本發(fā)明涉及中藥山芝麻提取物的用途，具體地說是山芝麻酸甲酯為原料在制備治療四氯化碳引起的化學(xué)性肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的必經(jīng)病理環(huán)節(jié)，發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅著廣大人民群眾的身體健康，然而，臨床研究慢性肝病肝纖維化常常受到許多客觀條件的限制，所以采用動(dòng)物模型手段研究肝纖維化已受到普遍重視并廣為接受。四氯化碳(CCl₄)是誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型最廣泛應(yīng)用的肝毒性物質(zhì)，它誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)的某些方面與人肝纖維化相似，是國內(nèi)外常用的肝纖維化模型。研究表明肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)至正常的可能，因此阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程成為治療慢性肝病的重要策略。

目前，臨床對肝纖維化的治療仍沒有明確的方案和有效治療藥物。近些年來，國內(nèi)外大量研究表明天然藥物和中藥在治療肝纖維化方面顯示出了可靠療效和較少不良反應(yīng)的特點(diǎn)。因此采用現(xiàn)代化技術(shù)從天然藥物和中藥中開發(fā)治療肝纖維化的新藥具有重要意義。

山芝麻作為一種傳統(tǒng)草藥，為梧桐科山芝麻屬植物山芝麻Helictercs angustifolia L.，具有抗病毒，抗脂質(zhì)氧化及護(hù)肝等多方面的作用，其活性成分之一山芝麻酸甲酯(methyl helicterate，MH)對CCl₄誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥、肝纖維化的作用仍知之不多。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過對山芝麻酸甲酯治療化學(xué)性肝纖維化進(jìn)行研究，開發(fā)山芝麻酸甲酯為原料在制備治療四氯化碳引起的化學(xué)性肝纖維化藥物的新用途。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)研究而完成的。研究分兩大部分：

一、山芝麻酸甲酯的制備

提取方法：10kg山芝麻藥材粉碎后，用80L 80％乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提取液，真空回收乙醇，得到乙醇提取物；然后乙醇提取物加蒸餾水重懸，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，乙酸乙酯層萃取物溶解在熱水中，過濾，濃縮后得到黃色粉末粗產(chǎn)物，接著上硅膠柱進(jìn)一步分離，采用氯仿和甲醇混合物進(jìn)行梯度洗脫，用薄層色譜收集相同組份，其中，第2組分上ODS柱和高效液相色譜進(jìn)一步純化，最后得到白色晶體山芝麻酸甲酯。

二、山芝麻酸甲酯治療CCl₄誘導(dǎo)肝纖維藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

將SD雄性大鼠以CCl₄誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，觀察山芝麻酸甲酯治療化學(xué)性肝纖維化的作用。結(jié)果表明山芝麻酸甲酯能明顯降低血清谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)的水平；肝組織前列腺素E2(PGE2)的含量；血漿白細(xì)胞介素-6(IL-6)，人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，髓過氧化物酶(MPO)的水平；降低肝組織及血清丙二醛(MDA)的水平，顯著提高肝組織超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(catalase)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，谷胱甘肽還原酶(GSH-Rd)的活性，提示滿天星異葒草苷具有抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用。

H&E染色病理檢查結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰且完整，以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見變性或壞死。模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變，肝小葉被破壞，或肝局灶性壞死以及淋巴細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象。山芝麻酸甲酯組大鼠可觀察到肝組織病理損傷比模型組明顯減輕。

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法和比色法分別測定NF-κB p65和細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)的活性，結(jié)果表明，與模型組比較，山芝麻酸甲酯可明顯抑制NF-κB p65，CYP2E1的活性。

免疫組化法測定Fas，F(xiàn)asL和CYP2E1的表達(dá)，結(jié)果表明，與模型組比較，山芝麻酸甲酯可明顯抑制Fas，F(xiàn)asL和CYP2E1的表達(dá)。

Western blot法測定大鼠肝組織誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧酶(COX-2)、胱天蛋白酶3(caspase-3)，胱天蛋白酶8(caspase-8)的表達(dá)，結(jié)果表明，與模型組比較，山芝麻酸甲酯可明顯抑制iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明開發(fā)了山芝麻酸甲酯在制備治療四氯化碳引起的化學(xué)性肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

所述的山芝麻酸甲酯是應(yīng)用于治療四氯化碳引起的化學(xué)性慢性肝損傷。

所述的山芝麻酸甲酯是應(yīng)用于治療四氯化碳引起的肝臟炎癥。

所述的山芝麻酸甲酯是應(yīng)用于治療四氯化碳引起的化學(xué)性肝纖維化。

總之，本發(fā)明首次對中藥活性成分山芝麻酸甲酯治療化學(xué)性肝纖維化進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)表明，山芝麻酸甲酯可作用于化學(xué)性肝纖維化的多個(gè)環(huán)節(jié)或多個(gè)靶點(diǎn)，可有效的抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、清除氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)、減輕肝組織病理損傷、活化NF-κB、下調(diào)Fas/FasL和CYP2E1的水平，使肝損傷明顯減輕，對防治肝損傷具有獨(dú)特優(yōu)勢。山芝麻酸甲酯對CCl₄引起的肝損傷具有明顯抑制作用，是治療化學(xué)性肝纖維化的一種非常有潛在價(jià)值的新藥。

具體實(shí)施方式

一、山芝麻酸甲酯的制備

提取方法：10kg山芝麻藥材粉碎后，用80L 80％乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提取液，真空回收乙醇，得到乙醇提取物248.7g。然后乙醇提取物加蒸餾水重懸，依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。乙酸乙酯層萃取物溶解在熱水中，0.45um濾頭過濾，濃縮后得到黃色粉末粗產(chǎn)物(51.6g)，接著上硅膠柱(200～300目)進(jìn)一步分離，采用氯仿和甲醇(0～100％甲醇，1500mL/餾分)混合物進(jìn)行梯度洗脫，用薄層色譜收集相同組份，其中，第2組分上ODS柱和高效液相色譜進(jìn)一步純化，最后得到白色晶體(22.3g)。

光譜檢測數(shù)據(jù)：ESI-MS(m/z)：655[M+Na]+；1H NMR(CDCl₃,400MHz)d:8.02(2H,dd,J＝7.9,1.7Hz,H-20,-60),7.58(1H,t,J＝7.4Hz,H-40),7.45(2H,t,J＝7.7Hz,H-30,-50),4.74(1H,brs,H-29a),4.63(1H,brs,H-29b),4.45(1H,dd,J＝11.2,5.0Hz,H-3),3.68(3H,s,17-COOCH₃),3.02(1H,m,H-19),2.02(3H,s,3-OCOCH₃),1.71(3H,s,H-30),1.02(3H,s,H-24),0.89(3H,s,H-25),0.82(3H,s,H-26),0.79(3H,s,H-23).13C NMR(CDCl₃,100MHz)d:176.6(C-28),170.8(3-OCOCH₃),166.9(27-CH₂OCO–),150.1(C-20),132.6(C-40),130.5(C-10),129.3(C-30,-50),128.5(C-20,-60),110.1(C-29),80.7(C-3),63.7(C-27),56.4(C-17),55.6(C-5),52.0(17-COOCH₃),51.3(C-9),49.8(C-18),46.9(C-19),45.7(C-14),41.5(C-8),39.2(C-13),38.5(C-1),37.8(C-4),37.4(C-10),36.6(C-22),35.3(C-7),32.5(C-16),30.4(C-21),27.9(C-23),25.3(C-12),24.3(C-15),23.7(C-2),21.2(3-OCOCH₃),21.1(C-11),19.4(C-30),18.2(C-6),16.7(C-24),16.6(C-25),16.4(C-26)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，所得單體化合物為山芝麻酸甲酯(methyl helicterate)，其分子式為C₄₀H₅₆O₆，分子量為632.89。

二、山芝麻酸甲酯治療CCl₄誘導(dǎo)肝纖維化藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案：

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備、分組及處理

SD大鼠，(200±10g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、水飛薊素陽性對照組(silymarin)，以及山芝麻酸甲酯低劑量組(MH-L)、中劑量組(MH-M)、高劑量組(MH-H)，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠灌胃給予20％CCl₄(1ml/kg，溶于花生油中)，每周2次，總共8周；與此同時(shí)，陽性對照組大鼠灌胃給予水飛薊素(50mg/kg/d)，山芝麻酸甲酯治療組大鼠灌胃給予山芝麻酸甲酯(16.72、33.45、66.90mg/kg/d)作為低、中、高劑量組。正常對照組大鼠灌胃給予等容量的生理鹽水。8周后，處死大鼠，取血，4000r/min離心5min后，用抗凝管(50U/ml)分別收集血清與血漿。取出肝臟，清洗干凈。血清、血漿及肝組織均貯存在-80℃冰箱待用。

(2)檢測指標(biāo)

①肝組織病理學(xué)觀察：常規(guī)病理檢察；

②血清ALT，AST，ALP和ALB的水平以及肝組織PGE2的含量；

③血漿IL-6，TNF-α，MPO的水平；

④SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA的檢測；

⑤NF-κB p65和CYP2E1的活性；

⑥免疫組化檢測肝組織Fas、FasL、CYP2E1的表達(dá)；

⑦Western blot檢測肝組織iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)；

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.肝組織病理檢查情況

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰且完整，以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見變性或壞死。模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變，肝小葉被破壞，或肝局灶性壞死以及淋巴細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象。山芝麻酸甲酯組大鼠可觀察到肝組織病理損傷比模型組明顯減輕。

2.血清ALT，AST，ALP和ALB的水平以及肝組織PGE2的含量；

模型組大鼠血清ALT、AST和ALP均高于正常組老鼠，經(jīng)藥物干預(yù)后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組均能顯著降低血清中ALT、AST和ALP的含量；模型組大鼠血清ALB低于正常組大鼠，給予藥物后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組均能顯著提高血清ALB水平(p＜0.05或p＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 MH對肝纖維化大鼠血清ALT，AST，ALP，ALB以及肝組織PGE2的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05；^bp<0.05。

3.血漿IL-6，TNF-α，MPO的水平；

模型組大鼠血漿IL-6，TNF-α，MPO均高于正常組大鼠，經(jīng)藥物干預(yù)后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組均能顯著降低血漿中IL-6，TNF-α，MPO的水平(p＜0.05或p＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 MH對肝纖維化大鼠血漿IL-6，TNF-α，MPO含量的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05；^bp<0.05。

4.肝組織SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA的活性

模型組大鼠GSH-Px、GSH-Rd、catalase和SOD低于正常組大鼠，MDA則高于正常組大鼠，給予藥物后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組均能升高GSH-Px、GSH-Rd、catalase和SOD的含量，并降低MDA含量(p＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 MH對肝纖維化大鼠肝組織SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA活性的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05；^bp<0.05。

5.NF-κB p65和CYP2E1的活性

模型組大鼠NF-κB p65和CYP2E1高于正常組大鼠，給予藥物后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組均能降低NF-κB p65和CYP2E1的活性(p＜0.05)。結(jié)果見表4。

表4 MH對肝纖維化大鼠肝組織NF-κB p65和CYP2E1活性的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05；^bp<0.05。

6.肝組織Fas、FasL、CYP2E1的表達(dá)；

模型組大鼠肝組織Fas、FasL、CYP2E1的表達(dá)高于正常組大鼠，經(jīng)藥物干預(yù)后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組能明顯降低Fas、FasL、CYP2E1的表達(dá)(p<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 MH對肝纖維化大鼠肝組織Fas、FasL、CYP2E1表達(dá)的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05,^bp<0.05。

7.肝組織iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)；

模型組大鼠肝組織iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)高于正常組大鼠，經(jīng)藥物干預(yù)后，silymarin組與MH-L、MH-M、MH-H組能明顯降低iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表達(dá)(p<0.05)。結(jié)果見表6。

表6 MH對肝纖維化大鼠肝組織iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白表達(dá)的影響

注：與正常對照組比較,^ap<0.05,^bp<0.05。

8.結(jié)論：山芝麻酸甲酯可減輕CCl₄引起的大鼠病理性肝損傷、減輕肝纖維化。