Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開并提供了一種由Virosaine A的哌嗪基衍生物和咪唑基衍生物按照質(zhì)量比為25：75組成的組合物以及將上述化合物按照25：75的質(zhì)量比進(jìn)行混合從而制備本發(fā)明組合物的方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的這種組合物在20 ug/ml時(shí)能夠顯著抑制NIH/3T3增殖以及轉(zhuǎn)化生長因子?β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，具有抗肝纖維化的作用，因此本發(fā)明還提供了Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物按照質(zhì)量比為25：75組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的用途。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的脈瞎基和咪性基衍生物的組合物在抗肝纖維 化藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動態(tài)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)化CM)大量 合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞化C)壞死， 隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終W肝臟結(jié)締組織成分的 合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要 因素。
[0003] 過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中 藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏巧IJ平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研 究.中華肝病雜志，2005，8( 13): 561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對與肝星狀細(xì)胞激活相 關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是:減輕肝損傷;抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生;調(diào)節(jié)細(xì)胞因子素 亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞調(diào)亡；抑制肝臟成纖維細(xì)胞的增殖W及星狀細(xì)胞激活大量分泌誘 導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的增殖。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
[000引本發(fā)明設(shè)及的化合物I是一個(gè)2012年發(fā)表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096- 3099)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物HI和化 合物IV，并用化合物ΠΙ和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗肝纖維化活性進(jìn)行了評 價(jià)，其具有抗肝纖維化活性。
[0006] 由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，運(yùn)些生長因子 會誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物ΙΠ 和化合物IV組成，該組合物 中化合物ΠI和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為25 %和75 %。
[000引
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可W制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上 可接受的鹽具有同樣的藥效。
[0011] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗成纖維細(xì)胞增殖的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
[0012] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗生長因子誘導(dǎo)的成纖維 細(xì)胞增殖的活性，組合物是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物，它可直接用于相應(yīng)疾病的治療W 及相關(guān)藥物的制備。
[0013] W下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加 W限定。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1化合物Virosaine A的制備
[0015] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Bing- Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B, Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[0016]
[0017]實(shí)施例2 Virosaine A的0-漠乙基衍生物（II)的合成
[001引將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四下基漠化錠（TBAB) (0.08g)，1，2-二漠乙燒(3.760g，20.0 Ommol)和5mL的50%氨氧化鋼溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攬拌化。她之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲燒萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后 對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗涂3次，再用無水硫酸鋼干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.0，v/v)，收 集棟色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棟色粉末(261mg，78%)。
[0019] iHMffi(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(s，lH)，3.81(s，2H)，3.59(s，lH)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d J = 9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0020] 1化醒R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s)，106.71(s)，79.95(s)，74.33(s)，69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[00別]HRMS(ESI)m/z[M+扣+calcd for Cm出7BrN04:342.0:341;found 342.0:343.
[0022]
[0023] 實(shí)施例3 Virosaine A的0-(贓嗦基）乙基衍生物（III)的合成
[0024] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于20mL乙臘當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鐘(690mg， S.Ommol)，艦化鐘（168mg，1 .Ommol)和無水贓嗦（3446mg，40mmol)，混合物加熱回流化。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲燒萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100: i.o，v/v)，收集棟色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物ΠI的淡棟色固體(123.2mg，71 % )。
[0025] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S5.90(s，lH)，4.04(s，lH)，3.59(s，lH)，3.50(s，2H), 3.40(d J = 65.9Hz，lH)，2.64(s，4H)，2.54(s，2H)，2.31(s，4H)，2.22(s，lH)，1.62(s，2H), 1.56(s，lH)，1.43(s，2H)，0.97(s，lH).
[0026] "C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.84(s)，106.72(s)，79.94(s)，74.33(s)，66.72(d， J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0027] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Cl姐26化〇4:348.1923;found:：M8.1927。
[002引
[00巧]實(shí)施例4 Virosaine A的0-(咪挫基）乙基衍生物（IV)的合成 [0030] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于25mL乙臘當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鐘(690mg， 5. Ommo 1)，艦化鐘（2 5 2mg，1.5mmo 1)和咪挫（8 7 Omg，1 Ommo 1)，混合物加熱回流化。反應(yīng)結(jié)束 后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲燒萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100:0.3，v/v)，收集棟色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物IV的淡棟色固體(144. lmg，71%)。
[003。 1h NMR(500MHz，DMS0-d6)S7.86(s，lH)，7.12(s，lH)，6.71(s，lH)，5.99(s，lH), 4.09(s，lH)，3.89(d，J=16.4Hz，2H)，3.80(s，2H)，3.58(s，lH)，3.35(s，lH)，2.31(s，lH)， 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0032] 13c NMR(125MHz，DMS0-d6)i3c 醒Ra25MHz，Common 醒R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s)，128.67(s)，119.31(s)，106.70(s)，79.92(s)，74.31(s)，67.61(s)，66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0033] HRMS化SI):m/z[M+H]+calcd for Cl訊20化〇4:330.1454;found:330.1458。
[0034]
[0035] 實(shí)施例5組合物抗肝纖維化活性
[0036] 由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，運(yùn)些生長因子 會誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。
[0037] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的25mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的75mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用滿輪攬拌儀混合即得到lOOmg組合物， 使用時(shí)用水溶解運(yùn)1 OOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[003引實(shí)驗(yàn)例1:組合物對成纖維細(xì)胞NIH/3T3增殖的抑制作用
[0039] 一、實(shí)驗(yàn)方法：
[0040] NIH/3T3細(xì)胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海細(xì)胞所細(xì)胞庫。
[0041 ] 將對數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25%膜酶消化，洗涂，離屯、后，用DMEM 培養(yǎng)液(含l〇%FCS)制成lX104cell/ml的細(xì)胞懸液，臺吩藍(lán)染色鑒定存活率大于95%，按 每孔lOOul加入96孔板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的 DMEM培養(yǎng)液（含10%FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液解育4h。棄去培養(yǎng)液，加入 150U1DMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取0D值，結(jié)果WOD490表示。
[00創(chuàng)二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0043] 1、形態(tài)學(xué)觀察
[0044] NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度 快;而加組合物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì) 胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多?；衔铴癐和化合物IV無此作用。
[0045] MTT法檢測組合物對NIH/3T3細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0046] 表1 :MTT法檢測組合物對NIH/3T3增殖的抑制作用
[0047]
[004引注:*，與細(xì)胞陰性對照P<0.05
[0049] 結(jié)果:組合物在20ug/ml對成纖維細(xì)胞NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表 明組合物體外對成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用?；衔铴唉┖突衔颕V無此作用。
[0050] 實(shí)驗(yàn)例2:組合物對轉(zhuǎn)化生長因子-執(zhí)(TGF-βι)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用
[0051] TGF-βι是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-&10ng/ml刺 激細(xì)胞增殖，再檢測藥物對TGF-m誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，W分析判斷組合物的作用 機(jī)理。
[0052] 表2 :MTT法檢測組合物對TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用 [0化3]
[0化5] 注:*，與細(xì)胞+TGF對照P<0.05
[0056] 結(jié)果:組合物在20ug/ml對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-βι的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯 著的抑制作用，化合物ΠΙ和化合物IV無此作用。表明組合物體外對纖維細(xì)胞增殖的抑制作 用可能是通過干預(yù)TGF信號通路實(shí)現(xiàn)的。
[0057] 結(jié)論:組合物對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著 的抑制作用；組合物對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-βι的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作 用。組合物可W用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-βι的 誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，不可W用來制備抗肝纖維化藥物。
[005引實(shí)施例6本發(fā)明所設(shè)及組合物片劑的制備
[0059]取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0060] 實(shí)施例7本發(fā)明所設(shè)及組合物膠囊的制備
[0061] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為25%和75%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為25 %和75 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制成纖維細(xì)胞增殖。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述生長因子 為TGF-βΙ。
【文檔編號】C07D498/22GK105920006SQ201610278695
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】王卓婷
【申請人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司