專利名稱：肝炎病毒多項免疫標志一孔測定法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于肝炎病毒免疫標志的酶免疫方法。
肝炎病毒的免疫標志主要有抗HAV(抗Hepatitis A virus，甲肝病毒抗體)、HBsAg(Hepatitis B surface Antigen，乙肝病毒表面抗原)、HBeAg(Hepatitis B e Antigen，乙肝病毒e抗原)、抗HBc(抗Hepatitis B core，乙肝病毒表面抗體)、抗HBe(抗Hepatitis B e，乙肝病毒e抗體)、抗HCV(抗Hepatitis C virus，丙肝病毒抗體)。這些病毒免疫標志經(jīng)常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢查。但這種酶免疫方法要使用多孔的酶標反應板，每孔只能檢查一個免疫標志，使用上很不方便。
本發(fā)明的目的在于提供一種在酶標反應板一孔中通過一次操作，即能同時顯示兩項或兩項以上肝炎病毒免疫標志的快速簡便的測定方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種相應于上述肝炎病毒免疫標志測定方法的酶標反應板。
通常的酶免疫吸附試驗法測定肝炎的免疫標志主要應用夾心法和競爭法兩種，檢查乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，乙肝病毒表面抗體(抗HBs)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)應用的是夾心法，存在免疫標志時顯色;反之，不顯色。乙肝病毒e抗體(抗HBe)和乙肝病毒核心抗體(抗HBc)采用的是競爭法，待檢抗體陽性時不顯色，否則顯色。這種酶免疫法先要將抗原或抗體包被(即吸附)在酶標反應板孔中，待檢血清中存在相對應的抗體或抗原時，就通過抗原、抗體間的反應結合到反應板上。然后同時加入的辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase簡寫為HRP)標記的抗原或抗體，通過待檢血清中的抗體或抗原結合到酶標反應板上(夾心法)，或受血清中抗體的競爭不能結合到板上(競爭法)，再加酶的底物溶液后，酶催化底物而顯色，從而確定待檢血清中是否存在抗原或抗體。由于抗原與相應抗體會起反應，酶標HBsAg和酶標抗HBs不能處于同一溶液中。因此，反應板上的同一個孔中只能測定一個免疫標志，各種酶標物需要分隔存放。但經(jīng)發(fā)明人研究證實，若將酶標板的每個孔分隔為2-5個小孔，各小孔中分別包被不同的抗原或抗體，則它們之間不會相互干擾影響，待檢血清中的各種肝炎病毒免疫標志會分別與小孔中包被的抗原或抗體相結合。并且，同一溶液中的酶標記物抗HBs-HRP，抗HBe-HRP和抗HBc-HRP不會相互反應。這種酶標記物混合液加入大孔中，又可各自與小孔中的抗原、抗體相結合。因此，可以通過加一次血樣和一次酶結合物，在一個大孔中能同時顯示肝炎病毒的多項免疫標志。
本發(fā)明將酶標反應板設計成下述形狀(如附

圖1-7所示)，一般長度為110-140mm，寬度為45-70mm，厚度為10-15mm，可安排4×10個大孔。實際上其大小及大孔數(shù)不受限制。關鍵是對大孔的設計。大孔(1)直徑一般為6-12mm，孔深10-14mm，將每個大孔分隔為2-5個小孔，每個小孔(2)底面積為5-15mm2，分隔層(3)高度為5-8mm，厚度為0.7-1.1mm。圖1為酶標反應板的結構示意圖。圖2、圖3為將大孔分隔為2個小孔的示意圖。圖4、圖5為將大孔分隔為3個小孔的一種結構示意圖。圖6、圖7為將大孔分隔為5個小孔的一種結構示意圖。本發(fā)明提出的測定肝炎病毒免疫標志的步驟如下在每個大孔的2-5個分隔小孔中分別包被不同的肝炎病毒免疫標志，即分別包被不同的抗原或抗體，包被物濃度為0.5-20ug/ml，反應條件一般為39℃±3℃，2-5小時，或者在6℃±2℃，15-48小時。試驗時，對每個大孔中分別加待檢血清，一般為0.05-0.2ml即可，同時各大孔中加入相應于小孔中包被的抗原或抗體的酶標記物的混合液0.1-0.3ml，在39℃±3℃中反應30-60分鐘。然后去除孔中液體。并用洗滌液洗去未結合物，加上四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物系統(tǒng)。一般每小孔中45-55ul，10分鐘左右后即在一個大孔中顯示待檢血清各項免疫標志的陰性或陽性結果。
在本發(fā)明提出的方法中，只要在酶標反應板的大孔的分隔小孔中任意選定包被物，并加入相對應的酶標記物的混合液，可以測定肝炎病毒免疫標志任意組合成的兩項以上的免疫標志。下面是各種常用組合的舉例如果在酶標反應板的一個大孔中的分隔小孔中分別包被抗HBs、抗HBe、HBcAg，則在酶標物反應步驟中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP、抗HBc-HRP酶標記物混合液，可以測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎核心抗體(抗HBc)三個免疫標志。
如果在酶標反應板的一個大孔的分隔小孔中分別包被HBsAg和HBeAg，則在酶標記物反應步驟中加入相應的HBsAg-HRP和抗HBe-HRP酶標記物混合液，可以測定乙型肝炎表面抗體(抗HBs)和乙型肝炎e抗體(抗HBe)兩個肝炎免疫標志。
如果在酶標反應板的一個大孔的分隔小孔中分別包被抗HBs、HBsAg、抗HBe、HBeAg和HBcAg，則在酶標物反應步驟中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP酶標記物混合液，可以測定HBsAg、HBeAg、抗HBc、抗HBs和抗HBe五項免疫標志。
如果在酶標反應板的一個大孔的分隔小孔中分別包被抗HBs和HCV抗原，則在酶標物反應步驟中加入相應的抗HBs-HRP和抗人IgG-HRP(抗人免疫球蛋白G酶標物)或HCV-HRP(丙肝病毒抗原酶標物)酶標記物混合液，可以測定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和丙型肝炎病毒抗體(抗HCV)。
如果在酶標反應板的一個大孔的分隔小孔中分別包被抗HBs，抗HBe和HCV抗原，則在酶標物反應步驟中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗人IgG-HRP(或HCV-HRP)的酶標記物混合液，可以測定HBsAg、HBeAg和抗HCV。
如果在酶標反應板的一個大孔的分隔小孔中分別包被HBs，抗HBe和HAV抗原，則在酶標物反應步驟中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗u-HRP(抗人u鏈酶標物)酶標記物混合液，可以測定HBsAg、HBeAg及甲型肝炎病毒抗體(抗HAV)(IgM)。
本發(fā)明與通常的測定方法相比，工作效率提高2-4倍，血清用量也為減少。按通常方法，乙肝病毒的五項免疫標志的測定，每份血清需同時加5次，在5個孔中反應，一次血清用量為0.5ml，酶標記物也加5次，分別在各個孔中反應。本發(fā)明可以將5個免疫標志在1個(或2個)孔中測定，加血清和酶標記物各1次(或2次)可同時顯示5個乙肝免疫標志的結果。對其它肝炎病毒免疫標志的混合檢測，工作效率同樣明顯提高，血清用量相應減少。
圖1為酶標反應板(條)的結構示意2為酶標反應板(條)上大孔分隔成2個小孔的結構側視圖。
圖3為酶標反應板(條)上大孔分隔成2個小孔的結構俯視圖。
圖4為酶標反應板(條)上大孔分隔成3個小孔的結構側視圖。
圖5為酶標反應板(條)上大孔分隔成3個小孔的結構俯視圖。
圖6為酶標反應板(條)上大孔分隔成5個小孔的結構側視圖。
圖7為酶標反應板(條)上大孔分隔成5個小孔的結構俯視圖。
實施例1在1孔3間隔小孔中同時包被抗HBe，抗HBs和HBcAg，加入含HBeAg、HBsAg和抗HBc同時陽性的血清0.2ml，同時加抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP混合液0.1ml，37℃溫箱中反應1小時，加TMB底物液后孔中3間隔小孔中均呈現(xiàn)陽性結果。
實施例2在1孔2間隔小孔中，同時包被HBsAg和HBeAg，加入含抗HBs和抗HBe同時陽性的血清(或抗HBs陽性血清中加已知的抗HBe陽性血清)0.2ml，同時加HBsAg-HRP和抗HBe-HRP混合液0.1ml，37℃溫箱中反應1小時，加TMB底物液后孔中2間隔區(qū)，測抗HBs的小孔顯色，而測抗HBe的小孔為無色，即兩個孔均顯示陽性結果。
實施例3在酶標反應板各小孔中分別包被抗HBs，HBsAg，抗HBe，HBeAg和HBcAg加HBsAg，HBeAg，抗HBc陽性血清0.2ml，37℃中反應1小時，加TMB底物系統(tǒng)，結果上述各包被小孔中分別為顯色、顯色、顯色、顯色和無色，即檢測結果為HBsAg、HBeAg、抗HBc陽性，而抗HBs和抗HBe為陰性。在上述包被孔中加抗HBs和抗HBe陽性血清，同時加上述酶標記物混合液后，底物系統(tǒng)顯色次序為無色、無色、無色、無色和顯色，即檢測結果為抗HBs和抗HBe陽性。
實施例4
在酶標反應板各小孔中分別包被抗HBs和HCV抗原，加HBsAg和抗HCV的陽性血清0.1-0.2ml。同時加抗HBs-HRP和HCV-HRP混合液0.1-0.2ml，37℃中反應1小時，加TMB底物后2個小孔中分別顯色，即檢測結果為HBsAg陽性和抗HCV陽性。
實施例5在酶標反應板各小孔中分別包被抗HBs和HAV抗原，加HBsAg和抗HAV陽性血清0.1-0.2ml，同時加抗HBs-HRP和抗人u-HRP混合液0.1-0.2ml，37℃反應1小時后加TMB底物液，2個小孔中均顯色，示HBsAg和抗HAV均為陽性。
權利要求
1.一種肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在酶標反應板的每個大孔的2-5個分隔小孔中分別包被不同的肝炎病毒免疫標志，其濃度為0.5-20ug/ml，反應條件為在39±3℃，2-5小時，或者6±2℃，15-48小時，對每個大孔中分別加入待檢血清0.05-0.2ml，同時在各大孔中加入相應于分隔小孔中包被的肝炎病毒免疫標志的酶標記物的混合液0.1-0.3ml，在39±3℃中反應30-60分鐘，然后除去孔中液體，每小孔中加上四甲基聯(lián)苯胺底物系統(tǒng)45-55ul，10分鐘后即在一個大孔中顯示待檢血清各項免疫標志的陰性或陽性結果。
2.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板的大孔中的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為抗HBs、抗HBe、HBcAg，則在大孔中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP、抗HBc-HRP酶標記物混合液以測定HBsAg、HBeAg抗HBc三個肝炎免疫標志。
3.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板的大孔的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為HBsAg和HBeAg，則在大孔中加入相應的HBsAg-HRP和抗HBe-HRP酶標記物的混合液，以測定抗HBs和抗HBe兩個肝炎免疫標志。
4.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板大孔的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為抗HBs、HBsAg、抗HBe、HBeAg和HBcAg，則在大孔中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗HBc-HRP酶標記物混合液，以測定HBsAg、HBeAg、抗HBc、抗HBs和抗HBe五項肝炎病毒免疫標志。
5.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板大孔的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為抗HBs和HCV抗原，則在大孔中加入相應的抗HBs-HRP和抗人IgG酶標記物(或HCV-HRP)混合液，以測定HBsAg和抗HCV。
6.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板的大孔的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為抗HBs、抗HBe和HCV抗原，則在大孔中加入相應的抗HBs-HRP，抗HBe-HRP和抗人IgG-HRP(或HCV-HRP)酶標記物混合液，以測定HBsAg、HBeAg和抗HCV。
7.根據(jù)權利要求1所述的肝炎病毒免疫標志的測定方法，其特征在于，酶標反應板大孔的分隔小孔中分別包被的肝炎病毒標志為抗HBs、抗HBe和HAV抗原，則在大孔中加入相應的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP和抗u-HRP酶標記物混合液，以測定HBsAg、HBeAg及抗HAV(IgM)。
8.一種用于測定肝炎病毒免疫標志的酶標反應板，厚度為10-15mm，其上開有直徑為6-12mm、孔深為10-14mm的大孔，其特征在于該大孔被分隔為2-5個小孔，小孔的底面積為5-15mm2，分隔層高度為5-8mm，厚度為0.7-1.1mm。
全文摘要
最常用的肝炎病毒免疫標志有HBsAg，抗HBs，HBeAg，抗HBe，抗HAV，抗HCV，實驗方法為反應板孔的酶免疫法，現(xiàn)用的檢測方法每孔只能顯示離體的(抽取的)血清中的一個肝炎病毒免疫標志。本發(fā)明將反應板孔按實際需要分為2—5個小孔，分別包被有不同的抗原和抗體，在加待檢血清后，同時加入相應的酶標記混合液，經(jīng)37℃—43℃中反應1小時，用TBM底物系統(tǒng)顯色，可以通過一次操作，在同一孔中同時測定兩個以上肝炎病毒免疫標志，比常規(guī)操作方法功效提高1—4倍。
文檔編號G01N33/576GK1098201SQ93112309
公開日1995年2月1日 申請日期1993年1月12日 優(yōu)先權日1993年1月12日
發(fā)明者程振球 申請人:中國人民解放軍海軍醫(yī)學研究所