小片段gG抗原及其在檢測偽狂犬病毒gG抗體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物疫病檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測偽狂犬病毒抗體的gG抗 原片段、試劑盒，以及檢測偽狂犬病毒抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,偽狂犬病毒）屬于痕疼病毒科，α痕疼病毒 亞科中的豬的I型皰疹病毒，它能引起多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊 髓炎為主要癥狀的急性傳染病。該病嚴重危害著全球養(yǎng)豬業(yè)，可引起妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死 胎、木乃伊胎；初生仔豬多為急性致死經(jīng)過，具有明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率幾乎100% ;成年 豬多為隱性感染。免疫接種是防治偽狂犬病的主要策略，目前應(yīng)用比較多的是缺失偽狂犬 病毒復(fù)制必需基因的偽狂犬病毒弱毒疫苗。gG基因是偽狂犬病毒中的一個分泌性的非必 需的糖蛋白基因，標志疫苗是在TK基因缺失的基礎(chǔ)上，將病毒的非必需糖蛋白基因進行缺 失，這樣得到的突變株就不產(chǎn)生被缺失的糖蛋白，但又不影響病毒在細胞上的增殖與免疫 原性。將這種雙基因缺失疫苗注射動物后，動物不能產(chǎn)生抗所缺失蛋白的抗體。
[0003] 偽狂犬病毒弱毒疫苗雖然能有效地阻止感染后臨床癥狀的出現(xiàn)，但接種豬仍可能 被強毒感染，感染能形成潛伏和隨后潛伏感染的病毒能被激活和引起散播，通過血清學(xué)方 法可以將感染野毒的血清學(xué)陽性豬與基因缺失疫苗注射豬區(qū)分開來，接種基因缺失疫苗的 豬，血清中不含有缺失蛋白的抗體，如果在豬血清中檢測出了缺失蛋白的抗體，說明豬已經(jīng) 被偽狂犬病毒的野毒感染。建立偽狂犬病毒的早期快速鑒別基因缺失弱毒疫苗毒和野毒感 染的抗體檢測方法十分重要。
[0004] 偽狂犬病毒的抗體檢測方法很多，包括乳膠凝集（LAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)幾種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測偽狂犬病毒抗體的小片段gG抗原、試劑盒以 及檢測偽狂犬病毒抗體的方法，所述方法可用于鑒別偽狂犬病毒野毒感染動物和gG缺失 疫苗免疫動物。
[0006] 本發(fā)明的一方面提供一種用于檢測偽狂犬病毒抗體的小片段gG抗原，其氨基酸 序列如下：
[0007] YADYYDVHIFRSESDDEVVHGDAPEAPEGEEVTEEEAELTSSDLDNIEIEVVGSPAAPAEGPATEEGRG AEEDEELTSSDLDNIEIEVVGSPRPPASSPPPPPPRPHPRGRDHDHDHGHHRADDRGPQRHHRLPPEPT(SEQ ID N0:1)〇
[0008] 在一些實施方案中，所述小片段gG抗原是重組的。在進一步的實施方案中，所述 小片段gG抗原是由大腸桿菌表達的重組多肽。
[0009] 在一些實施方案中，所述小片段gG抗原除SEQ ID NO: 1所示的序列之外，還包含 hig tag〇
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供上述小片段gG抗原的編碼核酸序列。優(yōu)選所述核酸序列 如下：
[0011] TACGCCGACTACTACGACGTGCACATCTTCCGCTCGGAGTCTGACGACGAGGTCGTCCACGGCGATGCC CCCGAGGCCCCCGAGGGCGAGGAGGTGACCGAGGAGGAGGCCGAGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGAT CGAGGTCGTGGGCTCTCCCGCCGCTCCCGCCGAGGGCCCGGCGACGGAGGAGGGGCGCGGGGCCGAGGAGGACGAGG AGCTGACCTCCAGCGACCTCGACAACATCGAGATCGAGGTCGTGGGCTCGCCGCGGCCGCCCGCTTCTTCGCCGCCT CCACCACCCCCGCGCCCCCACCCGCGCGGCCGAGATCACGACCATGACCACGGTCACCACCGTGCGGACGACCGAGG ACCCCAGCGGCATCACCGACTGCCGCCGGAGCCGACC(SEQ ID N0:2)〇
[0012] 本發(fā)明的另一方面提供一種非診斷目的檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體的方法， 其特征在于，使用上述小片段gG抗原作為抗原，通過基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法， 檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體。
[0013] 在優(yōu)選的實施方案中，所述檢測是定性檢測，即檢測樣品中是否存在偽狂犬病毒 gG抗體。
[0014] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述檢測是定量檢測，即檢測樣品中偽狂犬病毒gG 抗體的水平。
[0015] 本發(fā)明的另一方面提供一種非診斷目的鑒別樣品是偽狂犬病毒野毒感染動物樣 品還是gG缺失疫苗免疫動物樣品的方法，其特征在于，使用上述小片段gG抗原作為抗原， 通過基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法，檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體，如果樣品中存在 偽狂犬病毒gG抗體，則樣品感染偽狂犬病毒野毒，如果樣品中不存在偽狂犬病毒gG抗體， 則樣品為gG缺失疫苗免疫樣品。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于檢測偽狂犬病毒抗體的試劑盒，其中包含上述小 片段gG抗原
[0017] 在進一步的實施方案中，該試劑盒中進一步包含基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方 法所需的一種或多種試劑。
[0018] 在優(yōu)選的實施方案中，所述一種或多種試劑是間接ELISA方法所需的一種或多種 試劑，可以選自：96孔板、包被液、洗液、封閉液、樣品稀釋液、酶標二抗、顯色劑、終止液、陽 性對照、陰性對照以及其它所需的試劑。
[0019] 其中，包被液可以是pH9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，其中含Na2C03l. 59g/L， NaHC032. 93g/L)。
[0020] 其中，洗液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L，KH2PO4O. 27g/L、 0. 05% Tween-20, pH7. 2。
[0021] 其中，封閉液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L，KH2PO4O. 27g/L、 0· 05% Tween-20、BSA 50g/L〇
[0022] 其中，樣品稀釋液可以含有 NaCl 8g/L、KCl 0· 2g/L、Na2HPO4L 42g/L， KH2PO4O. 27g/L、0. 05% Tween-20, BSA lg/L，ρΗ7· 2〇
[0023] 其中，顯色液A液可以含有醋酸鈉27. 2g/L、檸檬酸27. 2g/L、30% H2O2O. 6ml/L，顯 色液 B 液可以含有 EDTA-Na 0· 4g/L、檸檬酸 I. 9g/L、甘油 100ml/L、TMB 0· 4g/L。
[0024] 其中，終止液可以是每L蒸餾水中含108. 5ml濃硫酸，逐滴加入。
[0025] 所述陽性對照可以是感染偽狂犬病毒野毒的動物的陽性血清，所述陰性對照可以 是未感染偽狂犬病毒野毒，也未接種偽狂犬病毒疫苗的動物的血清。
[0026] 本發(fā)明的另一方面提供上述小片段gG抗原、編碼上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述試劑盒在非診斷目的檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明的另一方面提供上述小片段gG抗原、編碼上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述試劑盒在非診斷目的鑒別樣品是偽狂犬病毒野毒感染動物樣品還是gG缺失疫苗免 疫動物樣品中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的另一方面提供上述小片段gG抗原、編碼上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述試劑盒在制備用于檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體的試劑中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明的另一方面提供上述小片段gG抗原、編碼上述小片段gG抗原的核酸序列 或上述試劑盒在制備用于鑒別樣品是偽狂犬病毒野毒感染動物樣品還是gG缺失疫苗免疫 動物樣品的試劑中的應(yīng)用。
[0030] 在優(yōu)選的實施方案中，在上述方法和應(yīng)用中，所述"檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗 體"可以是使用上述小片段gG抗原作為抗原，通過基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法，檢測 樣品中偽狂犬病毒gG抗體。
[0031 ] 在優(yōu)選的實施方案中，在上述方法和應(yīng)用中，所述"鑒別樣品是偽狂犬病毒野毒感 染動物樣品還是gG缺失疫苗免疫動物樣品"可以是使用上述小片段gG抗原作為抗原，通過 基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法，檢測樣品中偽狂犬病毒gG抗體，如果樣品中存在偽狂 犬病毒gG抗體，則樣品感染偽狂犬病毒野毒，如果樣品中不存在偽狂犬病毒gG抗體，則樣 品為gG缺失疫苗免疫樣品。
[0032] 在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法包括以下步 驟：（1)將上述小片段gG抗原固定于基質(zhì)上；（2)在適合于形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條 件下，使固定有上述小片段gG抗原的基質(zhì)與待測樣品接觸；（3)對形成的抗原抗體免疫復(fù) 合物進行檢測。
[0033] 在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法是間接 ELISA方法、乳膠凝集試驗或間接血凝試驗。
[0034] 在特別優(yōu)選的實施方案中，所述基于抗原抗體反應(yīng)的抗體檢測方法包括以下步 驟：（1)用純化的上述小片段gG抗原包被固相支持物；（2)在適合于形成抗原抗體免疫復(fù) 合物的條件下，使固定有上述小片段gG抗原的固相支持物與待測樣品溫育；（3)清洗除去 未結(jié)合的抗體；(4)加入經(jīng)標記的第二抗體，在適合于形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件下 溫育；（5)清洗