專利名稱：一種重組人乙肝病毒核心抗原的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說是乙肝病毒核心抗原基因的獲得、克隆、表達核心抗原的工程菌種的構(gòu)建及核心抗原的大規(guī)模純化，制成純度達95％的成品，用于乙型肝炎的診斷及治療與預防。
1991年Miller等人(Miller A，Lider O，Weiner HL.Antigen-driven byatandersupression after oral administration of antigen.J Exp Med.1991，174；791)發(fā)現(xiàn)了旁觀者抑制效應，即調(diào)節(jié)性T細胞遷移至淋巴器官中，抑制效應細胞產(chǎn)生免疫應答；或遷移至特異器官，通過釋放非特異性抑制因子阻止免疫病理反應。旁觀者抑制的誘導是抗原特異的，但效應是非特異的。這個實驗解決了利用免疫耐受治療疾病時應該采用何種抗原的問題，自身免疫性疾病往往是和大量抗原相關(guān)的，應該采用哪種抗原一直是困擾科學家的一個問題，旁觀者效應表明與該疾病相關(guān)的抗原理論上都可以引起免疫耐受。
如果能夠證實口服HBV主要結(jié)構(gòu)蛋白可誘導對HBV的獲得性免疫耐受，這一結(jié)果有望將慢性活動性肝炎轉(zhuǎn)變?yōu)闊o癥狀病毒攜帶者，即把著重增強抗病毒免疫反應變?yōu)檎T導宿主對HBV的免疫耐受，藉此降低機體免疫反應對肝組織的損傷，減少發(fā)生肝硬化或肝細胞癌的幾率(Israel Gotsman，RoyBeinart et.Induction of oral tolerance towards hepatitis B envelope antigens in amurine model.Antiviral Research 48(2000)17-26)。
1998年美國ENZO BIOCHEM公司馬上利用這一理論著手EHT899(主要成分為HBsAg)的動物實驗；1999年Israel Gotsman(ENZO公司參與)利用HBV表面抗原成功誘導了鼠模型中的免疫耐受，通過口服HBV蛋白(HBsAg+PreS1+PreS2，BioHepB)顯著降低了鼠血液中抗HBV抗體的滴度(Israel Gotsman，Roy Beinart et.Induction of oral tolerance towards hepatitis Benvelope antigens in a murine model.Antiviral Research 48(2000)17-26)。
2000年美國ENZO BIOCHEM公司完成一期臨床實驗，療效顯著，之后著手二期臨床實驗，2001年10月美國ENZO BIOCHEM公司公告顯示二期臨床達到預期療效。
旁觀者抑制效應的發(fā)現(xiàn)啟發(fā)我們考慮HBcAg能夠和HBsAg一樣引起乙型肝炎患者針對HBV的免疫耐受，降低肝損傷程度，減少肝癌發(fā)病率。臨床治療效果的評價需要大規(guī)模制備HBcAg，因此我們構(gòu)建了HBcAg高表達菌株，用基因工程技術(shù)制備HBcAg。
HBcAg的全稱為Hepatitis B type virus core antigen(乙肝病毒核心抗原)，它在肝炎病毒中起到合成核殼的作用，它由183個氨基酸組成，為二十面體衣殼，分子量一般認為是23KD，根據(jù)亞型不同有所區(qū)別，容易形成聚體，等電點為9.6左右。編碼HBcAg的基因處于乙肝病毒全基因組第1775-2326位(Paul T.Wingfield，Hepatitis Core Antigen Produced in EscherichiacoliSubunit Composition，Conformational Analysis，and In Vitro CapsidAssembly.Biochemistry 1995，34，4919-4932；Chisari，F(xiàn).V.and Ferrari，C.(1995)Hepatitis B virus immunopathogenesis.Annu.Rev.Immunol.1329-60)。
在HBcAg的183個氨基酸中，含有48位、61位、107位和C末端四個Cys(半胱氨酸)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)48位和48位，61位和61位之間二硫鍵形成二聚體和四聚體，183位和183位之間二硫鍵形成多聚體，由于空間位置太遠107位和107位之間無法形成二硫鍵(Zheng，J.，Schodel，F(xiàn).and Peterson，D.L(1992)The structure of hepadnaviral core antigens.Identification of freethiols and determination of the disulfide bonding pattem.J.Biol.Chem.267(13)9422-9429)。
據(jù)文獻報道，在基因水平酶切，再轉(zhuǎn)錄表達出145個氨基酸，與HBcAg相比較C末端缺失了38個氨基酸，C末端半胱氨酸丟失，但仍舊可以合成核殼，仍具有復制病毒的能力，它的分子量約為16KD，其免疫原性與全長HBcAg相比沒有明顯差異，但16kd HBcAg在E.coli中的表達量要遠遠高于全長HBcAg的表達。(Paul T.Wingfield，Hepatitis Core Antigen Produced inEscherichia coliSubunit Composition，Conformational Analysis，and In VitroCapsid Assembly.Biochemistry 1995，34，4919-4932)。
1979年，Mark Pasek在E.coli中表達了HBcAg基因(Pasek，M.，Goto，T.，Gilbert，W.，Zink，B.，Schaller，H.，MacKay，P，Leadbetter，G.and Murray，K.(1979)Hepatitis B virus genes and their expression in E.coli.Nature 282(5739)575-579)，1982年，B.J.Cohen等成功將HBV的核心基因插入載體，克隆在E.coli里表達，通過電鏡與來源于人肝臟的核心抗原比較，無明顯差異，顆粒大小均為24-32nm；同時Stephen Stahl也在E.coli里克隆表達了HBV核心基因，通過RIA、免疫擴散(ID)、DNA序列分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳證實表達的是核心抗原(B.J.Cohen & J.E.Richmond，Electron microscopy ofhepatitis B core antigen synthesized in E.coli.Nature Vol.296，15 April 1982)。1986年P(guān)eter J.Kniskern等人在酵母Saccharomyces cerevisiae中表達了HBcAg，其表達量占酵母可溶性蛋白的40％，同人血清中分離到的HBcAg幾何學上沒有差異，同為28nm顆粒，實驗證明這種HBcAg在小鼠體內(nèi)具有較高的免疫活性(Peter J.Kniskem，Arpi Hagopian et.Unusually high-levelexpression of a foreign gene(hepatitis B virus core antigen)in Saccharomycescerevisiae.Gene，46(1986)135-141)。1995年P(guān)aul T.Wingfield等人也在E.coli里成功表達了HBcAg和HbeAg，E.coli表達的核心抗原，不以包涵體形式存在，也沒有分泌在胞外，而是聚集裝配成28nm大小的顆粒。
盡管以前在E.coli和Saccharomyces里面已經(jīng)成功表達了HBcAg，但是目前公開的與HBcAg純化有關(guān)的資料仍舊很少，在HBcAg純化方面做的工作不多。1997年，M.Naito等人利用熱處理法處理E.coli表達的HBcAg，電泳純度達到90％，但經(jīng)熱處理后的蛋白經(jīng)HPLC檢測仍殘留大量核酸等雜質(zhì)(M.Naito，K.lshii et.Simple method for efficient production of hepatitis B viruscore antigen in Escherichia coli.Res virol.1997，148.299-305)；1999年H.Wizemann等人在E.coli里面表達了HIS耦聯(lián)的HBcAg，這種蛋白可以利用Ni2+螯和層析法純化，但是在工藝放大時會有較大的困難，要得到無HIS耦聯(lián)的HBcAg，還需加上切割HIS工藝，成本也將增高(H.Wizemann，A.vonBrunn.Purification of E.coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen byNi2+-chelate affinity chromatography. Joumal of Virological Methods；77(1999)189-197)；2001年D.Rolland等人利用分子篩層析和超速離心法純化了E.coli和酵母Pichia pastoris表達的HBcAg，雖然超速離心可得到純度大于90％的HBcAg，分子篩層析可得到純度約50％HBcAg，但是超速離心無法實現(xiàn)有效地、大規(guī)模地純化，而且由于E.coli表達的HBcAg以28nm顆粒形式存在，分子篩層析無法去除大分子蛋白。國內(nèi)王光榮等研究了利用重組表達的核心抗原蛋白制備e抗原的技術(shù)(王光榮黃耀煊，CN 85100276)。
本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于通過基因工程的下游純化技術(shù)，包括離子交換層析、疏水層析和分子篩層析，可有效的去除雜蛋白、核酸等雜質(zhì)，電泳純度達到95％。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，提供了一種重組人乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的生產(chǎn)方法，其特征在于合成HBcAg的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli菌；篩選陽性克隆，高密度發(fā)酵，收集菌體；破菌；經(jīng)分級沉淀、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析純化，最終可得到SDS-PAGE純度95％的HBcAg蛋白，可用于乙型肝炎的預防與治療。
本發(fā)明的乙肝病毒核心抗原可以依據(jù)天然的全長HBcAg基因序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列，構(gòu)建工程菌和蛋白，也可以將全長的HBcAg基因序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列，切除部分免疫原性較弱的片段即C末端的38個氨基酸，C末端半胱氨酸丟失，減少目的抗原片段基因長度，轉(zhuǎn)錄表達出145個氨基酸，有利于工程菌的構(gòu)建和蛋白的表達。SEQ ID No.3為NCBI公布的183基因序列，其中1-3位atg為起始密碼子，550-552位tag為終止密碼子；SEQID No.4為NCBI公布的145基因序列，其中10-12位atg為起始密碼子，445-447位tag為終止密碼子。
本發(fā)明以大腸桿菌表達外源蛋白所偏愛的密碼子替代天然基因的密碼子，設(shè)計所表達HBcAg基因的雙鏈DNA序列。SEQ ID No.1為SEQ ID No.3的替代設(shè)計后基因序列，其中1-3位atg為起始密碼子，550-552位tag為終止密碼子；SEQ ID No.2為SEQ ID No.4的替代設(shè)計后的基因序列，其中1-3位atg為起始密碼子，436-438位tag為終止密碼子。
根據(jù)設(shè)計的DNA序列，通過化學合成基因片段，再用DNA連接酶連接得到完整的基因。合成的基因片段純化后通過PCR擴增，得到兩端帶有供載體連接用的接頭。經(jīng)酶切和質(zhì)粒載體pET-21a(+)直接重組連接得到重組質(zhì)粒pET-21(+)-16，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21-SI受體菌中，得到受體菌單克隆擴大培養(yǎng)。抽取重組菌的質(zhì)粒DNA，作電泳分析，證明含有乙型肝炎病毒核心抗原的結(jié)構(gòu)基因，抽取的DNA作測序表明，其DNA的序列與合成的基因序列完全一致。
本法所用的表達型重組質(zhì)粒的構(gòu)建，是利用引物寡核苷酸引入HBcAg結(jié)構(gòu)基因兩端的BamHI和XhoI酶切點，酶切回收目的基因，插入連接到以pUC19為基礎(chǔ)，T7噬菌體啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體pET-21a(+)，表達載體各組分來源復制子(ori)E.coli的coliE1型，選擇標記Ampr，啟動子T7噬菌體φ10基因的啟動子，終止序列T7噬菌體φ10基因的終止序列，插入點BamHI-XhoI。重組體轉(zhuǎn)化E.coli BL21-SI受體菌中，然后篩選獲得表達HBcAg的工程菌。
取保藏的菌種劃線于含有培養(yǎng)基(如含有蛋白胨、酵母粉、瓊脂的培養(yǎng)基)的平板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時，挑取平板中的單菌落接種于含有培養(yǎng)基(如含有蛋白胨、酵母粉的培養(yǎng)基)的搖瓶中，在搖床上200-300rpm培養(yǎng)15-16小時，使OD600長到1.5-2.5。搖瓶培養(yǎng)后的種子液接種到含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25-32℃。(如發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基為蛋白胨60g、酵母粉30g、葡萄糖30g溶解于6000ml的蒸餾水中，罐內(nèi)121℃滅菌20min，冷卻到30℃后接種。)溶解氧為38-70％，攪拌轉(zhuǎn)速250-400rpm，通氣1∶1-1∶3，NaOH調(diào)節(jié)pH為6.9-7.2。連續(xù)培養(yǎng)約5-7小時后，OD600長到19-21左右，加入NaCl誘導表達，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(補料培養(yǎng)基可以為蛋白胨300g、酵母粉150g，溶解到1000ml的蒸餾水中，121℃滅菌30min，冷卻后10小時內(nèi)勻速補完。)，OD600長到30-40，離心收集菌體。
大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體沉淀。配制破菌緩沖液(如100mMNaOH-Gly，1mM EDTA)，按照菌體∶破菌緩沖液＝1∶18-1∶21(g/ml)比例混合，懸浮完全后超聲，超聲過程中冰浴預冷；然后離心，去沉淀，取上清。
發(fā)酵上清沒有目標蛋白，發(fā)酵后離心收集菌體，破菌后離心取上清，通過控制破菌條件可使目標蛋白90％存在于上清中；使用鹽的分級沉淀比如硫酸銨分級沉淀。硫酸銨分級沉淀，14-17％(g/v)硫酸銨可沉淀大部分的雜蛋白，核心抗原蛋白殘留在上清中，再用20-25％(g/v)硫酸銨濃度沉淀目標蛋白，離心取沉淀，上清里面沒有殘留核心抗原蛋白，90％均在該硫酸銨沉淀里。硫酸銨沉淀可使目標蛋白純度達到約50％，對破菌后產(chǎn)生的核酸等雜質(zhì)也有去除效果。
然后用離子交換層析，填料采用DEAE、Q或QAE，HBcAg(16KD)等電點介于4.5-5.0，離子交換層析流動相1為20-50mmol/L巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂、NaOH-甘氨酸、硼砂-NaOH緩沖液，pH7.0-10，平衡離子交換柱，硫酸銨沉淀用平衡液溶解后上樣，再用1.0mol/L NaCl梯度洗脫，可去除部分雜蛋白及大量其它非蛋白類雜質(zhì)。經(jīng)過離子交換層析可使蛋白純度達到60-70％。
接著用疏水層析，填料采用Sepharose High Performance、Fast Flow系列介質(zhì)，疏水層析流動相1為20-50mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉或鉀-磷酸二氫鈉或鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂緩沖液，pH7.5-8.5，離子交換洗脫樣品中加入硫酸銨或其它鹽類至終濃度1-2mol/L，平衡Phenyl Sepharose High Performance，流速50-300cm/hr，上樣后，再用不加硫酸銨的流動相1洗脫，可去除核酸雜質(zhì)。經(jīng)疏水層析可使蛋白純度達到75％。
最后用分子篩層析，填料采用低吸附的Sepharcryl系列、Superdex系列的介質(zhì)；其流動相為20-50mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉或鉀-磷酸二氫鈉或鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂緩沖液，pH6.5-10.5，其中加入0-3％巰基乙醇或0-4％DTT。緩沖液平衡分子篩柱，樣品濃縮后上樣，分步收集樣品，目標蛋白峰經(jīng)電泳檢測最高純度可達95％。
本發(fā)明制備的重組人乙肝病毒核心抗原可按需要制成各種口服劑型，用于乙型肝炎的預防和治療。劑型包括溶液劑、乳劑、混懸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑等。
本發(fā)明提供一種具有藥用前景的、大規(guī)模獲得重組人乙肝病毒核心抗原的方法，其突出優(yōu)點在于(1)利用E.coli表達16kdHBcAg，其表達量比用E.coli表達全長HBcAg的表達量高約2倍；我們也用酵母系統(tǒng)表達了HBcAg，雖然酵母是分泌表達的，利于后期的蛋白純化，但是由于其表達量比E.coli表達系統(tǒng)低約4倍，且發(fā)酵周期要遠遠長于E.coli表達系統(tǒng)，不易放大生產(chǎn)，成本會大大提高。
(2)采用硫酸銨分級沉淀，操作簡便，無須昂貴的儀器設(shè)備，一步純度可達50％，有效去除核酸等物質(zhì)。
(3)采用離子交換層析，核心抗原可掛柱，經(jīng)過梯度洗脫，能去除部分雜質(zhì)。
(4)疏水層析可去除核酸、脂類等雜質(zhì)。
(5)分子篩層析，目標蛋白的出峰位置位于內(nèi)水峰，而不是外水峰，這樣能和大分子雜蛋白實現(xiàn)有效分離，純度可達95％。而已經(jīng)報道的核心抗原分子篩層析，其核心抗原都是出現(xiàn)在外水峰，與大分子雜蛋白一起流出，無法有效提高蛋白純度。
圖2為Westem-blotting檢測E.coli表達核心抗原。
圖2(1)為HBcAg電泳圖。圖2(2)為轉(zhuǎn)膜后Western-blotting檢測圖。1-蛋白低分子量標準；2-全菌；3-硫酸銨沉淀樣品；4-破菌后樣品；5-空白；6-牛血清白蛋白。
圖3為破菌及硫酸銨分級沉淀各步樣品的SDS-PAGE電泳圖。
1-破菌前；2-破菌后；3-破菌液離心沉淀；4-15％硫酸銨沉淀；5-15％硫酸銨沉淀；6-25％硫酸銨沉淀；7-25％硫酸銨沉淀。8-25％硫酸銨沉淀上清。
圖4為DEAE層析圖譜。
圖5為DEAE層析樣品的SDS-PAGE電泳圖。
1-上樣前樣品(稀釋5倍)；2-上樣前樣品(稀釋5倍)；3-DEAE流出液；4-DEAE流出液；5-DEAE洗脫液；6-DEAE洗脫液。
圖6為疏水層析圖譜。
圖7為疏水層析樣品的SDS-PAGE電泳

圖1-上樣前樣品為；2、3、4、5、6-HIC流出樣品；9-HIC洗脫樣品；10-HIC洗脫樣品。
圖8為分子篩層析圖譜。
圖9為分子篩層析樣品的SDS-PAGE電泳。
實驗材料和方法簡要說明1.試劑、材料PCR儀RoboCycle@Tc-48/H(a)。
BamHI酶和XhoI酶Clontech生產(chǎn)。
發(fā)酵罐15L B.Braun生產(chǎn)。
超聲設(shè)備JY92-II型超聲波細胞粉碎機(寧波科生公司)。
離心機SoRvall@Rc26 Plus。
層析設(shè)備AKTATMexplore(Amersham Biosciences)。
所用層析填料均為Amersham Biosciences生產(chǎn)。
巰基乙醇Sigma生產(chǎn)。
所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
2.常規(guī)分子學操作DNA抽提采用酚抽提和乙醇沉淀的方法(Marmur，J.1961)，先用25∶24∶1(V/V/V)酚/氯仿/異戊醇抽提DNA，取水相，70％乙醇沉淀，風干后TE緩沖液溶解。
PCR擴增采用方法見(Saili et al.，1988)。
DNA測序采用化學測序(Maxam-Gilbert法)(Maxam-Gilbert，1977；1980)。
質(zhì)粒構(gòu)建采用常規(guī)方法(《分子克隆—實驗指南》，科學出版社)實施例1 表達HBcAg(16KD)蛋白的工程菌構(gòu)建依據(jù)大腸桿菌所偏愛的密碼子，按照堿基的簡并性、連續(xù)性，將天然基因見SEQ ID No.3的部分堿基加以修改，修改方法見下表1，切除天然基因的第436位-552位，序列末端加上tag終止密碼子，修改后的基因序列見SEQID No.2，與Genebank M54923.報道的序列相比，改動的序列及變化的氨基酸序列見下表2表1堿基序列的比較




表2氨基酸序列的比較

然后設(shè)計基因SEQ ID No.2第-1至-3位GGG為酶切保護位點，第-4至-9位為BamHI酶切位點，第1-435為改造過HBcAg(145kd)基因，436-438為TAG終止密碼，第439-445位為Xho I酶切位點，第445-446位為酶切保護位點。
根據(jù)設(shè)計的DNA序列，通過化學合成全基因片段。合成的基因片段純化后通過PCR擴增。
PCR擴增所用的引物為N端引物5’GAAGGATCCATGGACGTTGACCC 3’C端引物5’GGCTCGAGCTATTCCGGAAGTG 3’本方法所用的PCR反應條件為第一次反應37℃2min→65℃2min→95℃1min循環(huán)5次再42℃ 2min→65℃2min→95℃1min循環(huán)30次再72℃保溫5min第二次反應55℃1min→65℃2min→95℃1min循環(huán)30次再72℃保溫5min基因經(jīng)PCR擴增后，電泳時可明顯看到455bp的DNA帶，用第二次PCR擴增的產(chǎn)物純化后酶切，與質(zhì)粒載體pET-21a(+)直接重組連接，得到重組質(zhì)粒pET-21(+)-16(見圖1)，然后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21-SI受體菌中，得到受體菌單克隆擴大培養(yǎng)。抽取重組菌的質(zhì)粒DNA，作電泳分析，證明含有乙型肝炎病毒核心抗原的結(jié)構(gòu)基因，抽取的DNA作測序表明，其DNA的序列與合成的基因序列完全一致。(參見圖2、3)本法所用的表達型重組質(zhì)粒的構(gòu)建，是利用引物寡核苷酸引入HBcAg結(jié)構(gòu)基因兩端的BamHI和XhoI酶切點，酶切回收目的基因，插入連接到以pUC19為基礎(chǔ)，T7噬菌體啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體pET-21a(+)，表達載體各組分來源復制子(ori)E. coli的coli E1型，選擇標記Ampr，啟動子T7噬菌體φ10基因的啟動子，終止序列T7噬菌體φ10基因的終止序列，插入點BamHI-XhoI。重組體轉(zhuǎn)化E.coli BL21-SI受體菌中，然后篩選獲得高表達HBcAg的工程菌。
實施例2 發(fā)酵取-70℃保藏的菌種劃線于含有以下培養(yǎng)基的平板上，于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時，平板上有菌落生長。
平板培養(yǎng)基配方蛋白胨10g酵母粉(酵母提取物)5g瓊脂 20g以上成份溶解于1000ml的蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0。121℃蒸氣滅菌20min，冷卻到50℃，加入氨芐西林100mg，搖勻后倒平板。
挑取平板中的單菌落接種于含有以下培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃的搖床中250rpm培養(yǎng)15-16小時，使OD600長到2.0左右。
搖瓶培養(yǎng)基配方蛋白胨 10g酵母粉 5g以上成份溶解于1000ml的蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0。121℃蒸氣滅菌20min，冷卻到室溫，加入氨芐西林100mg，搖勻后接種。
搖瓶培養(yǎng)后的種子液接種到含有以下培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度30℃，溶解氧大于40％，攪拌大于300rpm，通氣1∶2，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0。連續(xù)培養(yǎng)約6小時后，OD600長到20左右，加入NaCl誘導表達，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時，OD600長到30-40，離心收集菌體。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基蛋白胨60g酵母粉30g葡萄糖30g以上成份溶解于6000ml的蒸餾水中，罐內(nèi)121℃滅菌20min，冷卻到30℃后接種。
補料培養(yǎng)基蛋白胨300g酵母粉150g
以上成份溶解到1000ml的蒸餾水中，121℃滅菌30min，冷卻后10小時內(nèi)勻速補完。
實施例3 破菌大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體沉淀。配制破菌緩沖液(100mMNaOH-Gly，1mM EDTA)，按照菌體∶破菌緩沖液＝1∶20(g/ml)比例混合，懸浮完全后，超聲每次3s、間隔3s、共40次，功率500w，50ml/次，超聲過程中冰浴預冷；然后10,000rpm，10分鐘，2-8℃離心，去沉淀，取上清。(電泳結(jié)果見圖3)。
實施例4 分級沉淀取破菌后離心上清，緩慢加入固體硫酸銨(硫酸銨用前干燥磨碎)使終濃度達到15％(g/v)，邊加邊攪拌，室溫攪拌10分鐘，以使沉淀充分；10,000rpm，10分鐘，2-8℃離心，去除沉淀取上清。再同樣加入固體硫酸銨使終濃度達到22.5％(g/v)，室溫攪拌10分鐘；10,000rpm，10分鐘，2-8℃，離心去除上清，取沉淀(電泳結(jié)果見附圖3)。
實施例5 離子交換層析硫酸銨分級沉淀最終產(chǎn)物加入pH 9.5 NaOH-Gly 20mmol/L，溶解后使蛋白總濃度小于0.5mg/ml。透析過夜，外透液pH9.5 NaOH-Gly 20mmol/L。
用pH 9.5 NaOH-Gly 20mmol/L(流動相1)平衡DEAE-Sepharose FF柱，流速100cm/h，上樣后，再用流動相1加1.0mol/L NaCl洗脫，收集洗脫峰(層析圖譜見圖4，電泳結(jié)果見圖5)。
實施例6 疏水層析離子交換層析洗脫樣品加入2mol/L硫酸銨至終濃度1mol/L，邊加邊攪拌，7000rpm，10mins，4-8℃，取上清準備上樣。
用pH8.5 Tris-HCl 20mmol/L加入硫酸銨至終濃度1mol/L作為流動相1，平衡Phenyl Sepharose High Performance，流速50-300cm/hr，上樣后，再用不加硫酸銨的流動相1洗脫，收集洗脫峰(層析圖譜見圖6，電泳結(jié)果見圖7)。
實施例7 分子篩層析DEAE洗脫峰濃縮到4-5mg/ml，要求樣品內(nèi)含有2.5％巰基乙醇、20mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl。
分子篩層析柱高徑比40∶1，填料為Superdex G75；流動相為2.5％巰基乙醇、20mmol/L pH 8.0 Tris-HCl；流速50cm/hr；樣品上樣量小于柱床體積的5％(v/v)，分步收集流出峰(層析圖譜見附圖8，電泳結(jié)果見附圖9)。
權(quán)利要求
1.一種重組人乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的生產(chǎn)方法，其步驟包括合成HBcAg的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli菌；篩選陽性克隆，高密度發(fā)酵，收集菌體；破菌；經(jīng)鹽的分級沉淀、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析純化，最終可得到SDS-PAGE純度95％的HBcAg蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的HBcAg蛋白包括全長HBcAg基因表達產(chǎn)物(23KD)及切除部分免疫原性較弱基因序列后表達的產(chǎn)物，如HBcAg全長基因切除C端部分序列后僅表達氨基酸序列N端145個氨基酸的產(chǎn)物(16KD)。
3.如權(quán)利要求1所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的鹽的分級沉淀為硫酸銨分級沉淀。
4.如權(quán)利要求1所述重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的離子交換層析的填料為DEAE、Q、QAE等陰離子交換劑；疏水層析填料為Sepharose High Performance、Fast Flow系列介質(zhì)；分子篩層析填料為低吸附的Sepharcryl系列、Superdex系列的介質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的離子交換層析的流動相1為20-50mmol/L巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂、NaOH-甘氨酸、硼砂-NaOH緩沖液，pH7.0-10，流動相2為上述相應的流動相1中加入1.0mol/L NaCl梯度洗脫。
6.如權(quán)利要求1所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的疏水層析的流動相1為20-50mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉或鉀-磷酸二氫鈉或鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂緩沖液，pH7.5-8.5，其中加入1-2mol/L硫酸銨或其它鹽類，流動相2為20-50mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉或鉀-磷酸二氫鈉或鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂緩沖液，pH7.5-8.5。
7.如權(quán)利要求1所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的分子篩層析，其流動相為20-50mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉或鉀-磷酸二氫鈉或鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸、硼酸-硼砂緩沖液，pH6.5-10.5，其中加入0-3％巰基乙醇或0-4％DTT。
8.一種用權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法生產(chǎn)的重組人乙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于，可以用于乙型肝炎的預防和治療。
9.如權(quán)利要求8所述的重組人乙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于，可以制成溶液劑、乳劑、混懸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑等各種劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的生產(chǎn)方法,該方法采用化學合成人乙型肝炎病毒核心抗原基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)高密度發(fā)酵后收集菌體，破菌后經(jīng)分級沉淀、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析純化，可大規(guī)模制備電泳純度高達95％的人乙型肝炎病毒核心抗原蛋白。該法純化的重組人乙型肝炎病毒核心抗原可用于人乙型肝炎的預防和治療。
文檔編號A61P1/16GK1434056SQ0211065
公開日2003年8月6日 申請日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者王振鋒, 王英明, 劉國安, 郭新軍, 柯傳奎 申請人:杭州泰士生物科技有限公司