抗Myo單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤的制作方法
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Myo單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤。
[0002]【背景知識】
[0003]肌紅蛋白(Myoglobin，Myo)約占肌肉總量的0.1% -0.2%，分子量為16.7kDa。Myo由I條多肽鏈和I個血紅素輔基組成。Myo的分子極為緊密，一分子的氧僅能被一分子的肌紅蛋白結(jié)合，疏水核心是球狀蛋白的典型特征。肌紅蛋白廣泛存在于人及哺乳動物心肌、骨骼肌包漿中，是一種可溶性亞鐵血紅素蛋白。Myo在肌細胞中與氧發(fā)生可逆性結(jié)合，主要發(fā)揮氧的轉(zhuǎn)運和貯存功能。在正常情況下，心肌細胞和骨骼肌中的Myo含量最高。如果在機體內(nèi)，心肌或骨骼肌細胞發(fā)生損傷，則細胞內(nèi)的Myo迅速釋放到外周血液中，從而誘發(fā)血液中的Myo含量升高。血液中的肌紅蛋白增高現(xiàn)象常見于急性或慢性腎功能衰竭、急性心肌梗死早期、急性肌損傷、肌萎縮、多發(fā)性肌炎、肌營養(yǎng)不良、嚴重充血性心力衰竭和長期休克等。在臨床方面，肌紅蛋白最主要用于心肌梗塞病人的診斷，在AMI發(fā)生的1-4小時內(nèi)，血液中肌紅蛋白值升高，在6-7小時后含量達到高峰，在24小時后恢復(fù)正常水平，因此它是急性心肌梗塞的早期診斷標志物。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種抗Myo單克隆抗體以及建立一種簡單且具高靈敏度的檢測Myo含量的方法，該方法可應(yīng)用于心肌梗死的檢測。以解決現(xiàn)有的單克隆抗體檢測Myo的靈敏度不夠或價格昂貴，不適合臨床大規(guī)模的應(yīng)用的缺點。
[0005]本發(fā)明獲得了能夠產(chǎn)生特異性識別Myo的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株49_2與雜交瘤細胞株9-2，此2株細胞株分別在2015年7月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:C2015101與CCTCCNO:C2015102o此外，經(jīng)過鑒定，兩株單克隆抗體分別識別Myo的兩個不同表位，通過49_2與9-2的結(jié)合建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法，其是一種高靈敏度及高通量的檢測系統(tǒng)。
[0006]因此，本發(fā)明提供了下面所述的I至3的內(nèi)容:
[0007]1.抗Myo的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCC NO:C2015101和CCTCC NO:C2015102。
[0008]2.抗Myo的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCC NO:C2015101和CCTCC NO:C2015102的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為49-2和9_2。
[0009]3.如權(quán)利要求2所述的抗Myo單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測Myo，夾心法兩兩配對的抗體來源于保藏號為CCTCC NO:C2015101雜交瘤分泌的抗體49-2和保藏號為CCTCC NO:C2015102雜交瘤分泌的抗體9_2，其步驟包括:
[0010](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體49-2包被；
[0011](2)加入待測樣品孵育；
[0012](3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體9-2作為二抗，加入反應(yīng)體系;
[0013](4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值；
[0014](5)結(jié)果表明檢測的靈敏度很高。
【【附圖說明】】
[0015]附圖1顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗Myo單克隆抗體在ELISA方法中滴度測量結(jié)果。
[0016]附圖2顯示的是標記HRP的抗Myo單克隆抗體滴度測量結(jié)果。
[0017]附圖3顯示的是夾心法ELISA(S-ELISA)系統(tǒng)的檢測靈敏度。
【【具體實施方式】】
[0018]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在闡述了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價形式同樣是本申請中權(quán)利要求書中所限定的范圍。
[0019]實施例1:動物免疫
[0020]選擇與所用的骨髓瘤細胞同源的8周齡左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量為30ug的Myo抗原與弗氏完全佐劑、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多點，及腋下、腹股溝免疫。免疫程序:經(jīng)15天后進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進行第三次相同劑量與福氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天后取脾細胞進行融入口 ο
[0021]實施例2:雜交瘤細胞的構(gòu)建
[0022]1、骨髓瘤細胞株的培養(yǎng)及制備
[0023](I)本發(fā)明采用的是SP2/0骨髓瘤細胞株，該細胞株生長及融合效率均佳，倍增時間為10-12小時。融合時選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞。骨髓瘤細胞在融合前應(yīng)先在培養(yǎng)基上作適應(yīng)培養(yǎng)，使細胞生長到最佳的狀態(tài)(即對數(shù)生長期)；
[0024](2)將培養(yǎng)的SP2/0吸至50mL的管中，離心，棄上清，懸起，加1mL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計數(shù)。
[0025]2、脾細胞的制備
[0026](I)將小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
[0027](2)將小鼠消毒固定在解剖板上，在超凈工作臺中取脾，放在12mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剝掉粘連組織，研磨脾臟，直至剩白色組織為止，吸管全部吸起，再緩慢打出使組織塊粘連的管壁上，離心，棄上清，加1mL的紅細胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培養(yǎng)基終止其反應(yīng)，離心后，棄上清，加1mL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計數(shù)。
[0028]3、細胞融合
[0029]加強免疫后3天做細胞融合。
[0030]細胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是取處于對數(shù)生長期的Sp2/0細胞與脾細胞1: 10混和，通過聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細胞，命名為49-2和9-2。所獲得的雜交瘤細胞懸浮在含有飼養(yǎng)細胞的HAT培養(yǎng)基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12天。
[0031]實施例3:單克隆抗體的制備及篩選
[0032]1、單克隆抗體的制備
[0033]從實施例2中所獲得的雜交瘤細胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液，選取在ELISA方法中與Myo抗原反應(yīng)的單克隆抗體。
[0034]2、單克隆抗體的篩選
[0035](I)將10uL濃度為0.5ug/mL的Myo抗原到96孔板的每個孔格中，于4°C過夜后使其固定于固相；
[0036](2)用150uL濃度為I %的牛血清白蛋白進行封閉2小時；
[0037](3)將10uL雜交瘤細胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個孔格中，于37°C反應(yīng)2小時，然后加入稀釋10000倍的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體于37°C反應(yīng)I小時；
[0038](4)使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB)作為底物進行顯色20min ;
[0039](5)添加50uL濃度為0.lmol/L的硫酸終止反應(yīng)后，測量450nm的吸光度；
[0040](6)選出吸光度大約為3的49-2和9_2，并通過有限稀釋法進行亞克隆。
[0041]3、單克隆抗體的大量制備及和純化
[0042]將亞克隆后的細胞用細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶進行擴大培養(yǎng)，約20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進行親和層析純化。得到的單克隆抗體分別命名為49_2與9_2。
[0043]4、單克隆抗體效價的測定
[0044]所篩選出的2種mAb的效價通過ELISA方法來測定。分別加入49_2、9_2 (1ug/mL)，在反應(yīng)后，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進行顯色，兩種mAb效價達到10 9以上(附圖1所示)。
[0045]實施例4:單克隆抗體的標記及滴度的測定
[0046]將純化出得各抗體按常規(guī)方法進行HRP標記，標記好的單克隆抗體的滴度通過下面的方法測定，將濃度為0.5ug/mL的Myo抗原固定在96孔微板上(10uL/孔)。使用I %的牛血清白蛋白進行封閉2小時，加標記的單克隆抗體(第一孔稀釋100倍)，從第二孔開始做4倍稀釋，于室溫下反應(yīng)2小時。添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進行20分鐘，用0.1mol/L的硫酸中止反應(yīng)。測量在450nm的吸光度，按實施例3中的方式獲得針對固定在固相中的抗原的滴度。結(jié)果表明具有有效的滴度(附圖2所示)。
[0047]實施例5:雙抗體夾心ELISA檢測Myo方法的建立
[0048](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體之一包被，0.5ug/mL的單克隆抗體以10uL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小時固定于固相；
[0049](2)孔格使用含有 0.1 % Tween 20 的 pH 值為 7.4 的 20mM PBS (PBST)，以 200uL/孔的量洗滌2次。以150uL/孔的量加入I %牛血清白蛋白進行封閉2小時；
[0050](3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗滌4次，加入由起始濃度10ug/mL連續(xù)4倍稀釋Myo抗原，于室溫溫育2小時，然后加入HRP標記的另一株抗體(I: 5000 ；10uL/孔)并于室溫溫育2小時；
[0051](4)添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進行20分鐘，加入0.lmol/L的硫酸來終止反應(yīng)并測量450nm的吸光度；
[0052](5)結(jié)果表明檢測的靈敏度很高(附圖3所示)。
【主權(quán)項】
1.抗Myo的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCCNO:C2015101和CCTCC NO:C2015102。2.抗Myo的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCCNO:C2015101和CCTCC NO:C2015102的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為49-2和9-2。3.如權(quán)利要求2所述的抗Myo單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測Myo，夾心法兩兩配對的抗體來源于保藏號為CCTCC NO:C2015101雜交瘤分泌的抗體49-2和保藏號為CCTCC NO:C2015102雜交瘤分泌的抗體9_2，其步驟包括: (1)以所述的兩兩配對的單克隆抗體49-2包被； (2)加入待測樣品孵育； (3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體9-2作為二抗，加入反應(yīng)體系； (4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值； (5)結(jié)果表明檢測的靈敏度很高。
【專利摘要】抗Myo單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤的制備，屬于免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種特異性識別Myo的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測Myo的高靈敏度的方法。CCTCC NO：C201510120150717
【IPC分類】C12N5/20, G01N33/68, G01N33/577, C07K16/18, C12R1/91
【公開號】CN105132379
【申請?zhí)枴緾N201510454236
【發(fā)明人】趙洪梅, 劉云成, 李喜梅, 張 杰, 侯杰, 盧亞波
【申請人】大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年7月25日