(jì)算再生效率。

(2)再生組織學(xué)的分析

小鼠卵巢原位移植后，在移植后5天、10天、15天、20天、25天、30天這六個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別回收再生的卵巢組織，利用上面所述的蠟塊制作方法，制作不同的蠟塊。使用石蠟切片機(jī)，制作5mm的石蠟切片。在高于石蠟熔點(diǎn)兩度的烘箱里，過(guò)夜烘片。第二天取出切片，

經(jīng)過(guò)二甲苯Ⅰ10min——二甲苯Ⅱ10min——二甲苯Ⅲ10min——無(wú)水乙醇5min——無(wú)水乙醇5min——95％乙醇5min——95％乙醇5min——蘇木素染色液5min——蒸餾水水洗2min——伊紅染色液20s——95％乙醇5min——無(wú)水乙醇5min——二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——二甲苯Ⅲ5min——封片——鏡檢。檢查在移植不同時(shí)間后，再生卵巢的形態(tài)學(xué)變化。

(3)再生免疫組織化學(xué)分析

根據(jù)上述所制作的石蠟切片，30度過(guò)夜烘片，然后52度烘片兩小時(shí)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。主要檢測(cè)blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、vasa八個(gè)基因的蛋白表達(dá)情況。具體操作如下：二甲苯Ⅰ10min——二甲苯Ⅱ10min——二甲苯Ⅲ10min——無(wú)水乙醇5min——無(wú)水乙醇5min——95％乙醇5min——95％乙醇5min——流水沖洗2min——1×PBS沖洗5min——0.01M的檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)(使用微波爐修復(fù)，大火修復(fù)6min，中火修復(fù)四次，每次90s，最后涼至室溫)——10％的血清封閉兩小時(shí)——一抗孵育4度過(guò)夜——1×PBS清洗3次，每次5min——37度二抗孵育2小時(shí)——1×PBS清洗3次，每次5min——AP顯色2-5min——1×PBS清洗2次，每次5min——核固紅復(fù)染1min-2min——流水沖洗3遍——95％乙醇5min——無(wú)水乙醇5min——二甲苯Ⅲ5min——二甲苯Ⅱ5min——二甲苯Ⅰ5min——封片——鏡檢。

(4)基因表達(dá)情況分析

取出不同時(shí)間回收的再生卵巢，單個(gè)再生卵巢提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別進(jìn)行PCR和qPCR，檢測(cè)blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、oct4、ddx4各個(gè)基因在再生卵巢中的表達(dá)。

其中采用Trizol法提取RNA，先取到新鮮的或者凍于液氮中的再生卵巢組織，切碎組織，至于200ul—500ul的Trizol中，置于室溫下消化組織5—10min之后再加入五分之一體積的氯仿，14000rpm離心5min，取上清，然后加入2.5倍體積無(wú)水乙醇-20℃沉淀2小時(shí)。取出后14000rpm離心10min，然后用75％乙醇清洗一遍，無(wú)酶水混勻后-20℃保存待用。下一步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Takara RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

PCR擴(kuò)增上述9個(gè)基因。PCR引物(見(jiàn)SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20)與反應(yīng)體系見(jiàn)表1.1、表1.2。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃,5min；變性95℃，30s，復(fù)性52℃，30s，延伸72℃，30s，30個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃,7min。

實(shí)時(shí)定量qPCR是選擇相對(duì)定量的方法。RT-qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃,5min；變性95℃，10s，復(fù)性55℃，20s，延伸72℃，30s，40個(gè)循環(huán)。

表1.1目標(biāo)基因和管家基因的引物序列、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度

表1.2RT-PCR反應(yīng)體系

表1.3RT-qPCR反應(yīng)體系

(5)生殖能力的檢測(cè)

原位移植一個(gè)月后的雌性小鼠與正常的雄性小鼠以2:1的比例合籠，最后成功繁育出兩代小鼠，共16只F1代小鼠。

綜上結(jié)果表明經(jīng)過(guò)處理的天然的卵巢支架移植到卵巢原位，可以重新發(fā)育成正常的可以產(chǎn)生后代的卵巢。

實(shí)施例二

1.小鼠胸腺支架的制備與分析

步驟一，小鼠胸腺支架的制備

將4周齡雌性小鼠頸椎處死后，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠胸部，然后剪開(kāi)胸部及胸腔，找到呈乳白色的兩葉胸腺。用鑷子從胸腺根部輕輕取下胸腺，放置于無(wú)菌的PBS中清洗一下，然后在50ml無(wú)菌的離心管中預(yù)先配置好(體積百分比)1％、0.5％、0.2％的TritonX-100，將取到的胸腺放于離心管中。在搖床中回旋轉(zhuǎn)動(dòng)清洗小鼠胸腺，清洗時(shí)間分別為10h、15h、20h。清洗完畢后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)把離心管的中TritonX-100倒掉，倒入無(wú)菌水，清洗殘留在胸腺支架內(nèi)的TritonX-100。每隔一個(gè)小時(shí)換一次無(wú)菌水，總共換無(wú)菌水8次。為了使支架移植到體內(nèi)后與體內(nèi)的滲透壓保持一致，接著使用無(wú)菌PBS以同樣的方法也換8次液，結(jié)束時(shí)加入2000U/ml的雙抗，4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟二，小鼠胸腺支架的蠟塊制備

同上述小鼠卵巢支架蠟塊制備一致

步驟三，小鼠胸腺支架的切片分析

同上述小鼠卵巢支架切片的分析方法也一樣，包括H&E染色、DAPI染色、sGAG染色、彈性蛋白染色、膠原染色。

步驟四，小鼠胸腺支架的生化成分測(cè)定及分析

同上述小鼠卵巢支架測(cè)定與分析方法一致，包括DNA含量及片段長(zhǎng)度分析、sGAG、彈性蛋白和膠原的含量測(cè)定。

2.小鼠卵巢支架原位移植與再生分析

同上述小鼠卵巢支架原位移植方法移植。

再生分析只包含了形態(tài)學(xué)與組織學(xué)的分析，所用的方法都與小鼠卵巢支架形態(tài)學(xué)與組織學(xué)的分析方法一致。

實(shí)施例三

1.小鼠睪丸支架的制備與分析

步驟一，小鼠睪丸支架的制備

將4周齡雌性小鼠頸椎處死后，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠腹部，然后剪開(kāi)腹部，找到小鼠睪丸。用鑷子從睪丸基部輕輕取下睪丸，放置于無(wú)菌的PBS中清洗一下，然后在50ml無(wú)菌的離心管中預(yù)先配置好(體積百分比)1％、0.5％的SDS，將取到的睪丸放于離心管中。在搖床中回旋轉(zhuǎn)動(dòng)清洗小鼠睪丸，清洗時(shí)間分別為20h、24h、30h。清洗完畢后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)把離心管的中SDS倒掉，倒入無(wú)菌水，清洗殘留在睪丸支架內(nèi)的SDS。每隔；兩個(gè)小時(shí)換一次無(wú)菌水，總共換無(wú)菌水8次。為了使支架移植到體內(nèi)后與體內(nèi)的滲透壓保持一致，接著使用無(wú)菌PBS以同樣的方法也換8次液，結(jié)束時(shí)加入2000U/ml的雙抗，4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟二，小鼠睪丸支架的蠟塊制備

同上述小鼠卵巢支架蠟塊制備一致

步驟三，小鼠睪丸支架的切片分析

同上述小鼠卵巢支架切片的分析方法也一樣，包括H&E染色、DAPI染色、sGAG染色、彈性蛋白染色、膠原染色。

步驟四，小鼠睪丸支架的生化成分測(cè)定及分析

同上述小鼠卵巢支架測(cè)定與分析方法一致，包括DNA含量及片段長(zhǎng)度分析、sGAG、彈性蛋白和膠原的含量測(cè)定。

2.小鼠睪丸支架原位移植與再生分析

同上述小鼠卵巢支架原位移植方法移植。

再生分析只包含了形態(tài)學(xué)與組織學(xué)的分析，所用的方法都與小鼠卵巢支架形態(tài)學(xué)與組織學(xué)的分析方法一致。此外還包括了生殖能力的檢測(cè)，合籠后能夠得到后代。

綜上結(jié)果表明經(jīng)過(guò)處理的天然的卵巢、胸腺、睪丸支架移植到卵巢原位，可以重新發(fā)育成正常的可以產(chǎn)生后代的卵巢。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 戴雁峰

<120> 小鼠ECM的制備方法及得到的不同來(lái)源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內(nèi)再生的方法

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

ggctgtattc ccctccatcg t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

tggtgccaga tcttctccat gtc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

cgtggtacaa cccaaagcta 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

ttggcacaga cattgcac 18

<210> 5

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

ctttcaaagc cagtaaccag 20

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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actgctgcaa cacattcata 20

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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atgatacaga cgtcctacaa cc 22

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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cttatgtatt ccggccatcc ca 22

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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ccccagatga tagcaccaga 20

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 11

ccgagctgtg caattcccag a 21

<210> 12

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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aaccctctga gccaagggtg a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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agctgctgaa gcagaagagg 20

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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ggttctcatt gttgtcggct 20

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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ggaaaccagc agcaagtgat 20

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<213> 小鼠（Mus musculus）

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agcaccgtac tcattcacc 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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catgctaaac actccgtcct 20