人單克隆抗-pd-l1抗體和使用方法
【專利說明】人單克隆抗-PD-L1抗體和使用方法
[0001] 相關(guān)申請 本申請要求提交于2012年10月4日的美國臨時申請?zhí)?1/709, 731和提交于2013年 3月13日的美國臨時申請?zhí)?1/779,969的優(yōu)先權(quán)和利益，其內(nèi)容通過引用各自以其整體結(jié) 合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明主要涉及抗-PD-Ll (也稱為程序化細胞死亡1配體1或B7H1)抗體及其使 用方法。
[0003] 發(fā)明背景 免疫系統(tǒng)必須實現(xiàn)在有效應(yīng)答以清除致病體和保持耐受以防止自身免疫疾病之間的 平衡。T細胞對于保持這種平衡是關(guān)鍵的，并且它們的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)主要通過B7-CD28家族的 分子協(xié)調(diào)。B7家族成員（其行使配體的功能)和CD28家族成員（其行使受體的功能)之間的 相互作用提供了關(guān)鍵的正信號，其不僅發(fā)起、提高和維持T細胞應(yīng)答，而且在適當(dāng)時還促進 限制、終止和/或消弱τ細胞應(yīng)答的關(guān)鍵負信號。CD28家族的一個成員，稱為ro-i (也稱 為程序化細胞死亡-1)在活化的T細胞、B細胞和單核細胞上被增量調(diào)節(jié)。Η)-1在B7家族 中有兩個鑒定出的配體，PD-Ll (也稱為BH71或程序化細胞死亡-1配體1)和TO-L2。雖然 主要在活化的抗原呈遞細胞（APC)上發(fā)現(xiàn)ro-L2的表達傾向于為更受限的，但ro-Ll的表 達為更普遍的，包括造血譜系（其包括活化的T細胞、B細胞、單核細胞、樹突細胞和巨噬細 胞）和外周非淋巴組織（其包括心、骨骼、肌肉、胎盤、肺、腎和肝組織）的細胞。PD-Ll的普 遍表達暗示它在調(diào)節(jié)ro-1/PD-Ll-介導(dǎo)外周耐受中的重要作用。
[0004] PD-Ll和ro-ι之間的結(jié)合對于T細胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)具有意義深遠的作用。具體而 言，ro-Li/ro-1相互作用抑制τ細胞增殖和效應(yīng)子細胞因子(其介導(dǎo)τ細胞活性和免疫應(yīng) 答，例如IL-2和IFN- γ )的產(chǎn)生。此負調(diào)節(jié)功能對于阻止T細胞-介導(dǎo)的自身免疫和免疫 病理學(xué)是重要的。然而，還已表明，PD-1/ro-Ll軸在T細胞衰竭中發(fā)揮作用，由此負調(diào)節(jié)功 能抑制T細胞對宿主的危害的應(yīng)答。對T細胞的長期或慢性抗原刺激可誘導(dǎo)負免疫反饋機 制，其抑制抗原特異性應(yīng)答并導(dǎo)致病原體的免疫逃避。T細胞衰竭還可導(dǎo)致抗原-特異性T 細胞自身的漸進性物理缺失（progressive physical deletion)。F1D-I的T細胞表達在慢 性抗原刺激期間被增量調(diào)節(jié)，并且其與I3D-Ll的結(jié)合導(dǎo)致在CD4+(T輔助細胞）和CD8+(細 胞毒性T淋巴細胞或CTL)T細胞兩者中效應(yīng)子功能的阻斷，因此暗示在T細胞衰竭的誘導(dǎo) 中PD-1/PD-L1相互作用。
[0005] 最近，已表明一些慢性病毒感染和癌癥發(fā)展了免疫逃避策略，其通過引起ro-i/ ro-Ll-介導(dǎo)的τ細胞衰竭而特別地利用ro-1/PD-Li軸。多種人腫瘤細胞和腫瘤相關(guān)抗原 呈遞細胞表達高水平的ro-Ll，這暗示所述腫瘤誘導(dǎo)τ細胞衰竭以逃避抗-腫瘤免疫應(yīng)答。 在慢性HIV感染期間，HIV-特異性CD8+ T細胞在功能上被損害，表現(xiàn)為產(chǎn)生細胞因子和效 應(yīng)子分子的能力降低和增殖能力降低。研究已表明ro-ι在HIV感染個體的HIV-特異性 ⑶8+ T細胞上高表達，這表明阻斷ro-1/PD-Ll通路對于HIV感染和AIDS患者的治療可具 有治療潛能。綜合在一起，阻斷ro-1/PD-Ll通路的作用劑將為多種癌癥、HIV感染和/或與 T-細胞衰竭相關(guān)的其它疾病和病況提供新的治療方法。因此，對可阻斷或阻止ro-1/PD-Ll 相互作用的作用劑存在迫切的需要。
[0006] 發(fā)明簡述 本發(fā)明基于結(jié)合ro-Li的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)。所述單克隆抗體為全人抗體。所述抗體 結(jié)合ro-Li。所述抗體在本文中被稱為huro-Li抗體。
[0007] PD-Ll也被稱為程序化細胞死亡1配體1、程序化死亡配體1、ro⑶1配體1、 PDCD1L1、PDL1、B7 同系物 1、B7H1、B7-H、CD274 和 CD274 抗原。
[0008] 本發(fā)明提供分離的人源化單克隆抗體，其具有：具有三個CDR (其分別包含氨基酸 序列 SYGIS (SEQ ID N0:57)、WISAYNGNTNYAQKLED (SEQ ID N0:70)和 ALPSGTILVGGWFDP (SEQ ID N0:86))的重鏈和具有三個CDR (其分別包含氨基酸序列TRSSGNIASNYVQ (SEQ IDN0:101)、EDNQRPS(SEQIDN0:115)和QSYDSSNLWV(SEQIDN0:1 27))的輕鏈；具有 三個 CDR (其分別包含氨基酸序列 SYALS (SEQ ID N0:58)、AISGGGGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:71)和DVFPETFSMNYGMDV (SEQ ID N0:87))的重鏈和具有三個CDR (其分別包含氨基 酸序列 QGDSLRSYYAS (SEQ ID N0:102)、GKNNRPS (SEQ ID N0:116)和 NSRDSSGNHYV (SEQ ID N0:128))的輕鏈；具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列DYAMH (SEQ ID N0:60)、 LIS⑶GGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:73)和VLLPCSSTSCYGSVGAFDI (SEQ ID N0:88))的重鏈和 具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列GGSDIGRKSVH (SEQ ID NO: 103)、SDRDRPS (SEQ ID NO: 117)和QVWDNNSDHYV (SEQ ID NO: 129))的輕鏈；具有三個CDR(其包含氨基酸序列NYDMS (SEQ ID N0:61)、RVNWNGGSTTYADAVKD (SEQ ID N0:74)和 EFVGAYDL (SEQ ID N0:89))的 重鏈和具有三個CDR(其分別包含氨基酸序列TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID N0:104)、DVSNRPS (SEQ ID NO: 118)和SSYTSSTLP (SEQ ID NO: 130))的輕鏈；具有三個CDR (其分別包含氨 基酸序列 GLYIH (SEQ ID N0:62)、WIIPIFGTANYAQKFED (SEQ ID N0:75)和 GLRWGIWGWFDP (SEQ ID N0:90))的重鏈和具有三個CDR (其分別包含氨基酸序列RASQSIGNSLA (SEQ ID NO: 105)、GASSRAT (SEQ ID NO: 119)和 QQHTIPTFS (SEQ ID NO: 131))的輕鏈；具 有三個 CDR (其分別包含氨基酸序列 DNAIS (SEQ ID N0:63)、WIIPIFGKPNYAQKFED (SEQ ID N0:76)和TMVRGFLGVMDV (SEQ ID N0:91))的重鏈和具有三個CDR (其分別包含氨基 酸序列 RASQGIGSYLA (SEQ ID N0:106)、AASTLQS (SEQ ID N0:120)和 QQLNNYPIT (SEQ ID N0:132))的輕鏈；具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列SYAMS (SEQ ID N0:64)、 AISGSGGSTYYADSVKD (SEQ ID N0:77)和 DQFVTIFGVPRYGMDV (SEQ ID N0:92))的重鏈和 具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列S⑶KLGNKYAY (SEQ ID NO: 107)、QDIKRPS (SEQ ID NO: 121)和QTWDNSVV (SEQ ID NO: 133))的輕鏈；具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列 SYAIS (SEQ ID N0:57)、WIIPIFGTANYAQKFED (SEQ ID N0:78)和 GRQMFGAGIDF (SEQ ID N0:93))的重鏈和具有三個CDR(其分別包含氨基酸序列TRSSGSIDSNYVQ (SEQ ID N0:108)、 EDNQRPS (SEQ ID NO: 115)和 QSYDSNNRHVI (SEQ ID NO: 134))的輕鏈；具有三個 CDR (其 分別包含氨基酸序列 TYALN (SEQ ID N0:65)、RIVPLIGLVNYAHNFED (SEQ ID N0:79)和 EVYGGNSDY (SEQ ID勵:94))的重鏈和具有三個〇?(其分別包含氨基酸序列了1?36見6了附￥0 (SEQ ID NO: 109)、EDYRRPS (SEQ ID NO: 122)和 QSYHSSGWE (SEQ ID NO: 135))的輕鏈； 具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列SHGIT (SEQ ID N0:66)、WISAHNGHASNAQKVED (SEQ IDN0:80)和VHAALYYGMDV(SEQIDN0:95))的重鏈和具有三個⑶R(其分別包含氨基酸 序列 GGNNIGSKGVH (SEQ ID N0:110)、DDSDRPS (SEQ ID N0:123)和 QVWDSSSDHWV (SEQ ID N0:136))的輕鏈；具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列RHGMH (SEQ ID N0:67)、 VISHDGSVKYYADSMKD (SEQ ID N0:81)和GLSYQVSGWFDP (SEQ ID NO:%))的重鏈和具有三個 CDR(其分別包含氨基酸序列 TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:111)、EDNQRPS (SEQ ID Ν0:11δ) 和QSYDSTTPSV (SEQ ID NO: 137))的輕鏈；具有三個CDR (其分別包含氨基酸序列SYGIS (SEQ ID N0:58)、WTSPHNGLTAFAQILED (SEQ ID N0:82)和 VHPVFSYALDV (SEQ ID N0:97)) 的重鏈和具有三個CDR(其分別包含氨基酸序列TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 112)、EDNQRPS (SEQ ID NO: 115)和 QSYDGITVI (SEQ ID NO: 138))的輕鏈；具有三個 CDR (其分別包含 氨基酸序列 TYAFS (SEQ ID N0:68)、RIIPILGIANYAQKFED (SEQ ID N0:83)和 DGYGSDPVL (SEQ ID N0:98))的重鏈和具有三個CDR (其分別包含氨基酸序列TRSSGSIASHYVQ (SEQ IDN0:113)、EDNKRPS(SEQIDN0:124)和QSYDSSNRWV(SEQIDN0:139))的輕鏈 ；或具有 三個 CDR (其分別包含氨基酸序列 NYGIS (SEQ ID N0:69)、WISAYNGNTNYAQKVED (SEQ ID N0:84)和⑶FRKPFDY (SEQ ID N0:99))的重鏈和具有三個⑶R (其分別包含氨基酸序列 TLRSGLNVGSYRIY(SEQIDN0:114)、YKSDSNKQQAS(SEQIDN0:125)和MIWYSSAW(SEQID NO: 140))的輕鏈；其中所述抗體結(jié)合人ro-Li。
[0009] 在一個方面，抗體為單價的或二價的。在另一方面中，抗體為單鏈抗體。
[0010] 本發(fā)明提供單鏈抗體，其包括：含SEQ ID NO: 1的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 3的Vj亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 5的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 7的八核苷酸序 列；含SEQ ID NO: 9的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 11的V J亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 13的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 15的V1核苷酸序列；含SEQ ID NO: 17的Vh核苷酸 序列和含SEQ ID NO: 19的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 21的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 23的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 25的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 27的Vl 核苷酸序列；含SEQ ID NO: 29的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 31的八核苷酸序列；含 SEQ ID NO: 33的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 35的V J亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 37 的Vh核苷酸序列和含SEQ ID NO: 39的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 41的V!^亥苷酸序 列和含SEQ ID NO: 43的八核苷酸序列；含SEQ ID NO: 45的V1^苷酸序列和含SEQ ID NO: 47的V』亥苷酸序列；含SEQ ID NO: 49的苷酸序列和含SEQ ID NO: 51的V』亥 苷酸序列；或含SEQ ID NO: 53的VdS苷酸序列和含SEQ ID NO: 55的八核苷酸序列。 [0011] 在另一個方面中，本發(fā)明提供單鏈抗體，其包括：含SEQ ID NO: 2的％氨基酸序列 和含SEQ ID NO: 4的 '氨基酸序列；含SEQ ID NO: 6的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 8的'氨基酸序列；含SEQ ID NO: 10的V 11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 12的八氨基酸 序列；含SEQ ID NO: 14的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；含SEQ ID NO: 18的Vh氨基酸序列和含SEQ ID NO: 20的Vl氨基酸序列；含SEQ ID NO: 22的Vh氨基 酸序列和含SEQ ID NO: 24的'氨基酸序列；含SEQ ID NO: 26的V 11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 28的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 30的V基酸序列和含SEQ ID NO: 32的Vl 氨基酸序列；含SEQ ID NO: 34的￥11氨基酸序列和含SEQ ID NO: 36的八氨基酸序列；含 SEQ ID NO: 38的V1^基酸序列和含SEQ ID NO: 40的V1氨基酸序列；含SEQ ID NO: 42 的Vh氨基酸序列和含SEQ ID NO: 44的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 46的V 11氨基酸序 列和含SEQ ID NO: 48的八氨基酸序列；含SEQ ID NO: 50的V 基酸序列和含SEQ ID NO: 52的 '氨基酸序列；或含SEQ ID NO: 54的V 基酸序列和含SEQ ID NO: 56的Vl 氨基酸序列。
[0012] 在一些方面中，抗體具有在KT5 M-KT12 M的范圍內(nèi)的結(jié)合親和力。
[0013] 在另一方面中，抗體是雙特異性抗體，其還結(jié)合至腫瘤-相關(guān)抗原、細胞因子或細 胞表面受體。例如，所述腫瘤-相關(guān)抗原是CAIX。例如，所述細胞因子是IL-10。例如，所 述細胞表面受體是CCR4、IL21R、BTLA、HVEM或??Μ3。
[0014] 本發(fā)明提供連接至治療劑的抗體。例如，所述治療劑是毒素、放射性標(biāo)記、siRNA、 小分子或細胞因子。
[0015] 本發(fā)明提供產(chǎn)生任何上述抗體的細胞。
[0016] 本發(fā)明還提供選擇性殺傷腫瘤細胞的方法，其包括將所述細胞與任何上述抗體接 觸。在一方面中，通過抗體-依賴性細胞毒性（ADCC)、補體依賴性細胞毒性（CDC)、抗體依 賴性細胞吞噬（ADCP)產(chǎn)生選擇性殺傷。在另一方面中，所述腫瘤細胞表達ro-Li。
[0017] 本發(fā)明還提供阻止或逆轉(zhuǎn)T細胞衰竭的方法，其包括向有需要的受試者給予含任 何上述抗體的組合物。
[0018] 本發(fā)明還提供提高對抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向有需要的受試者給予含任 何上述抗體的組合物。在一方面中，抗原是病毒抗原、細菌抗原或腫瘤相關(guān)抗原。在另一方 面中，所述病毒抗原是HIV。在另外的方面中，所述腫瘤相關(guān)抗原是CAIX。在另一方面中， 抗體在暴露于抗原之前或之后被給予。在另一方面中，所述抗體的給予引起抗原特異性T 細胞活性增加。在另一方面中，T-細胞是效應(yīng)子T細胞。
[0019] 本發(fā)明還提供治療或緩解癌癥的癥狀的方法，其包括向有需要的受試者給予含任 何上述抗體的組合物。例如，所述癌癥是腎細胞癌或乳腺癌。例如，所述癌癥是其中過量表 達F 1D-Ll的癌癥。在另一實例中，所述癌癥是誘導(dǎo)T細胞哀竭的癌癥。
[0020] 本發(fā)明還提供治療或緩解慢性病毒感染的癥狀的方法，其包括向有需要的受試者 給予含任何上述抗體的組合物。例如，所述慢性病毒感染是HIV感染。例如，所述慢性病毒 感染是誘導(dǎo)T細胞衰竭的病毒感染。
[0021] 本發(fā)明提供核酸序列，其包括 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53 或 55 的核酸序列。
[0022] 在另一方面中，本發(fā)明提供核酸序列，其編碼SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、 18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54 或 56 的多肽。
[0023] 在另一方面中，本發(fā)明提供多肽，其包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54 或 56 的氨基酸序列。
[0024] 在另一方面中，本發(fā)明提供載體，其包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53或55的核酸序列。本發(fā)明提 供載體，其包含 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42、44、46、48、50、52、54或56的核酸序列。本發(fā)明另外提供細胞，其包含上述載體的任 一種。
[0025] 本公開的任何方法中的給予途徑包括但不限于腸胃外（例如，靜脈內(nèi)）、皮內(nèi)、皮 下、口服（例如，吸入）、經(jīng)皮（即，局部）、經(jīng)粘膜和直腸給予。
[0026] 本公開的任何方法中的受試者是，例如，哺乳動物。所述哺乳動物是，例如，人。
[0027] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢依據(jù)以下詳述的說明書和權(quán)利要求將顯而易見，并且包 含在其中。
[0028] 附圖簡述 圖1.抗-PD-Ll scFv-噬菌體克?。?4個克?。┑陌被嵝蛄?。展示了對于IGHV和 IGLV/IGKV兩者的構(gòu)架區(qū)1-4 (FW1-4)、互補決定區(qū)1-3 (CDR1-3)和家族命名。使用Kabat 編號。檢索表："."與共有區(qū)匹配的AA、"X"非共有區(qū)AA和為空白（即沒有AA)。
[0029] 圖2.通過FACS進行的huro-Ll抗體與人ro-Ll (hro-Ll)表達細胞的結(jié)合分析。 測試四種類型的細胞，其包括親本細胞系300. 9和hPD-Ll、hPD-L2或人C型凝集素結(jié)構(gòu)域 家族2成員（hCLEC2D)轉(zhuǎn)染的300. 9細胞。GF1538是抗hPD-Ll的人源化抗體。GF1757是 抗hPD-L2的人源化抗體。第二抗體是PE-山羊抗-人IgG。
[0030] 圖3.在競爭性FACS分析中通過抗-PD-Ll噬菌體-抗體對hPD-1結(jié)合至hPD-Ll 的抑制。測試呈噬菌體-scFv形式的所有抗-M3D-Ll抗體對hPDl-hFc融合蛋白與hPD-Ll 表達293T細胞的結(jié)合的抑制。將IO12 pfu的噬菌體-scFv與約0. 25 yg/mL的可溶 性hPDl-hFc混合并加入至hPD-Ll表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞。在洗滌之后，將細胞與 FITC-抗-人IgG抗體一起孵育以測量hPDl-hFc與細胞表面上的hPD-Ll的結(jié)合。
[0031] 圖4.在競爭性FACS分析中通過抗-PD-Ll可溶性抗體對hPD-Ι結(jié)合至hPD-Ll的 抑制。將所有抗-M 3D-Ll抗體以所示濃度與hPD-Ll表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的300. 9細胞預(yù)孵育30 分鐘，隨后將0. 125 μ g的hPD-Ι-小鼠 IgG2a加入各反應(yīng)物中并孵育另外30分鐘。在洗滌 之后，將PE-山羊-抗-小鼠 IgG2a Ab加入并接著洗滌和FACS分析。GF1538是抗hPD-Ll 的人源化Ab。GF1757為抗hPD-L2的人源化Ab。
[0032] 圖5.雙特異性抗體的設(shè)計和形成。
[0033] 圖6.雙特異性抗體（bsAb)構(gòu)建體的確定。A)識別CAIX和H)-L1的雙特異性抗 體的圖示和連接CH3結(jié)構(gòu)域的"結(jié)進孔（knob into hole)"方法。B)三種類型的bsAb構(gòu) 建體的圖示，其在CH2結(jié)構(gòu)域中具有不同的突變以改變ADCC活性。