專利名稱：用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體、動物疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程DNA疫苗領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用病毒核心顆粒展示抗原表位的載體、疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，工業(yè)化生產(chǎn)的疫苗主要有三大類:一類是將病原體殺死或弱化以后作為抗原，直接制造疫苗；另一類是應(yīng)用基因工程技術(shù)將抗原基因克隆到細(xì)菌中，通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)抗原蛋白分子，然后制成蛋白質(zhì)疫苗。第三類是將編碼抗原蛋白的基因注射到體內(nèi)，在體內(nèi)源源不斷地生產(chǎn)抗原蛋白，這就是DNA疫苗。但是，若從抗原的類型來衡量，DNA疫苗的本質(zhì)是蛋白質(zhì)疫苗。在這三類疫苗中，蛋白質(zhì)疫苗最為安全，因?yàn)樗缓≡w的遺傳物質(zhì)，不會因預(yù)防注射將病原體導(dǎo)入動物，致使病原體在動物體內(nèi)形成新的傳染源。然而，蛋白質(zhì)疫苗存在兩個重大弱點(diǎn)，在動物疫病預(yù)防上，目前尚不足于與常規(guī)疫苗競爭。第一，蛋白質(zhì)提供的免疫信號較弱。在自然界，動物機(jī)體感知病原體入侵、做出相應(yīng)的免疫反應(yīng)并形成免疫記憶，是通過識別病原體表面的一些特殊分子標(biāo)志來實(shí)現(xiàn)的。這種引起免疫反應(yīng)的標(biāo)記叫做抗原表位(epitopes)?？乖砦皇遣≡w表面的一些分子簇，可以是一簇氨基酸，也可能是氨基酸上的多糖側(cè)鏈，它們是膜蛋白的組成部分，有一定立體構(gòu)型，存在的形式千差萬別。但是，機(jī)體中原始淋巴細(xì)胞naive lymphocytes)種類也足夠多，總會有一種淋巴細(xì)胞能識別新出現(xiàn)的表位，與之結(jié)合、做出免疫反應(yīng)、并形成免疫記憶，在體內(nèi)留存下專門對付這種病原的淋巴細(xì)胞。此后，當(dāng)同一病原體再次入侵體內(nèi)時，免疫系統(tǒng)依靠信息傳遞，能夠刺激對此種病原體特異的淋巴細(xì)胞迅速增值，很快把病原體撲滅。預(yù)防注射的基本原理就是未雨綢繆，事先讓機(jī)體接觸某種病原體，以便形成免疫記憶，達(dá)到預(yù)防疫病發(fā)生的目的。因此，疫苗給機(jī)體提供強(qiáng)烈的免疫信號十分重要，可以說是預(yù)防注射成功與否的關(guān)鍵。然而，用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的抗原蛋白分子，在溶液中呈自由折疊狀態(tài)，雖然形成表位的那些氨基酸簇依然存在，但其立體構(gòu)型與在病原體膜上已經(jīng)不完全相同。所以，注射基因工程蛋白質(zhì)疫苗形成的免疫記憶，與病原體入侵事件相比，并不完全相同，而且免疫信號比較弱。蛋白質(zhì)疫苗與常規(guī)疫苗在 提供免疫信號上的差別，在圖一中做了形象地描述，從圖中可以更好理解蛋白質(zhì)疫苗與弱毒疫苗的根本差別。由于這個緣故，基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)疫苗，免疫效果一般都比不上用弱毒病原和滅活病原制作的疫苗。第二，蛋白質(zhì)疫苗的生產(chǎn)成本高。常規(guī)疫苗的生產(chǎn)方式是細(xì)胞培養(yǎng)，其過程是用少量病原體作為種子，通過感染雞胚或體外培養(yǎng)的細(xì)胞系使病原體自我增殖。當(dāng)病原體增值到一定濃度時，收集和純化病原體、甚至可以把培養(yǎng)液加以濃縮，直接加工成商品疫苗。由于在整個生產(chǎn)過程中充分利用了病原體自我增殖的特性，主要生產(chǎn)成本主要是培養(yǎng)介質(zhì)的消耗，總的成本較低。而生產(chǎn)蛋白質(zhì)疫苗需要通過基因工程細(xì)菌大規(guī)模發(fā)酵，然后從細(xì)菌中提取和純化抗原蛋白質(zhì)，再用純抗原蛋白制作疫苗。由于多了一道抗原分離提純工序，需要購置一定的設(shè)備、消耗許多昂貴的試齊U、而且需要水平更高的技術(shù)人員完成生產(chǎn)過程，生產(chǎn)成本自然會高于常規(guī)疫苗。
如何能才夠克服上述兩種疫苗的缺點(diǎn)，同時又能保留它們各自的優(yōu)點(diǎn)？疫苗研究和技術(shù)改進(jìn)的主要目標(biāo)有三個方面:第一，通過基因缺失和突變技術(shù)研制無致病性的突變體病原。這種病原體保留了弱毒疫苗和滅活疫苗病原體的繁殖力，又不會致病，當(dāng)然很理想。但是，病原體的致病因子往往就是引起免疫反應(yīng)的因子，在克服致病性的同時保留免疫原性不是一件容易辦得到的事情，數(shù)十年來，研究進(jìn)展很小。第二，克服蛋白質(zhì)免疫性不強(qiáng)的弱點(diǎn)。目前主要是通過蛋白質(zhì)融合的方式，增加抗原蛋白的異質(zhì)性。但是，只要是采用離體的自由蛋白質(zhì)分子作為抗原，免疫識別表位的存在形式永遠(yuǎn)不等同于病原體上表位，所以，這種技術(shù)路線對蛋白質(zhì)疫苗的改進(jìn)效果有限。第三，生產(chǎn)空殼病毒制作疫苗。這種路線的出發(fā)點(diǎn)，是去除病原體繁殖的遺傳物質(zhì)，但保留能正常誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)外殼。理論上將，這是一種先進(jìn)的技術(shù)思路，制作的疫苗應(yīng)當(dāng)安全而有效。但是，實(shí)施這種技術(shù)需要使用動物生物反應(yīng)器之類高效生產(chǎn)手段，不然很可能因?yàn)楫a(chǎn)品價格太高而無法推廣?；谏鲜黾夹g(shù)背景，本發(fā)明從免疫信息提供的機(jī)制入手，研究出一種替代技術(shù)，技術(shù)原理類似于空殼病毒，但使用的“殼”不是原來的病原體，而是一種無害病毒。這種疫苗的種安全性類似蛋白質(zhì)疫苗，效能應(yīng)接近常規(guī)疫苗。本發(fā)明是在疫苗生產(chǎn)原理方面是一種新的技術(shù)嘗試，在科學(xué)上有其正當(dāng)理由，在實(shí)用上有巨大經(jīng)濟(jì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體、疫苗及其制備方法，其能最大限度地模擬各種抗原在天然病原體外膜上的存在狀況，進(jìn)而增強(qiáng)抗原呈遞免疫信號，普遍提高蛋白質(zhì)疫苗的免疫效果。本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體，其特征在于:所述載體由基因克隆載體pUC18以及克隆到pUC18載體上的一個DNA片段組成，所述DNA片段的基因序列如SEQ ID NO:1。

一種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位而制備動物疫苗的方法，其特征在于:包括以下步驟:(I)使用乙肝病毒核心蛋白質(zhì)真肽1-149位氨基酸的編碼DNA序列為骨架；(2)去掉所述骨架中組成鉤狀突起的79-82位氨基酸編碼；(3)在所述79-82位氨基酸編碼的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的編碼DNA序列； (4)在所述柔性肽編碼DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的編碼DNA序列，形成三個核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，從而形成一個DNA片段；(5)將所述DNA片段克隆到基因克隆載體pUC18中，形成用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體；(6)在所述核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)插入需展示的抗原基因，完成基因重組；(7)把基因重組后的載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或動物細(xì)胞表達(dá)載體上進(jìn)行基因表達(dá)，產(chǎn)生融合蛋白；(8)生產(chǎn)融合蛋白產(chǎn)品?？蛇x地，所述步驟7采用大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn)行基因表達(dá)，所述步驟8進(jìn)而包括以下步驟:(I)分離包涵體；(2)洗滌包涵體；(3)溶解包涵體；(4)產(chǎn)品純化；(5)蛋白質(zhì)重新折疊。可選地，所述步驟 7采用動物細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行基因表達(dá)，所述步驟8進(jìn)而包括以下步驟:(I)融合蛋白分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中；(2)把細(xì)胞培養(yǎng)液加在層析柱上，使其流過親和層析介質(zhì)，產(chǎn)品得以純化。一種動物疫苗，其特征在于:所述動物疫苗采用如權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的方法制備而成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):由于本發(fā)明利用單一的病毒核心顆?？烧故径喾N不同的抗原表位，并且能最大限度地模擬各種抗原在天然病原體外膜上的存在狀況，用病毒核心顆粒展示抗原表位的載體也很易于構(gòu)建，這使得疫苗制備簡單、生產(chǎn)成本大大降低，與現(xiàn)有疫苗相t匕，免疫信號更加強(qiáng)烈，免疫效果十分突出。


參照附圖，在隨后的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征會更加顯而易見，所述附圖解釋本發(fā)明的優(yōu)選的、非限制的實(shí)施例，其中:圖1是免疫系統(tǒng)對病原體上固定表位和抗原蛋白上游離表位的識別的示意圖，其中，菌體(左)能給免疫細(xì)胞提供強(qiáng)烈免疫信號；而游離表位(右)提供的免疫信號比較弱；圖2是乙肝病毒核心顆粒的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖3是乙肝病毒核心顆粒展示蛋抗原表位的原理的示意圖；圖4是抗原表位展示能提高免疫信號的呈遞的示意圖；圖5是pZNVC的工作模式示意圖；圖6是原核生物表達(dá)載體的示意圖；圖7是真核生物表達(dá)載體的示意圖；圖8是大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的工藝流程的流程圖；圖9是用乙肝病毒核心顆粒展示綠色熒光蛋白的示意圖；圖10是乙肝病毒核心顆粒展示肌肉抑制素真肽的示意圖；圖11是肌肉抑制素基因缺失導(dǎo)致小鼠肌肉超常發(fā)育的對比圖，其中下部圖為正常小鼠的后肢和臀部肌肉，上部圖為基因缺失小鼠超常發(fā)育的后肢和臀部肌肉；圖12是大腸桿菌表達(dá)載體PQE-80L圖譜圖；圖13是真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA 3.1myc-HisA圖譜圖。
具體實(shí)施例方式疫苗的保護(hù)力在于其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)，而機(jī)體免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱依賴抗原提供的免疫信號的強(qiáng)弱。為改進(jìn)抗原蛋白對免疫信號Gpitopes)的呈遞，有幾種可行的技術(shù)值得探索。第一種技術(shù)是通過基因組操作制造無害的突變體，這種思路已被許多人推崇并進(jìn)行著切實(shí)的探索。但是，這種技術(shù)路線也有兩個潛在的弱點(diǎn):首先，是工作難度比較大，找出病原體可以基因缺失或突變的部位，使病原體毒性減低甚至消失而不降低病原體的增值能力，是一件很困難而長期的工作；其次，即使成功地研制出無害的突變毒株，也不是一勞永逸的事，因?yàn)榛蛲蛔兌局觊L期使用后，很可能在被免疫的動物體內(nèi)回復(fù)突變成強(qiáng)毒。第二種受人推崇的技術(shù)是生產(chǎn)空殼疫苗，就是同時表達(dá)病原體的外膜蛋白，體外組裝沒有遺傳物質(zhì)的病毒空殼制作疫苗。這肯定是一項(xiàng)完美的技術(shù)，但只適用于基因組較小的病毒，對于有上百個基因的大型病毒和幾千個基因的病菌，很難同時表達(dá)它們?nèi)勘匾?。同時，能一次表達(dá)好幾個基因的體系，只有動物生物反應(yīng)器能勝任，用其它表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)空殼病毒在成本上不可行。剩下的一種可能就是模擬病原體呈遞表位的技術(shù)，也就是選用某種適宜的病毒作為裝載工具，在其表面表達(dá)其它病原的表位。本發(fā)明采用人乙型肝炎病毒核心蛋白顆粒的作為裝載工具，將各種抗原蛋白質(zhì)，或者含有抗原表位(epitopes)的合成肽鏈，展示在 病毒空殼顆粒的表面，模擬天然病原體在體內(nèi)呈現(xiàn)抗原信號的方式，以期改進(jìn)蛋白質(zhì)疫苗的免疫原性。這種呈遞抗原表位的方式，就其性質(zhì)來講，類似于天然病原體，而與自由狀態(tài)的抗原蛋白質(zhì)分子呈遞表位的方式有很大差別(圖3)。此種技術(shù)發(fā)明的理論基礎(chǔ)，來源于對乙肝病毒的基礎(chǔ)研究。在乙肝病的醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，部分感染乙肝病毒的患者，即便疾病已經(jīng)痊愈，其體內(nèi)長期存在病毒核心顆粒，雖無明顯臨床癥狀但刺激強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(5)。同時，乙肝病毒結(jié)構(gòu)研究證明，乙肝病毒核心顆粒是由一種單一的核心蛋白堆砌而成。該蛋白由183個氨基酸組成，其中N端的144個氨基酸折疊成兩個柱狀體，形成組裝核心顆粒的“砌塊”，尾部的一段氨基酸折疊到顆粒內(nèi)部，而第79-82位氨基酸是連接兩個柱狀體的紐帶，形成暴露在病毒顆粒的表面的突起(圖4)。這個突起也是乙肝病毒核心顆粒主要表位所在之處出)。根據(jù)上述原理，我們采用人工合成的方法，得到了包含編碼乙肝病毒核心顆粒蛋白質(zhì)1-149位氨基酸的一個重組基因。合成過程中消去了第79-82位氨基酸的遺傳密碼，代之以一段編碼柔性肽和核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的DNA片段。這個合成基因可以作為展示異種抗原蛋白的工具(圖5)，用它作為一個技術(shù)平臺構(gòu)建表達(dá)載體(圖6、圖7)，并在適當(dāng)基因表達(dá)系統(tǒng)使基因獲得表達(dá)之后，就形成這樣一種功能蛋白質(zhì):其1-78位氨基酸組成左臂和第83-149位氨基酸組成右臂，將形成組裝病毒顆粒的“砌塊”，在生理?xiàng)l件下能自動組裝成病毒顆粒，連接兩臂的柔性肽將在病毒顆粒表面形成帶狀突起。柔性肽由不帶側(cè)鏈的小氨基酸組成，用來保持乙肝病毒核心抗原蛋白和被展示的蛋白兩種分子的自由度，防止它們相互影響彼此的分子構(gòu)型。因此，若把被展示的抗原蛋白插入其中間部位，該蛋白將會獨(dú)立折疊成其天然構(gòu)型并被展示在乙肝病毒核心顆粒的表面。為了更清楚的說明本發(fā)明能夠模擬天然病原體改進(jìn)蛋白質(zhì)疫苗對免疫信號的提呈，在下一節(jié)中將用圖解的方式展示其工作原理。同時，為證明這種技術(shù)的可靠性，作為應(yīng)用的實(shí)例，特地將水母綠色熒光蛋白和豬的肌肉抑制素活性肽展示在乙肝病毒核心顆粒表面(圖9、圖10)。圖1是免疫系統(tǒng)對病原體上固定表位和抗原蛋白上游離表位的識別的示意圖。圖中左半邊所示，是病原體入侵機(jī)體之后免疫系統(tǒng)做出的反應(yīng)。在這個反應(yīng)中，穿行于血液和淋巴循環(huán)系統(tǒng)之間的先天性淋巴細(xì)胞(naive lymphocytes)能識別病原體表面的表位(epitopes),當(dāng)多個淋巴細(xì)胞受體分子與病原體表位相結(jié)合時,集體向淋巴細(xì)胞和整個免疫系統(tǒng)提供強(qiáng)烈的免疫信號。圖中右半邊所示，是注射游離的抗原蛋白質(zhì)后免疫系統(tǒng)做出的反應(yīng)。在這個反應(yīng)中，由于蛋白質(zhì)分子脫離了細(xì)胞膜，表位(epitopes)分散地存在于游離的蛋白分子上，立體構(gòu)型也發(fā)生變化，雖然淋巴細(xì)胞也能識別這種分散的表位，但傳遞給淋巴細(xì)胞的免疫信號較弱。因此，純化的抗原分子提供的免疫信號弱，免疫效果差。圖2是乙肝病毒核心顆粒的結(jié)構(gòu)的示意圖。乙肝病毒的核心顆粒由90-150個拷貝的核心蛋白分子堆砌而成，每個蛋白分子的兩個功能域折疊成雙柱體，形成建造病毒顆粒的“砌塊”。雙柱體的兩個柱形結(jié)構(gòu)由五個氨基酸組成的短肽連接，連接肽在病毒表面形成鉤狀突起；而富含正電荷的肽段與核酸有親和性，因而被包在顆粒內(nèi)部與遺傳物質(zhì)相結(jié)合。下圖中的線性圖表示乙肝病毒核顆粒心蛋白編碼基因結(jié)構(gòu)，蠟筆狀線條代表病毒核心顆粒蛋白的兩個功能域，中間的黑色粗線條代表想要展示的目標(biāo)蛋白基因，細(xì)的連線代表病毒表面突起的氨基酸編碼。下左邊的柱狀圖顯示病毒顆粒蛋白分子能折疊成許多個柱狀體分子，黑色連線表示目標(biāo)蛋白處在柱狀體頂端。下右圖顯示病毒顆粒的外殼由許多蛋白分子堆砌而成，注意顆粒內(nèi)部的空腔和突出在病毒顆粒表面由黑色短線形成的突起，那是展示目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵部位。圖3是乙肝病毒核心顆粒展示蛋抗原表位的原理的示意圖。根據(jù)乙肝病毒核心顆粒的特性，通過基因重組技術(shù)可以把其它抗原的表位展示在病毒顆粒的表面，成為一種新型疫苗制造技術(shù)。在下圖中，上邊的線性圖代表重組后的乙肝病毒核心顆粒蛋白的基因結(jié)構(gòu)，其中帶有豎粗線條代表新插入的抗原基因，圖中其它部分的意義與圖二中的線形圖相同，即:灰色蠟筆式粗線代表組裝病毒顆 粒的兩個功能域，黑色細(xì)線代表組成病毒突起的幾個氨基酸和連接肽的編碼DNA序列。下邊的圖形代表融合蛋白質(zhì)組裝成病毒顆粒的情況，注意新插入的抗原蛋白被插入到病毒的突起上，原來的鉤狀突起已被延長，抗原蛋白質(zhì)分子被展示在病毒突起上，表位(epitopes)不再呈游離狀態(tài)，而是被固定和分布在病毒顆粒的整個表面。這種技術(shù)模擬病原體向被侵害細(xì)胞呈遞抗原表位的方式，能增強(qiáng)疫苗對免疫f目號的呈遞。圖4是抗原表位展示能提高免疫信號的呈遞的示意圖。決定一種疫苗免疫效能(免疫原性)高低的主要因素，是免疫系統(tǒng)對這種疫苗的識別和做出相應(yīng)的免疫反應(yīng)。當(dāng)一種強(qiáng)毒侵害機(jī)體時，先天淋巴細(xì)胞(naive lymphocytes)與之相遇，淋巴細(xì)胞上的許多受體與病原體上的許多表位同時結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫信號。通過信號傳遞，形成免疫記憶。當(dāng)同一種病原體再次入侵時，將會刺激已經(jīng)存在的淋巴細(xì)胞迅速發(fā)增殖，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，迅速殺滅病原。注射疫苗屬于未雨綢繆，以注射無害抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，形成免疫記憶。當(dāng)真正的病原體來臨時，機(jī)體已有準(zhǔn)備，不會出現(xiàn)嚴(yán)重病癥。疫苗的最重要品質(zhì)是它們的保護(hù)力，保護(hù)力的產(chǎn)生源于疫苗引起免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，而免疫反應(yīng)的強(qiáng)度在于淋巴細(xì)胞對表位的識別。圖中左邊的圖示表示:當(dāng)天然病原體(長圓形桿菌)入侵機(jī)體后，淋巴細(xì)胞借助許多特異受體與病原體的表位結(jié)合，提供強(qiáng)烈的免疫信號。圖中右邊的圖表示:抗原表位經(jīng)乙肝病毒顆粒展示后，每一個病毒顆粒的表面存在90-150個拷貝的抗原分子，淋巴細(xì)胞的許多受體將與同病毒顆粒上的表位結(jié)合，類似與天然病原體，能提供強(qiáng)烈免疫信號。圖5是pZNVC的工作模式示意圖。根據(jù)上述免疫信號產(chǎn)生和傳遞的原理，我們應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了一種專門用來展示各種抗原的基因克隆載體，以便于生產(chǎn)重組乙肝病毒核心蛋白顆粒。這種載體被命名為pZNVC，是用乙肝病毒核心顆粒展示各種表位的基本框架。下面展示的是pZNVC功能元件的DNA序列，即pZNVC主體部分的DNA序列:
權(quán)利要求
1.一種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體，其特征在于:所述載體由基因克隆載體pUC18以及克隆到pUC18載體上的一個DNA片段組成，所述DNA片段的基因序列如SEQID NO:1。
2.—種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位而制備動物疫苗的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)使用乙肝病毒核心蛋白質(zhì)真肽1-149位氨基酸的編碼DNA序列為骨架； (2)去掉所述骨架中組成鉤狀突起的79-82位氨基酸編碼； (3)在所述79-82位氨基酸編碼的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的編碼DNA序列； (4)在所述柔性肽編碼DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的編碼DNA序列，形成三個核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，從而形成一個DNA片段； (5)將所述DNA片段克隆到基因克隆載體pUC18中，形成用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體； (6)在所述核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)插入需展示的抗原基因，完成基因重組； (7)把基因重組后的載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或動物細(xì)胞表達(dá)載體上進(jìn)行基因表達(dá)，產(chǎn)生融合蛋白； (8)生產(chǎn)融合蛋白產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟7采用大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn)行基因表達(dá)，所述步驟8進(jìn)而 包括以下步驟: (1)分離包涵體； (2)洗滌包涵體； (3)溶解包涵體； (4)產(chǎn)品純化； (5)蛋白質(zhì)重新折疊。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟7采用動物細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行基因表達(dá)，所述步驟8進(jìn)而包括以下步驟: (1)融合蛋白分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中； (2)把細(xì)胞培養(yǎng)液加在層析柱上，使其流過親和層析介質(zhì)，產(chǎn)品得以純化。
5.一種動物疫苗，其特征在于:所述動物疫苗采用如權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的方法制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用乙肝病毒核心顆粒展示抗原表位的載體、動物疫苗及其制備方法，其采用人工合成DNA的方法，合成乙肝病毒核心蛋白必要的氨基酸的編碼DNA序列。在合成過程中，使用乙肝病毒核心蛋白質(zhì)真肽1-149位氨基酸的編碼DNA序列為骨架，去掉了骨架中第79-82位氨基酸的編碼序列，只保留與組裝病毒顆粒有關(guān)的編碼DNA；為便利乙肝病毒核心顆粒蛋白中插入其它抗原蛋白，特別在第79-82位氨基酸的部位插入一段編碼柔性肽的DNA序列，并在該序列中引入三個內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于基因操作；將上述合成DNA片段克隆到基因克隆載體pUC18中，形成用來展示抗原表位的專門載體pZNVC。在pZNVC插入一個抗原蛋白基因或編碼表位的合成DNA片段，并在原核或真核生物中表達(dá)出融合蛋白，乙肝病毒N端的78個氨基酸和C端的68個氨基酸將折疊成兩個柱狀體，形成組裝核心蛋白顆粒的“砌塊”；柔性肽將形成連接兩個柱狀體的紐帶，而插在柔性肽中間的蛋白質(zhì)將突起在病毒顆粒的表面。柔性肽是由不帶側(cè)鏈的一串小氨基酸組成，具有柔韌性，不干擾乙肝病毒核心顆粒蛋白和抗原蛋白各自獨(dú)自折疊成其天然分子構(gòu)型。使用pZNVC來展示抗原蛋白抗原表位，可以最大限度地模擬它們在天然病原體外膜上的存在狀況。
文檔編號A61P31/20GK103184231SQ20111045494
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者陳永福, 張國華, 鄭立, 于娟娟, 張巖松 申請人:北京中農(nóng)創(chuàng)新生物工程研究院有限公司