專利名稱：乙肝病毒前s的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫診斷試劑，具體涉及一種乙肝病毒前S1(Pre-S1)抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒及制備方法。
長期以來，臨床醫(yī)生是根據(jù)“二對半”試劑盒檢驗結(jié)果判斷乙肝患者的病情。但是“二對半”試劑查的是與乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的表面和核內(nèi)抗原和抗體，不是直接查HBV。因此該方法不能確定患者有無HBV。此外，用“二對半”試劑盒檢查結(jié)果表明全世界約有3億人為乙肝表面抗原(HbsAg)攜帶者，我國約有1.3億，已成為世界之最，但實際上其中的部分人既無臨床癥狀，轉(zhuǎn)氨酶也不高，因此，并非所有HBsAg陽性者都攜帶HBV。
本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有檢測HBV的缺陷，研制一種特異性強、簡便、靈敏的檢測試劑。
本發(fā)明提供了一種乙肝病毒前S1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒。該試劑盒是由主要成份為預(yù)包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記前S1抗體、次要成份為陽性對照液1支、陰性對照液1支，20倍濃洗滌液1瓶、底物緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶和終止液1瓶組成。
本發(fā)明的試劑盒中所述預(yù)包被反應(yīng)條為48～96孔；陽性對照液為HBV-DNA和HBeAg均陽性血清；陰性對照液為正常人血清；底物緩沖液甲為H2O2；底物緩沖乙為3,3’.5.5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和終止液為4NH2SO4。
本發(fā)明的乙肝病毒前S1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒的臨床結(jié)果如下1993年9月至1994年3月，新華醫(yī)院、第一人民醫(yī)院、長海醫(yī)院、長征醫(yī)院、海軍411醫(yī)院和北京佑安醫(yī)院等單位，使用上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司研制、生產(chǎn)的乙型肝炎病毒前S1(Pre-S1)蛋白雙抗體夾心ELISA試劑盒，檢測各種急、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后的血清標(biāo)本，并與常規(guī)乙肝病毒免疫標(biāo)志物(HBV-M)和乙肝病毒DNA(HBV-DNA)進(jìn)行比較?，F(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報告如下。
Ⅰ材料與方法一、臨床血清標(biāo)本各醫(yī)院臨床收集血清標(biāo)本總數(shù)為1244份，包括HBV-M有一項以上的陽性標(biāo)本900份，HBV-M陰性196份，(其中長海48份，市一82份，411醫(yī)院66份)。
二、實驗方法1、Pre-S1蛋白檢測按“乙肝病毒前S1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”說明書進(jìn)行操作。即取已包被Pre-S1蛋白單抗條排酶標(biāo)板，孔內(nèi)加血清標(biāo)本50μl，同時設(shè)陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)孔；37℃溫育30min，棄血清并洗滌三遍后加稀釋后的酶標(biāo)抗Pre-S1蛋白單抗50μl，置酶標(biāo)板于37℃溫育30min后，棄液并充分洗滌5遍。用TMB底物顯色、終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀波長為450nm處的吸光度值(OD值)。測定孔OD值大于陰性標(biāo)準(zhǔn)孔8倍為陽性。其中LAK細(xì)胞治療前后的陽性配對標(biāo)本尚計算不同稀釋度的P/N比值。
2、HBV-M檢測均采用國產(chǎn)或進(jìn)口EIA試劑盒檢測。
3、HBV-DNA:PCR法。
Ⅱ結(jié)果一、Pre-S1與HBeAg陽生符合率以HBeAg為比較參項，219份HBeAg陽性血清中有195份為Pre-S1陽性，其陽性符合率為89.0％(見表1)。
二、Pre-S1與HBV-DNA(PCR法)符合率以HBV-DNA(PCR法)為比較參項，219份HBV-DNA(PCR法)陽性血清中有200份為Pre-S1陽性，其陽性符合率為91.3％(見表2)。
三、各類HBV感染者Pre-S1蛋白和HBV-DNA測定結(jié)果海軍411醫(yī)院選擇的200份血清標(biāo)本分為急性乙型肝炎、慢性活動性肝炎、慢性遷延性肝炎和無癥狀攜帶者4類。測定結(jié)果表明，在急性乙型肝炎，Pre-S1陽性率達(dá)93.3％,HBV-DNA陽性率為96.6％；在慢性活動性肝炎的陽性率分別為33.3％和38.1％。四組之間陽性率比較相差顯著(p＜0.01)，急性乙肝和慢活肝組Pre-S1陽性率分別高于慢遷肝和無癥狀攜帶者組(p＜0.01)，而急性乙肝組Pre-S1陽性率又高于慢活肝組(p＜0.01)。見表3。
四、LAK細(xì)胞治療前后Pre-S1滴度和HBV-DNA比較長征醫(yī)院測定了26對慢活肝LAK細(xì)胞治療前后血清Pre-S滴度，見表4。結(jié)果表明LAK細(xì)胞治療后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率26.3％,Pre-S1陰轉(zhuǎn)率29.4％。兩者的陰轉(zhuǎn)率比較相差不顯著(P＞0.05)。
五、Pre-S1陽性樣品重復(fù)性結(jié)果(CV％)在10％以內(nèi)，見北京佑安醫(yī)院的結(jié)果，見表五。
Ⅲ討論Pre-S1蛋白是HBVS區(qū)基因編碼產(chǎn)物，它和Pre-S2蛋白一起在HBV附著和侵入肝細(xì)胞的機制中起重要作用。Pre-S1蛋白主要存在于Dane顆粒中，HBsAg球形顆粒中亦有少量Pre-S1蛋白。已證實HBV的前S1的P21-47肽是吸附于靶細(xì)胞受體的配體。
目前，通過血清學(xué)檢查以判斷HBV感染狀態(tài)的常用手段是檢測HBV-M，即所謂“兩對半”HBsAg-HBsAb,HbeAg-HBeAb和HBcAb，其中HBeAg和HBcAb陽性，表明HBV在肝內(nèi)復(fù)制。然而，常規(guī)HBV-M檢測方法繁瑣、耗時，且結(jié)果分析比較復(fù)雜。PCR法測定HBV-DNA亦已在一些大、中型醫(yī)療機構(gòu)開展，但是盡管該方法有敏感性高、特異性強等特點，亦因其操作步驟繁瑣、技術(shù)要求高、消耗性試劑昂貴等不能被普遍應(yīng)用。Theilman等首先報告用western blot技術(shù)檢測了HBsAg陽性病人血清Pre-S1蛋白，認(rèn)為該蛋白與HBeAg和HBV-DNA有良好的相關(guān)性，是HBV在體內(nèi)復(fù)制的標(biāo)志。Pre-S1蛋白單克隆抗體的制備，使該蛋白的酶聯(lián)免疫測定技術(shù)的建立成為可能”，上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司成功制備了抗Pre-S1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，并建立了Pre-S1的雙抗體夾心ELISA技術(shù)。經(jīng)過臨床應(yīng)用結(jié)果表明，Pre-S1檢測在下述幾個方面具有重要價值一、Pre-S1-蛋白是很好的HBV復(fù)制標(biāo)志本文各醫(yī)院219份HBeAg陽性血清標(biāo)本，195份檢出Pre-S1蛋白，陽性率達(dá)89.0％。各醫(yī)院219份HBV-DNA(PCR法)陽性血清標(biāo)本，200份檢出Pre-S1蛋白，陽性符合率為91.3％，顯示出本試劑盒檢出的Pre-S1蛋白與HBeAg和HBV-DNA(PCR法)有良好的相關(guān)性，HBsAb和HBeAb均陽性標(biāo)本未檢出Pre-S1蛋白和HBV-DNA，提示機體建立了清除HBV機制后，HBV-DNA和Pre-S1蛋白均消失。HBV-M和HBV-DNA陰性的健康人血清標(biāo)本也未檢出Pre-S1蛋白，因而本Pre-S1蛋白試劑盒能很好判斷病人是否有乙肝病毒復(fù)制。
二、Pre-S1蛋白的檢測結(jié)果與乙型肝炎活動程度有關(guān)表3結(jié)果提示，在乙型肝炎的急性期，Pre-S1-蛋白多為陽性(92.5％)，與本型肝炎HBV的高度復(fù)制狀態(tài)相吻合；在慢性活動性肝炎組，Pre-S1蛋白的陽性率(35.1％)明顯高于慢性遷延性肝炎(4.4％)和無癥狀攜帶者(2.0％)。據(jù)此，我們認(rèn)為，對于Pre-S1蛋白陽性，同時合并其他肝功能異?；虬榕R床癥狀者，應(yīng)高度懷疑慢性活動性肝炎或急性乙型肝炎。
三、Pre-S1蛋白可以作為藥物或其他生物療法，治療乙型肝炎的療效判定指標(biāo)最近，Haruna等對35例HBeAg攜帶者干擾素治療前后Pre-S1、S2蛋白水平進(jìn)行動態(tài)定量觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療有效者Pre-S1、S2蛋白水平明顯低于無效者。認(rèn)為臨床上有可能以Pre-S1蛋白的消長作為干擾素或其他抗病毒制劑的療效判定指標(biāo)。本組初步觀察了LAK細(xì)胞治療后Pre-S1蛋白的消長與HBV-DNA轉(zhuǎn)陰之間的關(guān)系，結(jié)果表明，LAK細(xì)胞治療后，隨著HBV-DNA的陰轉(zhuǎn)，Pre-S1蛋白亦轉(zhuǎn)陰或滴度下降，說明Pre-S1蛋白的消長與HBV的清除相關(guān)。
我們認(rèn)為，該試劑盒具有操作簡便、迅速、經(jīng)濟、可靠等特點，更因Pre-S1蛋白與HBV-DNA和HBV-M之間良好的相關(guān)性，該檢測項目可以補充或替代常規(guī)“兩對半”和PCR檢測法，深為臨床檢驗工作者歡迎。
表1各醫(yī)院HBeAg陽性血清中Pre-S1陽性符合率結(jié)果醫(yī)院檢測 總例數(shù) HbeAg(+) PreS1(+) PreS1和HbeAg長海 236 4034 85.0％(34/40)長征 118 8682 95.3％(82/36)新華 174 1210 83.3％(10/12)市一 200 2018 90.0％(18/20)411298 6151 83.6％(51/61)合計 1096 219 195 87.4％(195/219)表2 各醫(yī)院HBV-DNA(PCR法)陽性血清中Pre-S1陽性符合率結(jié)果醫(yī)院檢測總例數(shù)HBV-DNA PreS1PreS1和HBV-DNA(PCR法)長海 236 39 36 92.3長征 188 114 98 86.0新華 174 16 12 75.0市一 200 20 16 80.0411298 40 38 95.0北京佑安 148 61 54 88.5合計 1244 280 254 86.1(254/280)表3 各型肝炎前S1蛋白與HBV-DNA的關(guān)系臨床類型 N 前S1-前S1+DNA- DNA+急性乙型肝炎 40 3 37 238慢性活動性肝炎94 6133 57 37慢性遷延性肝炎113 108 5 103 10無癥狀帶抗體者51 483 48 3正常對照組66 660 66 0本發(fā)明的另一目的是提供了乙肝病毒前S1抗原酶免測定試劑盒的制備方法。該方法包括下列步驟
(一)前S1抗原基因重組成前S1基因片斷的21-47aa及10-199aa；(二)免疫Balb/c小鼠，得前S1抗體陽性鼠；(三)細(xì)胞融合，Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤胞株；(四)篩選陽性克隆后，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞擴增，得腹水；(五)抗前s1單抗制備，腹水除去細(xì)胞及其他雜質(zhì)得純化前s1單抗；(六)HRP-抗前S1單抗制備，辣根過氧化物酶(HRP)與前S1單抗偶聯(lián)；(七)包被前S1抗體成為予包被反應(yīng)條；(八)分裝試劑盒其余7種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中；(九)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性合格；(十)組裝成為成品。
本發(fā)明的試劑盒在使用時可以如下操作1．取出已包被條孔，插入支架上，用膠布固定，以防脫落。
2．每孔加待檢血清50ul，各板設(shè)陽性對照1孔(50ul)陰性對照1孔(50ul)，空白對照1孔(加蒸餾水50ld)，然后除空白對照孔外各孔加酶標(biāo)記液1滴(50ul)，置37℃中反應(yīng)20分鐘。
3．取出反應(yīng)板甩去孔內(nèi)液體后在草紙上拍2-3下，然后用洗滌液洗5次，每次條孔加滿洗滌液后停留30秒鐘，每次甩去洗滌液后都要在草紙上拍干，以便洗滌徹底。(20倍濃洗滌液1ml+19ml蒸鎦水即為工作洗滌液)4．各孔滴加底物緩沖液甲、乙各1滴，室溫避光10～15分鐘后再每孔滴加終止液1滴，置酶標(biāo)儀中450nm波長讀數(shù)。
結(jié)果判定陰性對照(A值)×2.5=臨界值(cut off值)，陰性對照高于0.05時按實際OD值計算，陰性對照小于0.05按0.05計算，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽性。
本發(fā)明的試劑盒能非常專一地檢測患者血清中HBsAg-preSl蛋白的濃度。它具有簡便，靈敏和穩(wěn)定等特點。且本試劑盒操作簡便快速，采用酶標(biāo)一步檢測法可在1小時內(nèi)獲得實驗結(jié)果，比PCR檢測法省時60％以上(PCR法最快需3小時完成實驗)，經(jīng)臨床試用preSl蛋白檢測陽性與PCR檢測的HBV-DNA陽性有很好的符合率，藥盒的臨床陰陽性預(yù)示值為90％。因而本藥盒對判斷病人是否有病毒復(fù)制，確定乙肝感染病程具有十分重要的參考意義，與PCR操作相比它沒有苛刻的技術(shù)和條件的限制，整個實驗中無需貴重意儀器設(shè)備，憑肉眼可判斷實驗結(jié)果，能適用于各級醫(yī)院及臨床測試中心，也可用于流行病學(xué)普查。PreS1，抗原檢測試劑盒，具有簡便、靈敏、重復(fù)性好的優(yōu)點，能檢出完整HBV，將可被普遍使用，做為HBV感染，復(fù)制和乙肝病人診斷、治療和預(yù)后的一個新的標(biāo)志，與其PreS1抗體合成新的乙肝檢測系統(tǒng)。
實例制備乙肝病毒前S1蛋白酶免試劑盒的生產(chǎn)(一)純化包被抗體(HBsAb)抗HBs單抗(SOH3)腹水，離心除去細(xì)胞，加等體積的飽和(NH4)2SO4沉淀，經(jīng)DE-52柱純化，收集蛋白峰，加(NH4)2SO4沉淀，PBS透析得單抗SOH3。SDS-PAGE鑒定上樣蛋白濃度為5-10ug/ml，基本為均一的染色條帶。純度＞80％，效價＞10萬。
(二)酶標(biāo)記抗體制備1．單抗制備細(xì)胞株復(fù)蘇擴增，注射Balb/c小鼠腹腔中，取腹水，效價＞10萬，腹水用50％飽和(NH4)2SO4沉淀粗提，再經(jīng)DE-52柱純化，得抗preS1單抗。效價＞10萬，SDS-PAGE鑒定。2．酶標(biāo)記抗體制備抗preS1單抗用過碘酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存。效價》20003．酶標(biāo)記抗體濃度選定采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體的工作濃度大于1∶2000。
preS1合成抗原從10ng/ml倍半稀釋，包被酶標(biāo)板，加梯度稀釋的酶標(biāo)抗體測定，以確定最適稀釋度。(三)預(yù)包被抗體板的制備1．包被Na2CO30.6gNaHCO31.58g重蒸水500ml加入適量Anti-S抗體，調(diào)整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過液后甩干。2．洗滌Na2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5mlNaCL8.2g重蒸水 100ml調(diào)整PH至7.2,1∶10稀釋后，加入微孔板各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)三次，以除去剩余抗體。3．封閉明膠 1.1g微波爐加溫 注入酶標(biāo)BSA5.0g至呈透明溶液板各孔中
0.1N PBS 20ml---→冷卻至室溫---→‘蒸餾水至100ml棄去液體，放入濕盒中(加蓋) 吸水紙上拍干 重復(fù)一次，待干燥后，--------→37℃lhr-----→放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃。
(四)陽性對照的制備HBeAg和HBV-DNA同時呈陽性的乙肝患者血清，60℃放置1小時，除菌過濾，用本藥盒測定A值＞0.3，備用，分裝。
(五)陰性對照的制備用本試劑萬分之二硫柳汞盒測定A值--→0-0.40-------------→備用正常人血清---→ 用小牛血清 萬分之二--→0.040-0.100----------→------→備用稀釋0.040 硫柳汞 分裝(六)酶標(biāo)單抗配制10％小牛血清90％0.15MPBSAnti-preS1-HRP----------------→稀釋20倍，分裝。
(稀釋度1∶2000)(七)標(biāo)單抗稀釋液BSA 0.5gNa2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4gNacl 8.2g20％Tween-202.5ml重蒸水 100ml調(diào)整PH至7.2(八)底物液ANa2HPO4·12H2O 1.7g檸檬酸.H2O0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ml調(diào)整PH至5.0(九)底物液BNa2HPO4·12H2O 1.7g檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml調(diào)整PH至5.0后，加入IOmlDMSO含60mgTMB的溶液25ul(十)終止液濃H2SO410ml蒸餾水 80ml(十一)10x洗滌液Na2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5ml重蒸水 100ml調(diào)整PH至 7.2(十二)半成品及成品的組成上述(一)→(十一)步驟所得產(chǎn)品裝人小瓶及尖底離，b管中，即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、穩(wěn)定性、靈敏度及精密度檢定合格才能組裝成preS1試劑盒。組裝成盒后還需抽出三份同半成品一樣經(jīng)過檢定合格才能出售。
權(quán)利要求
1.一種乙肝病毒preS1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒，其特征在于該試劑盒是由主要成份前S1抗體預(yù)包被反應(yīng)條48～96孔、酶標(biāo)記前S1抗體和次要成份陽性對照液1支、陰性對照液1支、20倍濃洗滌液1瓶、底部緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶及終止液(4NH2SO4)1瓶組成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種乙肝病毒pre S1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(一)前S1抗原基因重組成前S1基因片斷的21-47aa及10-199aa；(二)免疫Balb/c小鼠，得前S1抗體陽性鼠；(三)細(xì)胞融合，Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤胞株；(四)篩選陽性克隆后，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞擴增，得腹水；(五)抗前s1單抗制備，腹水除去細(xì)胞及其他雜質(zhì)得純化前s1單抗；(六)HRP-抗前S1單抗制備，辣根過氧化物酶(HRP)與前S1單抗偶聯(lián)；(七)包被前S1抗體成為予包被反應(yīng)條；(八)分裝試劑盒其余7種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中；(九)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性合格；(十)組裝成為成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝病毒pre S1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒，其特征在于其中所述的陽性對照液為HBV-DNA和HbeAg均陽性血清、陰性對照液為正常人血清、濃洗滌液為磷酸-Tween-20、底物緩沖液甲為H2O2、底物緩沖液乙為3,3’.5.5’-四甲基聯(lián)苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙肝病毒前S
文檔編號G01N33/576GK1323988SQ00115678
公開日2001年11月28日 申請日期2000年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月15日
發(fā)明者杜鳳鳴, 郭葆玉 申請人:上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司, 杜鳳鳴