一種食管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用，所述食管癌細(xì)胞系，命名為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC?145，保藏號為：CCTCC NO：C201686。本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC?145來自于一例中國的食管癌患者的手術(shù)切除后的腫瘤組織，STR檢測結(jié)果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染，克隆形成能力強(qiáng)，成瘤性差，可以作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面應(yīng)用的理想細(xì)胞系。CCTCC NO：C20168620160511
【專利說明】
-種食管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物學(xué)和腫瘤學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種食管癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率 和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多 于女，發(fā)病年齡多在40歲W上。食管癌典型的癥狀為進(jìn)行性咽下困難，先是難咽干的食物， 繼而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也不能咽下。在我國，食管癌發(fā)病率居全身腫瘤第5位，其 死亡率居第4位。食管癌的兩種主要亞型:鱗癌和腺癌，其中鱗癌約占90%。
[0003] 食管癌患者臨床表現(xiàn)如下：
[0004] 早期:癥狀常不明顯，但在吞咽粗硬食物時可能有不同程度的不適感覺，包括咽下 食物梗喧感，胸骨后燒灼樣、針刺樣或牽拉摩擦樣疼痛。食物通過緩慢，并有停滯感或異物 感。梗喧停滯感常通過吞咽水后緩解消失。癥狀時輕時重，進(jìn)展緩慢。
[0005] 中晚期:食管癌典型的癥狀為進(jìn)行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì) 食物，最后水和唾液也不能咽下。常吐黏液樣疲，為下咽的唾液和食管的分泌物?；颊咧饾u 消瘦、脫水、無力。持續(xù)胸痛或背痛表示為晚期癥狀，癌已侵犯食管外組織。當(dāng)癌腫梗阻所引 起的炎癥水腫暫時消退，或部分癌腫脫落后，梗阻癥狀可暫時減輕，常誤認(rèn)為病情好轉(zhuǎn)。若 癌腫侵犯喉返神經(jīng)，可出現(xiàn)聲音嘶啞；若壓迫頸交感神經(jīng)節(jié)，可產(chǎn)生化rner綜合征;若侵入 氣管、支氣管，可形成食管、氣管或支氣管擾，出現(xiàn)吞咽水或食物時劇烈哈咳，并發(fā)生呼吸系 統(tǒng)感染。最后出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)。若有肝、腦等臟器轉(zhuǎn)移，可出現(xiàn)黃痘、腹腔積液、昏迷等狀態(tài)。
[0006] 治療主要分外科治療、放射治療、化學(xué)治療等，近年來，W手術(shù)為主的綜合治療已 經(jīng)達(dá)到了瓶頸，而食管癌化療發(fā)展緩慢，尚無明確結(jié)論與標(biāo)準(zhǔn)方案。
[0007] 為深入了解食管鱗癌的發(fā)病機(jī)理和藥物及其他治療方法的研究，必須建立合適的 研究模型。目前國內(nèi)外常用的食管癌細(xì)胞株主要來源于日本，包括KYSE系列和TE系列。運(yùn)些 細(xì)胞系長期在體外傳代，一些已經(jīng)喪失了原始腫瘤組織的特性。因為種族差異，生活習(xí)慣不 同，環(huán)境因素等原因，運(yùn)些細(xì)胞能否代表我國食管癌的類型和特點(diǎn)存在很大的疑問。國內(nèi)少 數(shù)實驗室已建立的細(xì)胞株較少，部分廣泛使用的細(xì)胞株受到其他細(xì)胞的污染，使得食管癌 的研究不能深入開展。而且，隨著腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的治療理念的深入臨床實踐，提供更多的食 管癌細(xì)胞株有助于祀向藥物的研發(fā)和應(yīng)用。建立中國人來源的食管癌細(xì)胞株，為食管鱗癌 的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的模型，具有重要的理論和實際應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明針對目前國內(nèi)缺乏中國人來源的食管癌細(xì)胞株，而提供了一種來源于中國 人的食管癌細(xì)胞系。
[0009]本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145從一例食管癌患者（患者為66歲男性，腫瘤位于 食管中段，術(shù)后病理顯示中分化鱗狀細(xì)胞癌，?M分期T3N3M0,患者臨床分期3C期。）的手術(shù) 切除后的腫瘤組織取樣，經(jīng)原代培養(yǎng)并建系成功后，命名為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145,于 2016年5月11日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為： CCTCC N0:C201686。
[0010] 本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞生長旺盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，細(xì)胞呈扁 平不規(guī)則多角形，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，符合上皮樣細(xì)胞的特點(diǎn)。貼壁后生長較快， 具有良好的體外培養(yǎng)擴(kuò)增性。染色體數(shù)目大多分布在50~71之間，眾數(shù)為54,符合惡性腫瘤 的特征。
[0011] 本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145的STR測序結(jié)果與ATCC、DSMZ等細(xì)胞保存庫的數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結(jié)果，證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā) 生和其他細(xì)胞的交叉污染。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞呈CK5/6陽 性，CK14陽性，p63陽性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。
[0012] 克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞的克隆形成率與接種密度有 關(guān)系，接種密度為4500個細(xì)胞時的細(xì)胞克隆形成能力較強(qiáng)。
[0013] 裸鼠（裸小鼠）成瘤實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145成瘤性差。
[0014] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。所述子代細(xì)胞基本或全部保留 了親代細(xì)胞的特性。
[0015] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細(xì)胞系在作為食管癌發(fā)生機(jī)理研究的細(xì)胞模型中 的應(yīng)用。由于本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145是從中國人來源建立的，且建系時間較短， 性狀穩(wěn)定，W該食管癌細(xì)胞系作為研究模型，對于了解中國人的原發(fā)性食管癌發(fā)生機(jī)理有 很大幫助。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細(xì)胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應(yīng)用。所述 的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。通過將一定細(xì)胞數(shù)量的所述人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì) 胞接種于裸小鼠或裸大鼠的皮下、肝臟、腹腔或者尾靜脈等部位，獲得食管癌的動物模型。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細(xì)胞系在提取食管癌特異性腫瘤標(biāo)志物中的應(yīng)用。 通過與正常的食管細(xì)胞及其他種類的癌癥細(xì)胞進(jìn)行比較研究，可W發(fā)現(xiàn)食管癌的分子標(biāo) 記，針對該分子標(biāo)記可W進(jìn)行后續(xù)的疾病檢測及藥物開發(fā)等方面的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細(xì)胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應(yīng)用。首 先，通過向所述人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145培養(yǎng)基中添加不同藥物，觀察細(xì)胞狀態(tài)變化，獲 得初步有效的候選藥物。然后，將候選藥物施藥于上述食管癌的動物模型，觀察與未施藥組 動物的存活期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況等，篩選獲得潛在治療食管癌的藥物。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細(xì)胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)食 管癌特異性的腫瘤標(biāo)志物后，可根據(jù)該腫瘤標(biāo)志物開發(fā)出檢測食管癌發(fā)生或發(fā)展情況的檢 測試劑盒。
[0020] 本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145來自于一例中國的食管癌患者的手術(shù)切除后的 腫瘤組織，STR檢測結(jié)果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污 染，克隆形成能力強(qiáng)，成瘤性差，可W作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選 等方面應(yīng)用的理想細(xì)胞系。
【附圖說明】
[0021] 圖1為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞的形態(tài)檢測圖；
[0022] 圖2為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145的細(xì)胞生長曲線圖；
[0023] 圖3為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞的染色體核型分布圖；
[0024] 圖4為STR分析結(jié)果圖，其中，圖A~F分別是不同等位基因的結(jié)果圖；
[0025] 圖5為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果圖；
[0026] 圖6為與人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145相同來源的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析結(jié) 果圖；
[0027] 圖7為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果圖，其中，圖A、B和C接種 細(xì)胞數(shù)分別為500、1500和4500個。
【具體實施方式】
[0028] 實施例1
[0029] 從一例食管癌患者（患者為66歲男性，腫瘤位于食管中段，術(shù)后病理顯示中分化鱗 狀細(xì)胞癌，TOM分期T3N3M0，患者臨床分期3C期。）的手術(shù)切除后的腫瘤組織取樣。分離好的 新鮮食管癌組織，在無菌超凈臺中用PBS洗凈后，然后用眼科綴子、剪刀等器械在培養(yǎng)皿中 剪碎分離成0.5~1mm3的小塊平鋪于皿底，并向培養(yǎng)皿中加入含lOmL的10%FBS(GIBC0公 司），1 %雙抗DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBC0公司），放入37 °C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。5 ~7天后換液，棄去組織塊中壞死脫落的漂浮小塊，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，利用 成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞消化能力的不同，不斷去除成纖維細(xì)胞。多次傳代后，培養(yǎng)皿中肉眼 已無法觀察到成纖維細(xì)胞，并能持續(xù)生長傳代。建系成功后，命名為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC- 145,于 2016年 5 月 11 日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號 為：CCTCC N0:C201686。
[0030] 實施例2
[0031] 取傳代培養(yǎng)的人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下（日本Olympus IMT-2倒置顯微鏡)觀察活細(xì)胞生長情況。如圖1所示，細(xì)胞光學(xué)形態(tài)圖片，可見細(xì)胞生長旺 盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，符合上皮 樣細(xì)胞的特點(diǎn)。
[0032] 實施例3
[0033] 細(xì)胞指數(shù)(Cell Index)是指活細(xì)胞與檢測板孔中微電極相互作用，產(chǎn)生電阻抗的 改變，xCE化igence細(xì)胞功能分析儀，將運(yùn)些信號轉(zhuǎn)化為特定的參數(shù)成為細(xì)胞指數(shù)。細(xì)胞指 數(shù)很好地衡量了細(xì)胞的狀態(tài)一一生長、擴(kuò)散、形狀改變、死亡、應(yīng)激等，細(xì)胞指數(shù)已經(jīng)被多家 雜志評論并采納。
[0034] 取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞，經(jīng)膜酶消化，制成細(xì)胞懸液， 并計數(shù)。xCE化igence細(xì)胞功能分析儀的E-Plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值， 然后在E-Plate檢測板中加入100化細(xì)胞懸液(5000個），室溫超凈臺內(nèi)放置30min。將加入細(xì) 胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上(檢測臺預(yù)先放入培養(yǎng)箱中），進(jìn)行實時動態(tài)的細(xì)胞增殖 檢測即可獲得細(xì)胞增殖曲線，持續(xù)計數(shù)4~6天。利用Graph Pad軟件繪制生長曲線，并計算 得到細(xì)胞的群體倍增時間約26小時。如圖2所示，本發(fā)明人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145貼壁后 生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴(kuò)增性。
[0035] 實施例4
[0036] 取人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞，種植在六孔板中，培養(yǎng)48小時后，用O.Olmg/mL 的秋水仙素處理16h，當(dāng)鏡檢觀察到Μ期細(xì)胞比例為50% W上時，收集Μ期細(xì)胞。使用KC1低滲 液低滲處理Μ期細(xì)胞15~20min，用甲醇/冰醋酸（體積比3:1)作為固定液在室溫下固定細(xì) 胞，玻片上制片。將玻片置于〇.〇2%膜酶溶液中消化30~6〇3，經(jīng)?85漂洗，61611133染色，驚 干，完成制片。于顯微鏡下觀察，計算每個細(xì)胞中染色體數(shù)目，隨機(jī)選取20個細(xì)胞進(jìn)行計算。 如圖3所示，染色體數(shù)目大多分布在50~71之間，眾數(shù)為54,符合惡性腫瘤的特征。
[0037] 實施例5
[003引短串聯(lián)重復(fù)序列（shod tandem repeat,STR)又稱為微衛(wèi)星DNA。一般由一個長2 ~6bp的核屯、序列經(jīng)多次串聯(lián)重復(fù)排列而成，重復(fù)次數(shù)大多在10~60次之間。個體間核屯、序 列的重復(fù)次數(shù)呈高度變異性，因而一組STR序列的重復(fù)次數(shù)在不同個體中幾乎是唯一的，是 細(xì)胞生物學(xué)對細(xì)胞身份和來源進(jìn)行鑒定的主要方法。收集新鮮培養(yǎng)的人食管鱗癌細(xì)胞系 ZEC-145細(xì)胞，用Qiagen基因組DNA小量提取試劑盒（購自Qiagen公司，貨名QIAamp DNA Mini Kit,貨號為51304)提取細(xì)胞基因組DNA，用5'端巧光標(biāo)記的STR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對 所得產(chǎn)物進(jìn)行測序。其中STR位點(diǎn)的引物序列及拷貝數(shù)如表1和圖4所示，其中標(biāo)記D12S391 和D8S1179出現(xiàn)Ξ等位基因，可能是由于存在額外的染色體，因為腫瘤細(xì)胞的染色體數(shù)不正 常；也有可能是部分STR區(qū)域的拷貝數(shù)較正常情況增加了所導(dǎo)致。上述序列和ATCC，DSMZ等 細(xì)胞保存庫的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結(jié)果，由此可W證明其是唯一的， 且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染。
[0039]表1 STR位點(diǎn)的拷貝數(shù)。 Γ00401

[0041 ]實施例6
[0042] 免疫組化檢測人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞標(biāo)記蛋白。采用S-P法進(jìn)行免疫組化 染色，相關(guān)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK5/6(貨號MAB- 0276,福州邁新公司），P63(貨號ZM-04-06,北京中衫金橋公司），CK14(貨號ZA-0540,北京中 衫金橋公司），CgA(貨號ZA-0507,北京中衫金橋公司），Sy(貨號IR660，DAK0公司），CD56(I貨 號R628，DAK0公司）。
[0043] 腫瘤組織免疫組化:組織(為實施例1中獲取細(xì)胞的同一腫瘤樣品）蠟塊經(jīng)常規(guī)脫 蠟并水化，用3%出化去離子水浸泡10分鐘，W阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后放到0.01M P冊.0的拘橡酸緩沖液中，高壓鍋噴汽半分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加一抗，室溫下解育60分鐘， PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。滴加化lymer Helper(聚合物輔助劑），室溫下解育20分鐘， ?85緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。滴加化179日1'〇義1(1日3日-日]11:;[-1]1〇113日/拘613；[1:1旨6，室溫下解 育30分鐘，PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制DAB溶液，顯色5~10分鐘，鏡下觀察。清 水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明、封片。
[0044] 腫瘤細(xì)胞免疫組化:待檢測細(xì)胞(人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞)提前24小時爬 片于消毒載玻片上，24小時后，用PBS緩沖液沖洗2次，冷丙酬固定15分鐘，浸泡于PBS中備 用。取所需玻片加50化過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)的室溫下解育10分鐘，PBS緩沖液沖洗3 次，每次3分鐘，除去PBS液，滴加50化正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下解育10分鐘；除 去血清，滴加50化一抗，室溫下解育60分鐘，PBS沖洗Ξ次，每次3~5分鐘;滴加二抗，室溫下 解育10分鐘，？85沖洗^次，每次3分鐘。滴加化179日1'〇義1(1日3日-日]11:;[-1]1〇113日/拘613；[1:1旨6，室 溫下解育30分鐘，PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制DAB溶液，顯色5~10分鐘，鏡下 觀察。清水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明、封片。
[0045] 結(jié)果如圖5和圖6所示，人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞呈CK5/6陽性，CK14陽性， p63陽性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。細(xì)胞的和組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果均說明人食管鱗 癌細(xì)胞系ZEC-145是鱗癌來源的。
[0046] 實施例7
[0047] 取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞，經(jīng)膜酶消化后制成細(xì)胞懸液， 并計數(shù)。將細(xì)胞懸液W500,1500,4500個細(xì)胞每孔接種于6孔板中。將6孔板置于培養(yǎng)箱中， 靜置培養(yǎng)2周，每周換液2次。2周后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗后，無水甲醇固定lOmin，然 后用0.1%結(jié)晶紫染色lOmin，洗去染色液，室溫干燥，并拍照記錄。如圖7所示，人食管鱗癌 細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞的克隆形成率與接種密度有關(guān)系，接種密度為4500個細(xì)胞時的細(xì)胞克 隆形成能力較強(qiáng)。
[004引實施例8
[0049]取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145細(xì)胞，經(jīng)膜酶消化后制成細(xì)胞懸液， 并計數(shù)。將細(xì)胞懸液W1000萬個細(xì)胞分別接種到5只裸鼠（裸小鼠）蔽下，連續(xù)觀察。結(jié)果，8 周后未成瘤。
【主權(quán)項】
1. 食管癌細(xì)胞系，其特征在于，命名為人食管鱗癌細(xì)胞系ZEC-145，保藏號為：CCTCC N0:C201686。2. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系在作為食管癌發(fā)生機(jī)理研究的細(xì)胞模型中的應(yīng) 用。4. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。6. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系在提取食管癌特異性腫瘤標(biāo)志物中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細(xì)胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/09GK106011067SQ201610581112
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】蘇丹, 毛偉敏, 劉金石, 應(yīng)莉莎, 吳軍舟
【申請人】浙江省腫瘤醫(yī)院