一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可分泌抗吡蟲啉的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆抗體，以及一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]吡蟲啉，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亞胺，屬于新煙堿類殺蟲劑，毒性中等，通過作用于昆蟲的乙酰膽堿酯酶受體而使害蟲麻痹，最終死亡。近年來，吡蟲啉已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻、棉花、茶樹、大豆、煙草等作物上來防治飛虱、蚧殼蟲、白粉虱等農(nóng)業(yè)害蟲。良好的防治效果使其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被大量使用，但是不當使用對環(huán)境和人類健康造成較大威脅，因此對農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留的檢測十分必要。
[0003]目前，對吡蟲啉殘留檢測多采用氣相色譜法、高效液相色譜法等方法。這些方法結(jié)果可靠，靈敏度高，已有相關(guān)的技術(shù)標準可供參考。但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復(fù)雜、成本高、時間長，因此不能更好地滿足快速簡便的現(xiàn)場檢測要求。
[0004]化學(xué)農(nóng)藥的免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、特異的優(yōu)點，便攜而有利于進行現(xiàn)場監(jiān)測，克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點。免疫金標試紙條時近年來迅速發(fā)展的農(nóng)藥快速免疫檢測技術(shù)。但傳統(tǒng)的試紙條因膠體金層析方法的固有局限性而顯的靈敏度不夠，以及僅用于定性檢測，或在儀器的協(xié)助下的定量檢測。為克服傳統(tǒng)試紙條上述不足，該發(fā)明在單克隆抗體的基礎(chǔ)上，利用金放大增敏技術(shù)，建立了針對農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留量半定量檢測的試紙條，該試紙條對P比蟲啉農(nóng)藥的檢測區(qū)間為0-5ng/mL(陰性)，5_25ng/mL，25_250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL，可用于葉菜類蔬菜中R比蟲啉殘留量的現(xiàn)場半定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可穩(wěn)定分泌抗吡蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種基于單克隆抗體的吡蟲啉半定量檢測金放大試紙條。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]本發(fā)明提供提供了雜交瘤細胞株CH3，該細胞株已于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCN0.C201509。
[0009]識別吡蟲啉的單克隆抗體，由保藏編號為CCTCC N0.C201509的雜交瘤細胞株CH3
分泌產(chǎn)生。
[0010]本發(fā)明提供的抗吡蟲啉純化抗體來自于BALB/C小鼠腹腔。該小鼠經(jīng)過液體石蠟預(yù)處理后，注射雜交瘤細胞株CH3，并采集該小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸銨法進行純化，收集得到抗吡蟲啉單克隆抗體。該單克隆抗體可用于識別吡蟲啉農(nóng)藥，對吡蟲啉的IC50為0.lng/mL0
[0011]本發(fā)明提供一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條，其特征在于:它包括襯板，襯板的一面自上而下依次黏貼吸水紙、檢測墊、金標墊I (放大)、金標墊2(檢測)和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接。所述檢測墊為硝酸纖維素膜，該膜自上而下設(shè)計I條質(zhì)控線和3條檢測線；所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG ;所述檢測線包被有吡蟲啉包被半抗原-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物；所述金標墊I (放大)為玻璃纖維素膜，噴涂有親和素標記的納米金顆粒；所述金標墊2 (檢測)為玻璃纖維素膜，噴涂有納米金標記的抗吡蟲啉單克隆抗體。
[0012]本發(fā)明提供的一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條，其特征在于:所述3條檢測線自上而下分別包被了濃度為0.05，0.08，0.21mg/mL的吡蟲啉半抗原-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物，其在檢測墊上的噴涂速度為0.75 μ 1/cm。
[0013]本發(fā)明提供的一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條，其特征在于:所述的金標墊I (放大)上噴涂有親和素標記的納米金顆粒，納米金顆粒大小為40nm，親和素的濃度為0.46mg/mL，在金標墊I (放大)上噴涂的速度為7.2 μ 1/cm。
[0014]本發(fā)明提供的一種基于單抗抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條，可用于葉菜類蔬菜中吡蟲啉殘留量的半定量在線檢測，該試紙條對吡蟲啉農(nóng)藥的檢測區(qū)間為:0-5ng/mL(陰性)，5-25ng/mL，25_250ng/mL，250-1000ng/mL 以及大于 1000 ng/mL。
[0015]本發(fā)明提供的一種基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測金放大試紙條，可用于葉菜類蔬菜中吡蟲啉殘留的在線半定量檢測，其穩(wěn)定性較好，操作方便。在添加回收及田間殘留實驗中，本發(fā)明提供的試紙條檢測結(jié)果與儀器分析(HPLC)檢測結(jié)果相一致。
[0016]有益效果
[0017](I)本發(fā)明提供的基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測試紙條，利用生物素-親和素親和力強以及納米金顆粒的信號增大效應(yīng)，可大大提高檢測靈敏度，與使用相同抗體的傳統(tǒng)試紙條相比，靈敏度可提高10倍。
[0018](2)本發(fā)明提供的基于單克隆抗體的吡蟲啉檢測試紙條，可實現(xiàn)葉菜類蔬菜的在線半定量檢測，操作簡便，攜帶方便，可擺脫對儀器的依賴。
[0019]附圖:
[0020]圖1:本發(fā)明提供的金放大試紙條與傳統(tǒng)試紙條的效果比較圖，其中橢圓形代表的是可視檢測限，圓柱方框代表的是完全消線的吡蟲啉濃度。
[0021]圖2:本發(fā)明提供的金放大試紙條對吡蟲啉的半定量檢測效果圖，其中可視檢測限為5ng/mL，對卩比蟲啉的檢測區(qū)間可劃分為0_5ng/mL(陰性)，5_25ng/mL，25_250ng/mL，250-1000ng/mL 以及大于 1000ng/mL。
[0022]圖3:本發(fā)明提供的金放大試紙條對田間葉菜類蔬菜上吡蟲啉殘留量的檢測效果
【具體實施方式】
[0023]實施例1:納米標簽的合成
[0024]1.抗吡蟲啉單克隆抗體-生物素標簽的合成
[0025]將抗吡蟲啉單克隆抗體在碳酸鹽緩沖液(0.05M，包含15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3,pH = 9.6)中透析4小時。將5mg/mL抗體與分子數(shù)20倍于抗體的生物素二甲亞砜溶液混合。將混合液在室溫下攪拌6小時，穩(wěn)定后在0.0lM PBS緩沖液中進行透析。透析液即為抗吡蟲啉抗體-生物素標簽，保存于4°C下待用。
[0026]2.納米金-抗體-生物素標簽的合成
[0027]用0.2M的K2CO3調(diào)整納米金溶液的pH值至9.0 ;利用鹽沉淀方法確定納米金與抗吡蟲啉抗體-生物素標簽的分子數(shù)比例。在快速攪拌膠體金的同時，按照特定比例逐滴加入抗吡蟲啉抗體-生