一種食管癌細胞系及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種食管癌細胞系及其應用，食管癌細胞系，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC?014，保藏號為：CCTCC NO：C201689。本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC?014來自于一例中國的食管癌患者的手術切除后的腫瘤組織，STR檢測結果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污染，克隆形成與成瘤性強，可以作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面應用的理想細胞系。CCTCC NO：C20168920160511
【專利說明】
-種食管癌細胞系及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物學和腫瘤學技術領域，特別是設及一種食管癌細胞系及其應用。
【背景技術】
[0002] 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率 和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多 于女，發(fā)病年齡多在40歲W上。食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物， 繼而是半流質食物，最后水和唾液也不能咽下。在我國，食管癌發(fā)病率居全身腫瘤第5位，其 死亡率居第4位。食管癌的兩種主要亞型:鱗癌和腺癌，其中鱗癌約占90%。
[0003] 食管癌患者臨床表現(xiàn)如下：
[0004] 早期:癥狀常不明顯，但在吞咽粗硬食物時可能有不同程度的不適感覺，包括咽下 食物梗喧感，胸骨后燒灼樣、針刺樣或牽拉摩擦樣疼痛。食物通過緩慢，并有停滯感或異物 感。梗喧停滯感常通過吞咽水后緩解消失。癥狀時輕時重，進展緩慢。
[0005] 中晚期:食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質 食物，最后水和唾液也不能咽下。常吐黏液樣疲，為下咽的唾液和食管的分泌物。患者逐漸 消瘦、脫水、無力。持續(xù)胸痛或背痛表示為晚期癥狀，癌已侵犯食管外組織。當癌腫梗阻所引 起的炎癥水腫暫時消退，或部分癌腫脫落后，梗阻癥狀可暫時減輕，常誤認為病情好轉。若 癌腫侵犯喉返神經，可出現(xiàn)聲音嘶??；若壓迫頸交感神經節(jié)，可產生化rner綜合征;若侵入 氣管、支氣管，可形成食管、氣管或支氣管擾，出現(xiàn)吞咽水或食物時劇烈哈咳，并發(fā)生呼吸系 統(tǒng)感染。最后出現(xiàn)惡病質狀態(tài)。若有肝、腦等臟器轉移，可出現(xiàn)黃痘、腹腔積液、昏迷等狀態(tài)。
[0006] 治療主要分外科治療、放射治療、化學治療等，近年來，W手術為主的綜合治療已 經達到了瓶頸，而食管癌化療發(fā)展緩慢，尚無明確結論與標準方案。
[0007] 為深入了解食管鱗癌的發(fā)病機理和藥物及其他治療方法的研究，必須建立合適的 研究模型。目前國內外常用的食管癌細胞株主要來源于日本，包括KYSE系列和TE系列。運些 細胞系長期在體外傳代，一些已經喪失了原始腫瘤組織的特性。因為種族差異，生活習慣不 同，環(huán)境因素等原因，運些細胞能否代表我國食管癌的類型和特點存在很大的疑問。國內少 數(shù)實驗室已建立的細胞株較少，部分廣泛使用的細胞株受到其他細胞的污染，使得食管癌 的研究不能深入開展。而且，隨著腫瘤精準醫(yī)學的治療理念的深入臨床實踐，提供更多的食 管癌細胞株有助于祀向藥物的研發(fā)和應用。建立中國人來源的食管癌細胞株，為食管鱗癌 的發(fā)病機制及治療提供新的模型，具有重要的理論和實際應用價值。

【發(fā)明內容】

[000引本發(fā)明針對目前國內缺乏中國人來源的食管癌細胞株，而提供了一種來源于中國 人的食管癌細胞系。
[0009]本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014從一例食管癌患者（患者為54歲男性，腫瘤位于 食管上段，術后病理顯示中分化鱗狀細胞癌，TOM分期為T3N1M0，臨床分期3A期。）的手術切 除后的腫瘤組織取樣，經原代培養(yǎng)并建系成功后，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-014,于 2016年5月11日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為： CCTCC N0:C201689。
[0010] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞呈扁平不規(guī)則多角形，細胞彼此緊密相連 成單層膜，符合上皮樣細胞的特點。貼壁后生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴增性。染色體 數(shù)目大多分布在43~55之間，眾數(shù)為48,符合惡性腫瘤的特征。
[0011] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014的STR測序結果與ATCC、DSMZ等細胞保存庫的數(shù) 據庫進行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結果，證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā) 生和其他細胞的交叉污染。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞呈CK5/6陽 性，CK14陽性，p63陽性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。
[0012] 克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞的克隆形成率與接種密度有 關系，接種密度為4500個細胞時的細胞克隆形成能力較強。
[0013] 裸鼠（裸小鼠）成瘤實驗結果發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-014具有較強的成瘤性。
[0014] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細胞系的子代細胞。所述子代細胞基本或全部保留 了親代細胞的特性。
[0015] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細胞系在作為食管癌發(fā)生機理研究的細胞模型中 的應用。由于本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014是從中國人來源建立的，且建系時間較短， 性狀穩(wěn)定，W該食管癌細胞系作為研究模型，對于了解中國人的原發(fā)性食管癌發(fā)生機理有 很大幫助。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應用。所述 的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。通過將一定細胞數(shù)量的所述人食管鱗癌細胞系ZEC-014細 胞接種于裸小鼠或裸大鼠的皮下、肝臟、腹腔或者尾靜脈等部位，獲得食管癌的動物模型。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在提取食管癌特異性腫瘤標志物中的應用。 通過與正常的食管細胞及其他種類的癌癥細胞進行比較研究，可W發(fā)現(xiàn)食管癌的分子標 記，針對該分子標記可W進行后續(xù)的疾病檢測及藥物開發(fā)等方面的應用。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應用。首 先，通過向所述人食管鱗癌細胞系ZEC-014培養(yǎng)基中添加不同藥物，觀察細胞狀態(tài)變化，獲 得初步有效的候選藥物。然后，將候選藥物施藥于上述食管癌的動物模型，觀察與未施藥組 動物的存活期、腫瘤大小、轉移情況等，篩選獲得潛在治療食管癌的藥物。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應用。發(fā)現(xiàn)食 管癌特異性的腫瘤標志物后，可根據該腫瘤標志物開發(fā)出檢測食管癌發(fā)生或發(fā)展情況的檢 測試劑盒。
[0020] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014來自于一例中國的食管癌患者的手術切除后的 腫瘤組織，STR檢測結果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污 染，克隆形成與成瘤性強，可W作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面 應用的理想細胞系。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞的形態(tài)檢測圖；
[0022] 圖2為本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014的細胞生長曲線圖；
[0023] 圖3為本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞的染色體核型分布圖；
[0024] 圖4為STR分析結果圖，其中，圖A~F分別是不同等位基因的結果圖；
[0025] 圖5為人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞免疫細胞化學分析結果圖；
[00%]圖6為與人食管鱗癌細胞系ZEC-043相同來源的腫瘤組織的免疫組織化學分析結 果圖；
[0027] 圖7為本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞克隆形成實驗結果圖，其中，圖A、B和 C接種細胞數(shù)分別為500、1500和4500個；
[0028] 圖8為裸鼠成瘤實驗結果圖。
【具體實施方式】
[00巧]實施例1
[0030] 從一例食管癌患者（患者為54歲男性，腫瘤位于食管上段，術后病理顯示中分化鱗 狀細胞癌，TOM分期為T3N1M0,臨床分期3A期。）的手術切除后的腫瘤組織取樣。分離好的新 鮮食管癌組織，在無菌超凈臺中用PBS洗凈后，然后用眼科綴子、剪刀等器械在培養(yǎng)皿中剪 碎分離成0.5~1mm3的小塊平鋪于皿底，并向培養(yǎng)皿中加入含lOmL的10%FBS(GIBC0公司）， 1 %雙抗DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(GIBC0公司），放入37 °C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。5~7天 后換液，棄去組織塊中壞死脫落的漂浮小塊，進行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，利用成纖 維細胞與腫瘤細胞消化能力的不同，不斷去除成纖維細胞。多次傳代后，培養(yǎng)皿中肉眼已無 法觀察到成纖維細胞，并能持續(xù)生長傳代。建系成功后，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-014， 于2016年5月11日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為： CCTCC N0:C201689。
[0031] 實施例2
[0032] 取傳代培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞，在光學顯微鏡下（日本Olympus IMT-2倒置顯微鏡)觀察活細胞生長情況。如圖1所示，細胞光學形態(tài)圖片，可見細胞生長旺 盛，背景清晰，雜質少見，細胞呈扁平不規(guī)則多角形，細胞彼此緊密相連成單層膜，符合上皮 樣細胞的特點。
[0033] 實施例3
[0034] 細胞指數(shù)(Cell Index)是指活細胞與檢測板孔中微電極相互作用，產生電阻抗的 改變，xCE化igence細胞功能分析儀，將運些信號轉化為特定的參數(shù)成為細胞指數(shù)。細胞指 數(shù)很好地衡量了細胞的狀態(tài)一一生長、擴散、形狀改變、死亡、應激等，細胞指數(shù)已經被多家 雜志評論并采納。
[0035] 取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞，經膜酶消化，制成細胞懸液， 并計數(shù)。xCE化igence細胞功能分析儀的E-Plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值， 然后在E-Plate檢測板中加入100化細胞懸液(5000個），室溫超凈臺內放置30min。將加入細 胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上(檢測臺預先放入培養(yǎng)箱中），進行實時動態(tài)的細胞增殖 檢測即可獲得細胞增殖曲線，持續(xù)計數(shù)4~6天。利用Graph Pad軟件繪制生長曲線，并計算 得到細胞的群體倍增時間約22小時。如圖2所示，本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-014貼壁后 生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴增性。
[0036] 實施例4
[0037] 取人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞，種植在六孔板中，培養(yǎng)48小時后，用O.Olmg/mL 的秋水仙素處理16h，當鏡檢觀察到Μ期細胞比例為50% W上時，收集Μ期細胞。使用KC1低滲 液低滲處理Μ期細胞15~20min，用甲醇/冰醋酸（體積比3:1)作為固定液在室溫下固定細 胞，玻片上制片。將玻片置于〇.〇2%膜酶溶液中消化30~6〇3，經?85漂洗，61611133染色，驚 干，完成制片。于顯微鏡下觀察，計算每個細胞中染色體數(shù)目，隨機選取20個細胞進行計算。 如圖3所示，染色體數(shù)目大多分布在43~55之間，眾數(shù)為48,符合惡性腫瘤的特征。
[003引實施例5
[0039] 短串聯(lián)重復序列（shod tandem repeat,STR)又稱為微衛(wèi)星DNA。一般由一個長2 ~6bp的核屯、序列經多次串聯(lián)重復排列而成，重復次數(shù)大多在10~60次之間。個體間核屯、序 列的重復次數(shù)呈高度變異性，因而一組STR序列的重復次數(shù)在不同個體中幾乎是唯一的，是 細胞生物學對細胞身份和來源進行鑒定的主要方法。收集新鮮培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞系 ZEC-014細胞，用Qiagen基因組DNA小量提取試劑盒（購自Qiagen公司，貨名QIAamp DNA Mini Kit,貨號為51304)提取細胞基因組DNA，用5'端巧光標記的STR引物進行PCR擴增，對 所得產物進行測序。其中STR位點的引物序列及拷貝數(shù)如表1和圖4所示。上述序列和ATCC， DSMZ等細胞保存庫的數(shù)據庫進行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結果，由此可W證明其是唯 一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污染。
[0040] 表1 STR位點的拷貝數(shù)。
[0041]
PENTAD I 13 I 13
[0042] 實施例6
[0043] 免疫組化檢測人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞標記蛋白。采用S-P法進行免疫組化 染色，相關試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK5/6(貨號MAB- 0276,福州邁新公司），P63(貨號ZM-04-06,北京中衫金橋公司），CK14(貨號ZA-0540,北京中 衫金橋公司），CgA(貨號ZA-0507,北京中衫金橋公司），Sy(貨號IR660，DAK0公司），CD56(I貨 號R628，DAK0公司）。
[0044] 腫瘤組織免疫組化:組織(為實施例1中獲取細胞的同一腫瘤樣品）蠟塊經常規(guī)脫 蠟并水化，用3%出化去離子水浸泡10分鐘，W阻斷內源性過氧化物酶，然后放到0.01M P冊.0的拘橡酸緩沖液中，高壓鍋噴汽半分鐘進行抗原修復。滴加一抗，室溫下解育60分鐘， PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。滴加化lymer Helper(聚合物輔助劑），室溫下解育20分鐘， ?85緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。滴加化179日1'〇義1(1日3日-日]11:;[-1]1〇113日/拘613；[1:1旨6，室溫下解 育30分鐘，PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制DAB溶液，顯色5~10分鐘，鏡下觀察。清 水沖洗，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明、封片。
[0045] 腫瘤細胞免疫組化:待檢測細胞(人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞)提前24小時爬 片于消毒載玻片上，24小時后，用PBS緩沖液沖洗2次，冷丙酬固定15分鐘，浸泡于PBS中備 用。取所需玻片加50化過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)的室溫下解育10分鐘，PBS緩沖液沖洗3 次，每次3分鐘，除去PBS液，滴加50化正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下解育10分鐘；除 去血清，滴加50yL-抗，室溫下解育60分鐘，PBS沖洗Ξ次，每次3~5分鐘;滴加二抗，室溫下 解育10分鐘，？85沖洗^次，每次3分鐘。滴加化179日1'〇義1(1日3日-日]11:;[-1]1〇113日/拘613；[1:1旨6，室 溫下解育30分鐘，PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制DAB溶液，顯色5~10分鐘，鏡下 觀察。清水沖洗，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明、封片。
[0046] 結果如圖5和圖6所示，人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞呈CK5/6陽性，CK14陽性， p63陽性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。細胞的和組織的免疫組織化學結果均說明人食管鱗 癌細胞系ZEC-014是鱗癌來源的。
[0047] 實施例7
[004引取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞，經膜酶消化后制成細胞懸液， 并計數(shù)。將細胞懸液W500,1500,4500個細胞每孔接種于6孔板中。將6孔板置于培養(yǎng)箱中， 靜置培養(yǎng)2周，每周換液2次。2周后，棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗后，無水甲醇固定lOmin，然 后用0.1%結晶紫染色lOmin，洗去染色液，室溫干燥，并拍照記錄。如圖7所示，人食管鱗癌 細胞系ZEC-014細胞的克隆形成率與接種密度有關系，接種密度為4500個細胞時的細胞克 隆形成能力較強。
[0049] 實施例8
[0050] 取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-014細胞，經膜酶消化后制成細胞懸液， 并計數(shù)。將細胞懸液W1000萬個細胞分別接種到5只裸鼠（裸小鼠）蔽下，連續(xù)觀察。試驗結 果如圖8所示，接種后2周后可觸及到腫塊，隨時間的增加，腫塊增大。
【主權項】
1. 食管癌細胞系，其特征在于，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-014,保藏號為：CCTCC N0:C201689。2. 如權利要求1所述的食管癌細胞系的子代細胞。3. 如權利要求1所述的食管癌細胞系在作為食管癌發(fā)生機理研究的細胞模型中的應 用。4. 如權利要求1所述的食管癌細胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應用。5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。6. 如權利要求1所述的食管癌細胞系在提取食管癌特異性腫瘤標志物中的應用。7. 如權利要求1所述的食管癌細胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應用。8. 如權利要求1所述的食管癌細胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/02GK106011069SQ201610590659
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】蘇丹, 熊磊, 毛偉敏, 蔣友華, 應莉莎, 謝正華, 吳軍舟
【申請人】浙江省腫瘤醫(yī)院, 埃提斯生物技術（上海）有限公司