本發(fā)明涉及一種治療肝炎和/或肝纖維化的藥物組合物及其制備方式和用途。

技術(shù)背景

肝炎是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞壞死，肝功能異常。肝炎類型有急性肝炎和慢性肝炎之分，急性肝炎和慢性肝炎主要區(qū)別在于病情是非。急性肝炎是指由于感染肝炎病毒引起肝臟病變，一般病程不超過6個月。慢性肝炎多是由急性乙肝，急性丙肝病程超過半年演變而成。另外，慢性肝炎還包括了那些不是病毒原因引起，但是臨床表現(xiàn)為慢性肝炎患者，包括脂肪肝患者、藥物性肝炎患者等。肝病患者普遍免疫功能低下，其最明顯的表現(xiàn)就是體內(nèi)的病毒難于完全清除，病情容易反復(fù)發(fā)作。部分急性肝炎患者在一定情況下還會轉(zhuǎn)變成為慢性肝炎，急性肝炎患者預(yù)后大多良好，90％以上的患者在3個月內(nèi)都可以痊愈，只有不到10％的人可轉(zhuǎn)變?yōu)槁赃w延性肝炎或慢性活動性肝炎，僅有1％-2％的患者會演變?yōu)楦斡不蚋伟?/p>

肝纖維化是指由多種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程。它不是一個獨立的疾病，許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化。我國是病毒性肝炎流行的高發(fā)區(qū)，慢性肝炎患者達(dá)到數(shù)千萬，其中又有約1/10-1/3可以發(fā)展成為肝硬化。目前認(rèn)為肝纖維化是可逆的，通過抗纖維化治療可使肝纖維化程度明顯減輕，早期肝硬化者肝臟假小葉消失。

目前國內(nèi)治療肝炎、肝纖維化主要采取下列措施：①去除病因、②細(xì)胞保護(hù)/抗氧化、③抗炎/免疫調(diào)節(jié)、④抑制肝星狀細(xì)胞活化、⑤調(diào)節(jié)ecm合成和降解、⑥促進(jìn)hsc凋亡、⑦刺激肝細(xì)胞再生。其治療目的是促使基因正常調(diào)控，而多數(shù)治療目前仍處于實驗研究階段，肝炎、肝纖維化的治療仍需不斷完善，目前療效確切和不良反應(yīng)少的抗纖維化藥物很少。并且，慢性肝損傷是肝纖維化及肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。研究發(fā)現(xiàn)通過有效治療可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的損傷，所以尋求能夠有效阻斷肝損傷抑制肝纖維化形成的藥物已經(jīng)成為慢性肝病治療中的關(guān)鍵問題。

在非專利文獻(xiàn)：星點設(shè)計—響應(yīng)面法優(yōu)選七珠膠囊成型工藝(現(xiàn)代中藥研究與實踐2016年第30卷第5期)中公開了七珠膠囊組合物使用治療肝炎的報道，但是經(jīng)過試驗驗證，其效果不能滿足實際臨床的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療肝炎和/或肝纖維化的中藥有效部位組合物及其制備方法。

本發(fā)明提供了一種治療肝炎和/或肝纖維化的藥物組合物，它是由如下重量配比的原料藥組成：楤木總皂苷0.02-0.10份、海棠總黃酮0.07-0.50份、葉下珠總多酚0.10-0.65份。

優(yōu)選地，所述組合物在治療急性肝炎時由如下重量配比的原料藥組成：楤木總皂苷0.025-0.05份、海棠總黃酮0.10-0.42份、葉下珠總多酚0.16-0.64份。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述組合物在治療急性肝炎時由如下重量配比的原料藥組成：楤木總皂苷0.025份、海棠總黃酮0.10份、葉下珠總多酚為0.32份。

優(yōu)選地，所述組合物在治療慢性肝炎和/或肝纖維化時由如下重量配比的原料藥組成：楤木總皂苷0.04--0.08份、海棠總黃酮0.075-0.30份、葉下珠總多酚0.11-0.30份。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述組合物在治療慢性肝炎和/或肝纖維化時由如下重量配比的原料藥組成：楤木總皂苷0.08份、海棠總黃酮0.30份、葉下珠總多酚為0.22份。

其中，所述楤木總皂苷、海棠總黃酮、葉下珠總多酚是分別用太白楤木、湖北海棠、葉下珠為原材料，采用水或有機(jī)溶劑提取制備得到。

其中，所述原料藥制備方式包括如下步驟：

取太白楤木，加乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮，離心，提取液過大孔樹脂吸附，水洗除雜，然后乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得；

取葉下珠，加乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮，離心，取上清液過大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得；

取湖北海棠，加乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮，離心，取上清液過大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得。

優(yōu)選地，楤木總皂苷提取方式是用太白楤木重量的3-15倍的濃度為10％-95％的乙醇回流提取3次，每次1小時，提取濃縮指標(biāo)為含生藥量0.1-0.5g/ml；優(yōu)選地，乙醇用量為太白楤木重量的13倍的濃度為70％的乙醇，生藥含量為0.25g/ml；

葉下珠總多酚提取方式是用葉下珠重量的3-12倍的濃度為10％-95％的乙醇回流提取3次，每次1小時，提取濃縮指標(biāo)為含生藥量0.1-0.5g/ml；優(yōu)選地，乙醇用量分別是葉下珠重量的10倍、8倍、8倍的濃度為50％的乙醇，生藥含量為0.2g/ml；

海棠總黃酮提取方式是用湖北海棠重量的3-12倍的濃度為10％-95％的乙醇回流提取2次，每次150min，提取濃縮指標(biāo)為含生藥量0.1-0.5g/ml；優(yōu)選地，乙醇用量為湖北海棠重量的8倍的濃度為70％的乙醇，生藥含量為0.15g/ml；

優(yōu)選地，步驟b中，減壓回收乙醇條件是70～75℃，－0.07～－0.08mpa。

優(yōu)選地，步驟b中，分離精制楤木總皂苷、葉下珠總多酚、海棠總黃酮的大孔吸附樹脂型號分別為：hpd100型大孔吸附樹脂、hpd100型大孔吸附樹脂、hpd100型大孔吸附樹脂。

其中，楤木總皂苷、葉下珠總多酚、海棠總黃酮的洗脫方式是分別用與提取方式濃度相同的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度分別為：1bv/h、2bv/h、1bv/h。

其中，該藥物組合物是由所述原料藥為活性成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。

其中，所述輔料是乳糖，糖粉，微晶纖維素，糊精，淀粉，聚乙二醇中的一種或多種。

其中，所述劑型為口服制劑。

其中，所述口服制劑為片劑，顆粒劑，膠囊劑，散劑，丸劑，口服液，糖漿劑，煎膏劑。

本發(fā)明提供了所述藥物組合物的制備方法，它包括如下步驟：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入輔料，干燥，即得。

本發(fā)明提供了所述藥物組合物在制備具有解毒祛濕、疏肝化瘀功效的藥物中的用途。

本發(fā)明提供了所述藥物組合物在制備治療肝炎和/或肝纖維化的藥物中的用途。

其中，所述肝炎為急性肝炎和/或慢性肝炎。

本發(fā)明藥物組合物治療肝炎、肝纖維化的效果非常優(yōu)良，優(yōu)于三種組分單獨使用，也優(yōu)于三種藥物的組合使用，為臨床治療肝炎、肝纖維化提供了一種新的選擇。

根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖

圖2本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝臟指數(shù)的影響

圖3本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷血清中alt、ast的影響

圖4本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織形態(tài)學(xué)變化的影響(he染色，×200)

圖5本發(fā)明對ccl4致慢性肝損傷大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化的影響(masson染色，×200)

圖6本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織sod,gsh-px的影響

圖7本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織mda的影響

圖8本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織tnf-α表達(dá)的影響(×200)

圖9本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織nf-kb表達(dá)的影響(×200)

具體實施方式

實施例1本發(fā)明治療急性肝炎的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.025g、海棠總黃酮0.1g、葉下珠總多酚0.32g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取3次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取3次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入輔料(乳糖:糊精＝4:1)、輔料用量為浸膏的2倍，用90％乙醇制粒，干燥，即得。

實施例2本發(fā)明治療急性肝炎的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.05g、海棠總黃酮0.28g、葉下珠總多酚為0.19g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取3次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取三次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)混勻，填入膠囊，即得。

實施例3本發(fā)明治療急性肝炎的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.03g、海棠總黃酮0.35g、葉下珠總多酚為0.50g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取三次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取三次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入1倍量淀粉、糊精，混合均勻，90乙醇制粒，壓片，即得。

實施例4本發(fā)明治療慢性肝炎、肝纖維化的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.08g、海棠總黃酮0.30g、葉下珠總多酚為0.25g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取三次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取三次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入1倍量乳糖，混合均勻，包裝，即得。

實施例5本發(fā)明治療慢性肝炎、肝纖維化的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.05g、海棠總黃酮0.20g、葉下珠總多酚為0.11g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取三次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取三次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入1倍量乳糖，微晶纖維素，混合均勻，90％乙醇制粒，壓片，即得。

實施例6本發(fā)明治療慢性肝炎、肝纖維化的藥物組合物的制備

1.原料：楤木總皂苷0.06g、海棠總黃酮0.25g、葉下珠總多酚為0.15g。

2.原料制備方式：

楤木總皂苷：取太白楤木，加13倍量的濃度為70％的乙醇回流提取三次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，提取液過hpd100型大孔樹脂吸附，去離子水水洗除雜，然后乙醇洗脫；收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得楤木總皂苷；

葉下珠總多酚：取葉下珠，加濃度為50％的乙醇回流提取三次(乙醇用量：10倍、8倍、8倍)，每次1小時，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔吸附樹脂，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得葉下珠總多酚；

海棠總黃酮：取湖北海棠，加8倍量的濃度為70％乙醇，回流提取2次，每次150min，提取液減壓回收乙醇(70～75℃，－0.07～－0.08mpa)，濃縮，離心，取上清液過hpd100型大孔樹脂柱，先以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇、濃縮、干燥，粉碎成細(xì)粉，即得海棠總黃酮。

3.組合物制備方式：

a)稱取各重量配比的原料藥；

b)加入1倍量乳糖、微晶纖維素，混合均勻，制粒，填入膠囊，即得。以下通過試驗例具體說明本發(fā)明的有益效果。

實驗例1本發(fā)明抗ccl4致小鼠急性肝損傷

實驗以太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚三個有效部位為自變量，進(jìn)行配伍組方，以ast，alt的綜合評分為因變量，將各數(shù)據(jù)輸入軟件中，從圖上的較佳區(qū)域直接讀出本發(fā)明最佳配比。

1材料與儀器

1.1實驗動物

健康清潔級昆明種小鼠136只，雌雄各半，體重20±2g，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(陜)2012-003。

1.2實驗藥物

太白楤木藥材購于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為五加科(araliaceae)植物太白楤木(araliataibaiensis)的根皮；湖北海棠藥材購自湖北神農(nóng)架藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為蘋果屬(malusmill.)湖北海棠(malushupehensis(pamp.)rehd)的干燥葉；葉下珠藥材購自陜西昊源中藥飲片有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：20140818)；四氯化碳(天津天士力化學(xué)試劑有限公司，批號：20140228)；橄欖油(廣州花之王化工有限公司，批號：20140528)，所用其它試劑均為分析純。

1.3試劑與儀器

alt試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20140909)，ast試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20140923)，bac蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20140914)；centrifuge5417r臺式冷凍高速離心機(jī)(germanyeppendorf)，jj-2組織搗碎勻漿機(jī)(金壇市富華儀器有限公司)，hhs-4a電熱恒溫水浴鍋(滬越實驗儀器廠)，ja2003型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，bio-radmodel680酶標(biāo)儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)，jjq-p2016j生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，zeiss顯微鏡(德國蔡司公司，型號imagera1)。

2方法與結(jié)果

2.1試驗方法

2.1.1實驗分組

取昆明種小鼠136只，按照體重均衡隨機(jī)分組(每組小鼠體重進(jìn)行方差分析，p>0.5)：每組8只，總計17組。將本發(fā)明各組分作為考察因子，以太白楤木總皂苷，湖北海棠總黃酮，葉下珠總多酚為因素，每個因素各取3個水平，水平分別在前期實驗篩選結(jié)果確定的有效劑量范圍內(nèi)均勻選取。

2.1.2造模方法

取潔凈級昆明種小鼠136只，雌雄各半，體重20±2g，按體重隨機(jī)分為17組，每組8只，雌雄分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5d。各藥物組均按表2所設(shè)計劑量進(jìn)行灌胃給藥，聯(lián)苯雙酯組按125mg/kg灌胃給藥，空白對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥7天，1次/d。末次給藥后2h，除空白對照組外，其余各組將0.1％的ccl4橄欖油溶液按0.1ml/10g進(jìn)行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。

2.1.3取材

末次給藥后禁食不禁水。16h后摘眼球取血，3500rmp/min離心10min，上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4血清生化指標(biāo)alt、ast的測定

均按試劑盒說明書具體步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測定結(jié)果。

2.2配比

三個因素：楤木總皂苷(x1)、海棠總黃酮(x2)、葉下珠總多酚(x3)，每個因素在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)三個水平，用代碼值-1、0、1來表示。因素水平見表1，實驗安排和結(jié)果見表2。

表1設(shè)計因素與水平表

表2試驗設(shè)計與結(jié)果表

注：1,4,12,14,16號為重復(fù)實驗

ast、alt為負(fù)向指標(biāo)，d＝(ymax-yi)/(ymax-ymin)

通過表2可以看出，實驗組2、6～10改善ast水平、alt水平效果優(yōu)良，同時，實驗組6號為最優(yōu)組。本發(fā)明優(yōu)選用量配比為：楤木總皂苷：0.025-0.050g/kg、海棠總黃酮：0.10-0.42g/kg、葉下珠總多酚：0.16-0.64g/kg；進(jìn)一步優(yōu)選地，最優(yōu)用量配比為：楤木總皂苷：海棠總黃酮：葉下珠總多酚0.025g/kg：0.10g/kg：0.32g/kg。

2.3本發(fā)明藥物與單味有效部位及合提藥物的比較試驗

取潔凈級昆明種小鼠48只，雌雄各半，體重20±2g，按體重隨機(jī)分為8組，每組6只，雌雄分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5d。各藥物組按照表3設(shè)計進(jìn)行灌胃給藥，聯(lián)苯雙酯組按125mg/kg灌胃給藥，空白對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥7天，1次/d。末次給藥后2h，除空白對照組外，其余各組將0.1％的ccl4橄欖油溶液按0.1ml/10g進(jìn)行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水。16h后摘眼球取血，3500rmp/min離心10min，上清液-20℃保存?zhèn)溆?。分離肝組織，按試劑盒說明書具體步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測定血清及肝組織中alt、ast含量。實驗結(jié)果見表3、表4。

表3本發(fā)明各組分對ccl4致小鼠急性肝損傷血清中alt、ast的影響

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01；與本發(fā)明配伍組相比^δp<0.05，^δδp<0.01

表4本發(fā)明各組分對ccl4致小鼠急性肝損傷肝組織中alt、ast的影響

注：①與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01；與本發(fā)明配伍組相比^δp<0.05，^δδp<0.01

②三藥合提組：為三種原料藥加水煎煮提取得到的浸膏粉，最佳配伍組的劑量與三藥合提組的劑量均相當(dāng)于原藥材9g。

結(jié)果表明，三藥配伍后，均可顯著降低小鼠血清及肝組織中alt、ast含量。本發(fā)明配伍組與單個有效部位組相比，均具有顯著性差異(p<0.01)，與三藥合提組相比，具有顯著性差異(p<0.01)。本發(fā)明配伍后，療效優(yōu)于三組組分單獨使用的療效，優(yōu)于三藥合提組藥物使用療效，表明活性組分之間發(fā)揮了協(xié)同增效的作用。

實驗例2本發(fā)明各組分對慢性肝損傷大鼠保護(hù)作用

1.材料和儀器

1.1實驗動物

健康清潔級wistar大鼠90只，雌雄各半，體重200±20g，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(陜)2012-003。

1.2實驗藥物

太白楤木藥材購于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為五加科(araliaceae)植物太白楤木(araliataibaiensis)的根皮；湖北海棠藥材購自湖北神農(nóng)架藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為蘋果屬(malusmill.)湖北海棠(malushupehensis(pamp.)rehd)的干燥葉；葉下珠藥材購自陜西昊源中藥飲片有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：20140818)；四氯化碳(天津天士力化學(xué)試劑有限公司，批號：20140228)；橄欖油(廣州花之王化工有限公司，批號：20140528)，所用其它試劑均為分析純。

1.3試劑與儀器

alt試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20140909)，ast試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20140923)，bac蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20140914)；centrifuge5417r臺式冷凍高速離心機(jī)(germanyeppendorf)，jj-2組織搗碎勻漿機(jī)(金壇市富華儀器有限公司)，hhs-4a電熱恒溫水浴鍋(滬越實驗儀器廠)，ja2003型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，bio-radmodel680酶標(biāo)儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)，jjq-p2016j生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，zeiss顯微鏡(德國蔡司公司，型號imagera1)。

2.實驗

2.1實驗分組與給藥方法

取wistar大鼠90只，每組10只，按照體重均衡隨機(jī)分組：按照正交試驗設(shè)計因素水平表設(shè)計的9組不同的配伍比例。以湖北海棠總黃酮、太白楤木總皂苷和葉下珠總多酚三種有效部位為影響因素，結(jié)合藥材、提取物有效部位含量、各組分有效劑量篩選結(jié)果及臨床用量確定動物實驗中各提取物的3個給藥劑量，采用表5實驗表進(jìn)行試驗設(shè)計。藥物配比的因素水平見表6，根據(jù)表5組成不同劑量配比的1-9號本發(fā)明有效部位進(jìn)行配伍。

表5因素水平表

表6試驗表

2.2造模

取wistar大鼠90只，隨機(jī)分為9組，每組10只，置溫度(25±1)℃，相對濕度(40％～65％)的實驗室，適應(yīng)環(huán)境7d后試驗。從造模第一日起，空白對照組和模型組給予等體積蒸餾水；陽性對照組(聯(lián)苯雙酯組)在造模同時給予聯(lián)苯雙酯滴丸水溶液治療；藥物組在造模同時給予太白楤木醇提物水溶液和湖北海棠醇提物水溶液治療，1次/d，連續(xù)8周。末次注射ccl416h后，戊巴比妥5mg/100g腹腔注射麻醉大鼠，蛙板固定大鼠，腹主動脈取血，然后猝死動物，檢測各項指標(biāo)。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1一般情況

每周兩次觀察動物活動、狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、大便等一般情況。

2.3.2加權(quán)法綜合評價本發(fā)明組分配伍試驗

腹主動脈取血，分離血清，分別測定大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶ast)、通過加權(quán)評分值綜合評價本發(fā)明不同組分配伍對大鼠慢性肝損傷肝臟保護(hù)作用。

2.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用spss11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用方差分析。p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1實驗期間大鼠的一般狀況

空白對照組大鼠生長狀況良好，飲食規(guī)律，毛色光澤，ccl4模型組大鼠在實驗第5d開始出現(xiàn)精神不振、被毛蓬松、背弓，對早期死亡大鼠進(jìn)行解剖，清楚可見腹腔有大量透明狀積液，并可見肝臟呈花斑樣改變，晚期死亡大鼠解剖可見，肝臟表面有白色膜覆蓋，質(zhì)地堅硬，肛周周圍潮濕，體形瘦弱。陽性對照組和藥物組大鼠的狀況較模型組有改善。

3.試驗結(jié)果

按照設(shè)計表條件進(jìn)行試驗，分別測定大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)、脂質(zhì)過氧化sod、mda和gsh-px活性。采用綜合評價中的topsis法，對試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，綜合評分結(jié)果見表7。

表7試驗結(jié)果

sod、gsh-px為正向指標(biāo)，d＝(ymin-yi)/(ymax-ymin)

注：ast、alt、mda為負(fù)向指標(biāo)，d＝(ymax-yi)/(ymax-ymin)

3.3結(jié)果分析

通過表7可以看出，實驗組4、8、9試驗效果優(yōu)良，同時，實驗組9為最優(yōu)實驗組。本發(fā)明根據(jù)實驗結(jié)果得出的最佳用量范圍為：楤木總皂苷：0.04-0.08g/kg，海棠總黃酮：0.075-0.30g/kg，葉下珠總多酚：0.11-0.22g/kg。進(jìn)一步優(yōu)選地，最佳配比用量為：楤木總皂苷：海棠總黃酮：葉下珠總多酚0.08g/kg:0.30g/kg:0.22g/kg。

實驗例3本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷藥效實驗及保肝機(jī)制初步研究

1.材料和儀器

1.1實驗動物

健康清潔級wistar大鼠60只，雌雄各半，體重200±20g，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(陜)2012-003。

1.2實驗藥物

太白楤木藥材購于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為五加科(araliaceae)植物太白楤木(araliataibaiensis)的根皮；湖北海棠藥材購自湖北神農(nóng)架藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為蘋果屬(malusmill.)湖北海棠(malushupehensis(pamp.)rehd)的干燥葉；葉下珠藥材購自陜西昊源中藥飲片有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：20140818)；四氯化碳(天津天士力化學(xué)試劑有限公司，批號：20140228)；橄欖油(廣州花之王化工有限公司，批號：20140528)，所用其它試劑均為分析純。

1.3試劑與儀器

alt試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20150723)，ast試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20150519)，bac蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：20150514)，超氧化物歧化酶(sod)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20150518)，丙二醛(mda)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20150404)，谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20150908)，兔抗tnf-α、nf-kb多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：20150628)，免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：20150618)。

centrifuge5417r臺式冷凍高速離心機(jī)(germanyeppendorf)，jj-2組織搗碎勻漿機(jī)(金壇市富華儀器有限公司)，hhs-4a電熱恒溫水浴鍋(滬越實驗儀器廠)，ja2003型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，bio-radmodel680酶標(biāo)儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)，jjq-p2016j生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，zeiss顯微鏡(德國蔡司公司，型號imagera1)。

2方法與結(jié)果

2.1試驗方法

2.1.1分組及給藥

取wistar大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，置溫度(25±1)℃，相對濕度(40％～65％)的實驗室，適應(yīng)環(huán)境7d后試驗。用本發(fā)明最佳配伍結(jié)果，即楤木總皂苷0.08g/kg：海棠總黃酮0.30g/kg：葉下珠總多酚0.22g/kg組合為給藥中劑量(0.6g/kg)組，中劑量×2為高劑量(1.2g/kg)組，中劑量×0.5為低劑量(0.3g/kg)組。除空白組外，其余各組大鼠給予腹腔注射40％ccl4橄欖油溶液(容積為3ml·kg－1，2次/w，周一、周五各一次，連續(xù)8周。從造模第一日起，空白對照組和模型組給予等體積蒸餾水；陽性對照組(聯(lián)苯雙酯組)在造模同時給予聯(lián)苯雙酯滴丸水溶液治療；治療組在造模同時給予本發(fā)明水溶液治療，1次/d，連續(xù)8周。

2.1.2取材

末次注射ccl416h后，戊巴比妥5mg/100g腹腔注射麻醉大鼠，蛙板固定大鼠，腹主動脈取血，收集血液，3000r·min-1離心10min，取上清液，分離血清，-20℃冰箱保存；同時立即剖取肝臟，取0.5g肝組織，剪碎，放于玻璃勻漿器中，加預(yù)冷的9倍體積的0.9％生理鹽水，2500rmp離心10min，上清液-20℃保存?zhèn)溆?。剩余肝組織浸泡于10％甲醛溶液中固定。

2.2觀察指標(biāo)

2.2.1一般情況

每周觀察大鼠活動、狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、大便及體重變化等一般情況；

2.2.2肝臟指數(shù)的檢測

實驗結(jié)束后，稱量體質(zhì)量后麻醉取肝臟并稱重肝質(zhì)量，計算肝臟系數(shù)＝(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)；

2.2.3血清及肝組織勻漿中alt、ast含量檢測

腹主動脈取血，分離血清，置－20℃保存，酶標(biāo)儀檢測血清及肝組織勻漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)含量。

2.2.4肝臟組織he染色

取肝組織置于10％福爾馬林溶液中固定24h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅he染色。光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.2.5肝組織masson染色

操作嚴(yán)格按照masson染色試劑盒說明書要求進(jìn)行。

2.2.6血清抗氧化指標(biāo)的檢測

elisa法檢測血清中sod、gsh-px、mda活性的變化，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

2.2.7肝組織炎癥因子tnf-α、nf-kb表達(dá)的檢測

取肝組織置于10％福爾馬林溶液中固定24h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟至水后，后續(xù)操作按照tnf-α、nf-kb一抗、二抗及dab染色試劑盒說明書要求嚴(yán)格進(jìn)行。

2.2.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用spss11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用方差分析。p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3結(jié)果

2.3.1本發(fā)明對ccl4致慢性損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響

實驗前各組大鼠體重基本一致。使用ccl4造模后，大鼠體重增長速度與空白對照組比較顯著減慢(p<0.01)，本發(fā)明藥物組均不同程度降低肝臟指數(shù)，與模型組相比均有顯著差異(p<0.01)，結(jié)果見表8，圖2。

表8本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝臟指數(shù)的影響

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01

2.3.2本發(fā)明對ccl4致大慢性肝損傷鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

模型組大鼠血清中alt、ast含量與空白對照組比較明顯升高，差異有顯著性(p＜0.01)。與模型組相比，陽性組和本發(fā)明高、中、低劑量組均能抑制alt、ast水平的升高，結(jié)果見表9，圖3。

表9本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷血清中alt、ast的影響(iu/l)

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01

2.3.3肝組織形態(tài)學(xué)變化

2.3.3.1肉眼觀察

空白對照組大鼠肝臟表面光滑，柔軟，顏色深紅。模型組大鼠肝臟表面粗糙，被有大量結(jié)節(jié)，肝質(zhì)地較硬且脆，邊緣銳利，觸之有油膩感。與模型組比較，本發(fā)明治療組大鼠的肝臟略顯腫大，質(zhì)地柔軟，表面較光滑。

2.3.3.2he染色下肝組織形態(tài)學(xué)變化

he染色顯示，空白對照組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞繞中央靜脈放射狀排列，未發(fā)生纖維增生及炎細(xì)胞浸潤；模型對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，中央靜脈粗大，肝臟膠原纖維條索分割、圍繞肝小葉排列，形成假小葉，肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重、脂肪變性，大量炎細(xì)胞浸潤；與模型組進(jìn)行比較，本發(fā)明治療組對破壞的大鼠肝組織有不同程度改善，其中中劑量治療組和高劑量治療組的肝組織破壞顯著減輕，纖維增生減少，炎細(xì)胞浸潤減少。結(jié)果見圖4。

2.3.3.3masson染色下肝組織形態(tài)學(xué)變化

masson染色結(jié)果顯示，空白對照組未見肝組織纖維化。模型組門管區(qū)纖維組織增生明顯，纖維間隔形成，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞。與模型組比較，在本發(fā)明不同濃度給藥組，肝組織纖維化程度隨給藥濃度增加明顯減輕，在高劑量組仍可在門管區(qū)見到少量纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。結(jié)果見圖5。

2.3.4本發(fā)明對ccl4致慢性肝損傷大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化損傷的影響

與空白對照組相比，模型組肝組織勻漿中sod和gsh-px活性降低顯著(p<0.01)，mda含量顯著升高(p<0.01)；與模型組相比，本發(fā)明低、中、高劑量組及陽性組均可不同程度地提高肝組織中sod和gsh-px活性，降低mda含量(p<0.01)，結(jié)果見表10，圖6-7。

表10本發(fā)明對ccl4致大鼠慢性肝損傷肝組織脂質(zhì)過氧化損傷的影響

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01

2.3.5本發(fā)明對ccl4致慢性肝損傷大鼠肝組織炎癥因子表達(dá)的影響

2.3.5.1本發(fā)明對ccl4致慢性肝損傷大鼠肝組織tnf-a表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示：空白對照組大鼠肝組織中tnf-α幾乎沒有表達(dá)。模型組中，肝細(xì)胞胞漿及胞核中均可見到大量棕黃色顆粒，tnf-α高表達(dá)。與模型組相比，本發(fā)明治療組tnf-α表達(dá)均有不同程度的減少，其中中、高劑量組最為顯著(p<0.01)。結(jié)果見表11，圖8。

表11本發(fā)明對ccl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷肝tnf-α因子表達(dá)的影響

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01

2.3.5.2本發(fā)明對ccl4致慢性肝損傷大鼠肝組織nf-kb表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟nf-kb陽性細(xì)胞集中分布在中央靜脈，肝細(xì)胞壞死灶周圍細(xì)胞的細(xì)胞漿液中，其nf-kb表達(dá)的強(qiáng)度顯著大于空白對照組。與模型組相比較，本發(fā)明藥物組和陽性組的nf-kb陽性表達(dá)均有減少，其中本發(fā)明中劑量和高劑量組較為顯著(p<0.01)。結(jié)果見表12，圖9。

表12本發(fā)明對ccl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷肝nf-kb因子表達(dá)的影響

注：與空白對照組相比^##p<0.01；與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01

結(jié)果表明，本發(fā)明能降低ccl4引起的血清中ast、alt升高；he，masson染色觀察，本發(fā)明治療組對大鼠肝組織纖維增生、炎細(xì)胞浸潤及肝小葉結(jié)構(gòu)破壞有不同程度改善，中、高劑量組尤為明顯；能夠增強(qiáng)肝組織勻漿中sod、gsh-px活性，降低mda含量。tnf-a是由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的17kd非糖蛋白，在生命科學(xué)領(lǐng)域被認(rèn)為是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的“禍?zhǔn)滓蜃印?。tnf-a的生物學(xué)活性很廣泛，對免疫反映、炎癥反應(yīng)、機(jī)體代謝等均有重要調(diào)節(jié)的任務(wù)及介導(dǎo)作用，tnf-a參與ccl4的致病化學(xué)性肝損傷作用主要原因是激活了中性粒細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)其吞噬、氧爆發(fā)等效應(yīng)，活化nf—kb。一般情況下，細(xì)胞的nf-kb是處在未活化狀態(tài)，當(dāng)炎細(xì)胞受到如tnf-a等細(xì)胞外信號的刺激時，能夠?qū)е耼f-kb的活化，nf-kb激活后,可增強(qiáng)tnf-a基因轉(zhuǎn)錄，使tnf-ab產(chǎn)生及釋放增多并且炎性細(xì)胞被激活，進(jìn)一步激活了nf-kb，形成了一個正反饋調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)不斷放大。免疫組化檢測tnf-α及nf-kb在模型組肝組織陽性表達(dá)顯著，本發(fā)明中、高劑量其陽性表達(dá)明顯減少，統(tǒng)計學(xué)分析，其差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，治療組效果更加顯著。

本發(fā)明對ccl4誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷具有明顯保護(hù)作用。其可能機(jī)制為：提高機(jī)體的抗氧化能力，降低細(xì)胞自由基損傷，抑制炎癥因子表達(dá)，減小炎癥細(xì)胞的浸潤。進(jìn)一步證實了優(yōu)選出的本發(fā)明組分配伍的有效性。

綜上所述，本發(fā)明藥物組合物治療肝炎、肝纖維化的效果非常優(yōu)良，優(yōu)于三種組分單獨使用，也優(yōu)于三種藥物的組合使用，為臨床治療肝炎、肝纖維化提供了一種新的選擇。