專利名稱：人類sars病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽、多核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有人類SARS病毒免疫原性的多肽及相應(yīng)的多核苷酸序列及它們在制備人類SARS診斷芯片和疫苗上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又叫傳染性非典性肺炎，是一種于2003年上半年在全球約30多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生的惡性傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。截至2003年7月，全球共累計(jì)報(bào)告SARS病例約8000多例，死亡近800人。由于SARS具有發(fā)病迅速、傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已受到全社會(huì)的廣泛關(guān)注，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)迅速建立起由全球10個(gè)國家的13個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的協(xié)作研究和監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)幾種新型的冠狀病毒是主要的病原體，2003年4月16日WHO正式確認(rèn)冠狀病毒亞型的變種即SARS病毒是引起人體產(chǎn)生SARS的主要原因。目前已從世界不同SARS病區(qū)分離出7個(gè)SARS病毒變種，并進(jìn)行了SARS病毒的基因組學(xué)分析。
冠狀病毒(Coronavirus)是一個(gè)較大的RNA病毒家族，而SARS冠狀病毒屬于這一家族中新出現(xiàn)的類群。它的宿主是非常廣泛的(包括哺乳動(dòng)物、鳥類等)。對SARS病毒基因組全序列分析，發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒是由29736-Nucleotide，polyadenylated RNA組成，基因組大約可編碼20多個(gè)不同的蛋白質(zhì)，其中主要的結(jié)構(gòu)蛋白有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)、S蛋白(spike protein)、E蛋白(envelopprotein)、M蛋白(membrane protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)等。
SARS冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(S蛋白，E蛋白，M蛋白，和N蛋白)是相對保守的分子，同時(shí)也是病毒形態(tài)建成和感染的主要相關(guān)組分，其中S蛋白和M蛋白可能是SARS病毒導(dǎo)致細(xì)胞感染，引起人體嚴(yán)重病理反應(yīng)的最重要致病因素。SARS病毒S蛋白是SARS病毒侵染人體過程中的關(guān)鍵蛋白。正因如此，目前國際上對SARS病毒的研究大多集中在S蛋白上。S蛋白的羧基端含有一個(gè)半胱氨酸富集區(qū)和一個(gè)穿膜區(qū)，另外在氨基端還存在一個(gè)13個(gè)氨基酸的信號肽區(qū)域。與現(xiàn)有已知冠狀病毒蛋白序列的對比分析，發(fā)現(xiàn)S蛋白的保守性相當(dāng)高，是研究開發(fā)SARS藥物重要藥物靶點(diǎn)，但過高的同源性對開發(fā)應(yīng)用于診斷的試劑是不利的。M蛋白是一個(gè)膜蛋白，一級結(jié)構(gòu)序列約含有221個(gè)氨基酸，分子量在25Kd左右。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，M蛋白有3個(gè)疏水性α螺旋區(qū)組成的跨膜區(qū)，N端處于膜外，可能由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，是一個(gè)決定并影響病毒出芽的重要結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明抗M糖蛋白包膜外區(qū)的抗體，在補(bǔ)體的協(xié)助下，可以抑制病毒的感染；此外，冠狀病毒的M糖蛋白還可以誘導(dǎo)α-IFN的產(chǎn)生，因此SARS病毒的M樣蛋白也作為研發(fā)疫苗候選分子篩選的靶標(biāo)分子。
目前SARS診斷主要有兩種途徑一種是利用RT-PCR技術(shù)針對SARS病毒檢測的方法，它能夠在早期臨床檢測中及時(shí)發(fā)現(xiàn)SARS患者，但目前這種方法應(yīng)用到臨床上還需完善。一方面PCR試劑盒在特異性、敏感性、試劑規(guī)范性上需要提高，另一方面在病人標(biāo)本的采集上需要摸索，如在病人感染后什么時(shí)間采標(biāo)本？采什么地方的哪類標(biāo)本最適合做PCR分析等都還是問題。第二種途徑就是采用抗體檢測。由于目前SARS病毒的傳代培養(yǎng)極為困難，而且SARS病毒具高度傳染性，在病原體制備滅活抗原過程中存在SARS疾病的傳播危險(xiǎn)，所以通過大量培養(yǎng)SARS病毒來制備抗原的方法是非常困難的。因此，通過人工合成或重組DNA技術(shù)來制備SARS病毒的抗原決定簇多肽，對SARS進(jìn)行診斷和預(yù)防是最理想的，但有一個(gè)前提就是要進(jìn)行SARS病毒的抗原多肽和疫苗候選分子的篩選，這正是本發(fā)明專利所涉及的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于針對上述人類SARS診斷和預(yù)防的現(xiàn)狀，提供能促使人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽，并應(yīng)用于制備人類SARS多肽診斷芯片和多肽疫苗。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種編碼人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的多核苷酸序列及與該多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸序列，并應(yīng)用于制備人類SARS診斷芯片和疫苗。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽，為如下五種多肽片段之一，其氨基酸序列分別為
(1)ln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-Val；(2)Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-Ile；(3)Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-Ser；(4)Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ala；(5)Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr。
編碼上述五種多肽片段的相應(yīng)核苷酸序列分別為(1)CAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTA；(2)TGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT；(3)GTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGT；(4)TCT TAT TAC AAA TTA GGA GCG(6)GTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。
上述五種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽片段的篩選過程如下(1)SARS病毒表面膜蛋白親水性分析SARS病毒表面膜蛋白由221個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如下(Monroe等2003，NCBI Sequence AAP13444)1 madngtitve elkqlleqwn lvigflflaw imllqfaysn rnrflyiikl vflwllwpvt61 lacfvlaavy rinwvtggia iamacivglm wlsyfvasfr lfartrsmws fnpetnilln121 vplrgtivtr plmeselvig aviirghlrm aghplgrcdi kdlpkeitva tsrtlsyykl181 gasqrvgds gfaaynryri gnyklntdha gsndniallv q用Gene-tyx-MAC9.0分析SARS病毒表面膜蛋白的親水性，在SARS病毒表面膜蛋白內(nèi)，親水性區(qū)域主要在兩個(gè)部分一部分是1-52氨基酸片段，另一部分是101-221氨基酸片段，中間部分第53-100氨基酸是疏水部分，如圖1所示。本發(fā)明所篩選的抗原表位主要在親水區(qū)域。
(2)SARS病毒表面膜蛋白親水性區(qū)域線性重疊肽鏈文庫制備線性重疊肽鏈文庫是篩選新的疫苗候選分子及其診斷抗原、多肽疫苗的合成和單克隆抗體的制備的重要工具。
將SARS病毒表面膜蛋白親水性區(qū)域1-52和101-221的氨基酸輸入到Auto-spot-Robot計(jì)算機(jī)內(nèi)，編輯制備6個(gè)氨基酸為1個(gè)肽鏈單位，且每相鄰兩個(gè)肽鏈單位之間僅有一個(gè)氨基酸差異的線性重疊肽鏈庫。SARS病毒表面膜蛋白親水性區(qū)域肽鏈文庫如下所示1 M A D N G T 2 A D N G T I 3 D N G T I T4 N G T I T V 5 G T I T V E 6 T I T V E E7 I T V E E L 8 T V E E L K 9 V E E L K Q10 E E L K Q L 11 E L K Q L L 12 L K Q L L E13 K Q L L E Q 14 Q L L E Q W 15 L L E Q W N16 L E Q W N L 17 E Q W N L V 18 Q W N L V I19 W N L V I G 20 N L V I G F 21 L V I G F L22 V I G F L F 23 I G F L F L 24 G F L F L A25 F L F L A W 26 L F L A W I 27 F L A W I M28 L A W I M L 29 A W I M L L 30 W I M L L Q31 I M L L Q F 32 M L L Q F A 33 L L Q F A Y34 L Q F A Y S 35 Q F A Y S N 36 F A Y S N R37 A Y S N R N 38 Y S N R N R 39 S N R N R F40 N R N R F L 41 R N R F L Y 42 N R F L Y I43 R F L Y I I 44 F L Y I I K 45 L Y I I K L46 Y I I K L V 47 I I K L V F 4849 L F A R T R 50 F A R T R S 51 A R T R S M52 R T R S M W 53 T R S M W S 54 R S M W S F55 S M W S F N 56 M W S F N P 57 W S F N P E58 S F N P E T 59 F N P E T N 60 N P E T N I61 P E T N I L 62 E T N I L L 63 T N I L L N64 N I L L N V 65 I L L N V P 66 L L N V P L67 L N V P L R 68 N V P L R G 69 V P L R G T70 P L R G T I 71 L R G T I V 72 R G T I V T73 G T I V T R 74 T I V T R P 75 I V T R P L76 V T R P L M 77 T R P L M E 78 R P L M E S79 P L M E S E 80 L M E S E L 81 M E S E L V
82 E S E L V I 83 S E L V I G 84 E L V I G A85 L V I G A V 86 V I G A V I 87 I G A V I I88 G A V I I R 89 A V I I R G 90 V I I R G H91 I I R G H L 92 I R G H L R 93 R G H L R M94 G H L R M A 95 H L R M A G 96 L R M A G H97 R M A G H S 98 M A G H S L 99 A G H S L G100 G H S L G R 101 H S L G R C 102 S L G R C D103 L G R C D I 104 G R C D I K 105 R C D I K D106 C D I K D L 107 D I K D L P 108 I K D L P K109 K D L P K E 110 D L P K E I 111 L P K E I T112 P K E I T V 113 K E I T V A 114 E I T V A T115 I T V A T S 116 T V A T S R 117 V A T S R T118 A T S R T L 119 T S R T L S 120 S R T L S Y121 R T L S Y Y 122 T L S Y Y K 123 L S Y Y K L124 S Y Y K L G 125 Y Y K L G A 126 Y K L G A S127 K L G A S Q 128 L G A S Q R 129 G A S Q R V130 A S Q R V G 131 S Q R V G T 132 Q R V G T D133 R V G T D S 134 V G T D S G 135 G T D S G F136 T D S G F A 137 D S G F A A 138 S G F A A Y139 G F A A Y N 140 F A A Y N R 141 A A Y N R Y142 A Y N R Y R 143 Y N R Y R I 144 N R Y R I G145 R Y R I G N 146 Y R I G N Y 147 R I G N Y K148 I G N Y K L 149 G N Y K L N 150 N Y K L N T151 Y K L N T D 152 K L N T D H 153 L N T D H A154 N T D H A G 155 T D H A G S 156 D H A G S N157 H A G S N D 158 A G S N D N 159 G S N D N I160 S N D N I A 161 N D N I A L 162 D N I A L L163 N I A L L V 164 I A L L V Q肽鏈庫的合成方法如下用活化劑1-Methyl-2-Pyrroliclon(NMP)溶解用于肽鏈庫構(gòu)建所需要的氨基酸，在第一個(gè)氨基酸點(diǎn)樣前，必須將固相的纖維素膜用Fmocβ-alamine進(jìn)行脫保護(hù)處理，再用Auto-spotRobot(Gilson，Villiers le Vile，F(xiàn)rance)全自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)進(jìn)行第一個(gè)氨基酸的點(diǎn)樣，并分別用20％piperdine洗膜15-20min，脫去Fmoc基團(tuán)，用DMF(N，N-Dimethyl formamide)洗滌纖維素膜4-5遍，每次3min；用膜染色液BPB(Bromophenol Blue)染色2min；用無水酒精洗滌膜2次，每次5min；冷風(fēng)干燥，再進(jìn)行第二個(gè)氨基酸的點(diǎn)樣，每個(gè)氨基酸點(diǎn)樣完后都需按前面的程序進(jìn)行洗滌、染色和干燥等過程，待最后的氨基酸點(diǎn)樣完畢后需經(jīng)過5％phenol、50％TFA、2.5％ethan-dithiol、5％thioanisole，5％水和0.5ml DCM進(jìn)行側(cè)鏈的脫保護(hù)處理。
(3)人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇篩選來自中國廣東省深圳市SARS病人陽性血清庫的8份陽性血清與本發(fā)明制備的人類SARS病毒表面膜蛋白線性重疊肽鏈庫芯片進(jìn)行DOT-ELISA反應(yīng)。具體方法如下將肽鏈芯片用封閉緩沖液BlockingBuffer封閉，在4℃的條件下過夜，用沖洗緩沖液Washing Buffer洗三次，每次5分鐘。將上述處理后的肽鏈芯片與SARS患者血清在37℃下孵化1小時(shí)，與標(biāo)記的抗人免疫球蛋白在37℃下孵化1小時(shí)，用Washing Buffer洗三次，再用DAB發(fā)色，蒸餾水沖洗并干燥。
肽鏈庫與SARS陽性血清DOT-ELISA反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在五個(gè)共同位點(diǎn)上發(fā)生了強(qiáng)烈的雜交陽性反應(yīng)，而對照血清均沒有在肽鏈芯片的這些位點(diǎn)起反應(yīng)，如圖2所示。用計(jì)算機(jī)數(shù)字識別系統(tǒng)定量測定DOT-ELISA反應(yīng)的強(qiáng)度，測定得到5個(gè)共同的B細(xì)胞表位，這就是本發(fā)明所涉及的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇，其氨基酸序列和編碼的相應(yīng)核苷酸序列如下所示MKY1Gln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-ValCAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTAMKY2Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-IleTGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT
MKY3Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-SerGTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGTMKY4Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-AlaTCT TAT TAC AAA TTA GGA GCGMKY5Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-TyrGTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。
把上述人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽應(yīng)用于制備人類SARS疾病快速診斷多肽芯片多肽芯片中的多肽包括前述的五種多肽之一，或每種多肽重復(fù)多次的多肽片段之一，或五種多肽片段之間任意組合以酰胺聯(lián)鎖偶聯(lián)在一起形成的多肽片段之一，或前述各種多肽之間任意組合而成的多肽組合物。
制備人類SARS診斷多肽芯片的第一步是五種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的制備。其制備方法有兩種(1)化學(xué)合成法利用CEM生產(chǎn)的微波多肽合成儀(The First Microwave PeptideSynthesizer)，通過固相法合成抗原決定簇多肽，具體方法和步驟見文獻(xiàn)(Jonathan M.Collins，Michael J.Collins，Rebecca C.Steorts.Novel Method for Solid Phase Peptide Synthesis Using MicrowaveEnergy.Prensented at American Peptide Symposium，July，2003)。各種肽的純度用薄層色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行評定，并測定抗原多肽的濃度。(2)利用重組DNA技術(shù)原核表達(dá)法利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建重復(fù)抗原多核苷酸序列的表達(dá)載體(圖4)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)抗原決定簇多肽，經(jīng)過表達(dá)產(chǎn)物的后加工和純化，制備抗原決定簇多肽。
制備人類SARS診斷多肽芯片的第二步，是利用多肽點(diǎn)樣儀將前述多肽芯片中的多肽點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜上面，并通過固定Buffer將該多肽固定在膜上，制成人類SARS疾病診斷芯片。
使用上述人類SARS診斷多肽芯片來診斷人類SARS疾病的操作程序和基本方法如圖3所示。將該膜芯片應(yīng)用于中國廣東深圳市的SARS病人陽性血清，在10份陽性血清和10份陰性血清的對照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)診斷膜芯片上五個(gè)肽位點(diǎn)均能與陽性血清反應(yīng)，而陰性血清(包括乙肝、甲肝等患者和正常人的血清)則沒有出現(xiàn)五個(gè)位點(diǎn)同時(shí)反應(yīng)的情況。這說明本發(fā)明的診斷膜芯片在SARS診斷中的準(zhǔn)確率是非常高的。
把本發(fā)明的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽應(yīng)用于制備人類SARS病毒多肽疫苗如前所述，本發(fā)明的五種抗原決定簇多肽可直接合成或通過融合蛋白制得，這類肽基本上不含SARS病毒原的其它蛋白及感染體本身，因此可把它用作疫苗而不擔(dān)心傳入疾病。本發(fā)明的多肽疫苗包括前述的五種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽之一，或每種多肽重復(fù)多次的多肽片段之一，或五種多肽片段之間任意組合以酰胺聯(lián)鎖偶聯(lián)在一起形成的多肽片段之一，或前述各種多肽之間任意組合而成的多肽組合物，以及合適的載體或佐劑。
用25μg人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽組合物(由五種多肽同比例組成)和等量的CpG單核苷酸(5`-tcc atg acg ttc acgtt-3`)混合，免疫6周的BALB/c雌鼠，免疫2周后用25μg多肽組合物和等量的CpG單核苷酸再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫兩周后從小鼠的心臟中采血，并進(jìn)行血清學(xué)分析。結(jié)果表明免疫動(dòng)物有高滴度的IgG抗體產(chǎn)生。本發(fā)明的人類SARS抗原決定簇多肽無論是免疫融合多肽還是合成肽，均顯示出了一定程度的免疫力，能充分誘發(fā)產(chǎn)生中和SARS病毒抗體，因此本發(fā)明的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽組合物用作疫苗，可用于人類免疫抵抗SARS病毒感染。
本發(fā)明的抗原決定簇多肽、每種多肽重復(fù)多次的多肽片段、五種多肽片段之間任意組合以酰胺聯(lián)鎖偶聯(lián)在一起形成的多肽片段在作為疫苗時(shí)常常與諸如雙偶氮化的聯(lián)甲苯鍵等相關(guān)載體物質(zhì)結(jié)合，也可與諸如弗氏佐劑、德氏佐劑等組合，成為疫苗組合物以提高抗原多肽的免疫效果。
編碼上述人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的多核苷酸序列及與該多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸序列，均可應(yīng)用于制備人類SARS診斷核苷酸芯片以及應(yīng)用于制備人類SARS核苷酸疫苗。多核苷酸的合成方法及核苷酸診斷芯片及核苷酸疫苗的制備方法均為成熟的技術(shù)。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1是SARS病毒表面膜蛋白的親水性分析圖。
圖2是使用DOT-ELISA在人類SARS病毒表面膜蛋白肽鏈庫中篩選的B細(xì)胞表位圖。
圖3是用本發(fā)明的SARS診斷多肽芯片診斷SARS疾病的操作程序與方法流程圖。
圖4是用于人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽原核表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-H2的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5本發(fā)明實(shí)施例中SARS快速診斷多肽芯片的正面結(jié)構(gòu)圖。
圖6是本發(fā)明實(shí)施例中用SARS診斷多肽芯片檢測結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
一、人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的制備本實(shí)施例采用化學(xué)合成法制備本發(fā)明的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽。化學(xué)合成法是利用CEM公司生產(chǎn)的The FirstMicrowave Peptide Synthesizer，通過Fmoc固相法合成抗原決定簇多肽，具體方法和步驟見文獻(xiàn)(Jonathan M.Collins，MichaelJ.Collins，Rebecca C.Steorts.Novel Method for Solid PhasePeptide Synthesis Using Microwave Energy.Prensented atAmerican Peptide Symposium，July，2003)。
本發(fā)明也可以利用重組DNA技術(shù)原核表達(dá)法制備人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽。具體步驟如下根據(jù)五種SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，獲得相應(yīng)的五種核苷酸序列，在五種核苷酸序列兩端加上NheI和SpeI的核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)，通過DNA合成儀分別合成多核苷酸片段，酶切后，將每一種片段定向克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-H2中，然后利用NheI和SpeI酶切后的粘性突出未端均為CATG的特點(diǎn)，在該質(zhì)粒上構(gòu)建多串重復(fù)片段序列，經(jīng)測序確認(rèn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21，培養(yǎng)誘導(dǎo)，獲得的重組產(chǎn)物為帶His-tag的多串抗原表位多肽的融合肽鏈，通過親和層析純化獲得五種SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇重復(fù)多次的多肽，根據(jù)進(jìn)一步的應(yīng)用需求，制備成SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽或重復(fù)多次的多肽片段，并利用高壓液相色譜和質(zhì)譜測定分離鑒定重組表達(dá)的五種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽。
二、將人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽制備成SARS診斷多肽膜芯片上一步通過化學(xué)合成法得到純度為95％的五種抗原決定簇多肽，將其用多肽固定緩沖液(組成成分為Na2CO3795g+NaHCO31.465g+NaN30.1g+500ml水)溶解，并使多肽濃度稀釋到1μg/μl。利用多肽點(diǎn)樣儀將SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽點(diǎn)樣在帶方格的長方形硝酸纖維素膜上面，每個(gè)樣品點(diǎn)1μl，每次點(diǎn)樣后在室溫下放置數(shù)分鐘，讓膜片自然干燥后再進(jìn)行第二次點(diǎn)樣，重復(fù)3次，制成SARS診斷多肽膜芯片，如圖5所示。圖5中標(biāo)號1至5分別表示MKY1、MKY2、MKY3、MKY4、MKY5五種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽，6為陽性對照，為人免疫球蛋白，7為陰性對照。
三、SARS診斷多肽膜芯片的使用在SARS診斷多肽膜芯片使用前，先用封閉緩沖液(BlockingBuffer)即5％的除脂奶粉對膜片上的多肽進(jìn)行封閉，用沖洗緩沖液(Washing Buffer)(主要組分為PBS(pH 7.4)+0.05％tween20)沖洗三遍，每次5分鐘。在37℃條件下與疑似病人血清1ml孵化1小時(shí)，再用Washing Buffer沖洗三次，每次5分鐘。在37℃條件下與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白(1μg/μl)孵化1小時(shí)，用Washing Buffer沖洗三次，每次5分鐘，用鄰苯二氨(DAB)發(fā)色，并用雙蒸水沖洗，觀察反應(yīng)結(jié)果。將該膜芯片應(yīng)用于中國廣東深圳市的SARS陽性血清庫，在10份陽性血清和10份陰性血清的對照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)診斷膜芯片上五個(gè)肽位點(diǎn)均能與陽性血清反應(yīng)，而陰性血清(包括乙肝、甲肝等患者和正常人的血清)則沒有出現(xiàn)五個(gè)抗原表位多肽同時(shí)反應(yīng)的情況，結(jié)果如圖6所示，圖6中黑色斑點(diǎn)表示陽性結(jié)果，綠色斑點(diǎn)表示陰性結(jié)果。這說明本發(fā)明的診斷膜芯片在SARS診斷中特異性地識別SARS感染者血清，是SARS診斷和鑒別診斷的有效方法。
四、將人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽制備成人類SARS病毒抗原多肽疫苗及其免疫方法用25μg人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽組合物(由五種多肽同比例組成)，加入細(xì)菌非甲基化含CpG的單核苷酸(5`-tccatg acg ttc acg tt-3`)組分制成疫苗組合物，其具體配方如下SARS表面膜蛋白抗原多肽組合物25ug與CpG單核苷酸25ug混合制成疫苗組合物，免疫6周的BALB/c雌鼠一次后，等兩周時(shí)間，再加強(qiáng)免疫一次，免疫兩周后從小鼠的心臟中采血，并進(jìn)行血清學(xué)分析。結(jié)果表明免疫動(dòng)物有高滴度的IgG抗體產(chǎn)生。
氨基酸和核苷酸序列表<110>深圳大學(xué)、深圳市疾病控制中心<120>人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽組合物及其在制備診斷芯片和疫苗上的應(yīng)用<160>5<210>1<211>9(氨基酸序列)；27(核苷酸序列)<212>PRT；RNA<213>人類SARS冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)<400>1Gln Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val151 caa ctc ctg gaa caa tgg aac cta gta 27<210>2<211>9(氨基酸序列)；27(核苷酸序列)<212>PRT；RNA<213>人類SARS冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)<400>2Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile151 tgg tca ttc aac cca gaa aca aac att 27<210>3<211>8(氨基酸序列)；24(核苷酸序列)<212>PRT；RNA<213>人類SARS冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)<400>3Val Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser1 51 gtg acc aga ccg ctc atg gaa agt 24
<210>4<211>7(氨基酸序列)；21(核苷酸序列)<212>PRT；RNA<213>人類SARS冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)<400>4Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala1 51 tct tat tac aaa tta gga gcg 21<210>5<211>10(氨基酸序列)；30(核苷酸序列)<212>PRT；RNA<213>人類SARS冠狀病毒(SARS coronavirus Urbani)<400>5Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr1 51 gta ggc act gat tca ggt ttt gct gca tac 30
權(quán)利要求
1.一種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽，為如下五種多肽片段之一，其氨基酸序列分別為(1)Gln-Leu-Leu-Glu-Gln-Trp-Asn-Leu-Val；(2)Trp-Ser-Phe-Asn-Pro-Glu-Thr-Asn-Ile；(3)Val-Thr-Arg-Pro-Leu-Met-Glu-Ser；(4)Ser-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ala；(5)Val-Gly-Thr-Asp-Ser-Gly-Phe-Ala-Ala-Tyr。
2.權(quán)利要求1所述的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽在制備人類SARS診斷芯片上的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽在制備人類SARS診斷芯片上的應(yīng)用，多肽芯片中的多肽包括權(quán)利要求1所述的五種多肽之一，或每種多肽重復(fù)多次的多肽片段之一，或五種多肽片段之間任意組合以酰胺聯(lián)鎖偶聯(lián)在一起形成的多肽片段之一，或前述各種多肽之間任意組合而成的多肽組合物。
4.權(quán)利要求1所述的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽在制備人類SARS疫苗上的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽在制備人類SARS疫苗上的應(yīng)用，疫苗包括權(quán)利要求1所述的五種多肽之一，或每種多肽重復(fù)多次的多肽片段之一，或五種多肽片段之間任意組合以酰胺聯(lián)鎖偶聯(lián)在一起形成的多肽片段之一，或前述各種多肽之間任意組合而成的多肽組合物。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述的人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的多核苷酸序列及與該多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸序列，所述編碼人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽的多核苷酸序列分別如下(1)CAA CTC CTG GAA CAA TGG AAC CTA GTA；(2)TGG TCA TTC AAC CCA GAA ACA AAC ATT；(3)GTG ACC AGA CCG CTC ATG GAA AGT；(4)TCT TAT TAC AAA TTA GGA GCG(5)GTA GGC ACT GAT TCA GGT TTT GCT GCA TAC。
7.權(quán)利要求6所述的多核苷酸序列在制備人類SARS診斷芯片上的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的多核苷酸序列在制備人類SARS疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種人類SARS病毒表面膜蛋白抗原決定簇多肽、多核苷酸序列及其應(yīng)用，所述抗原決定簇多肽的氨基酸序列為(1)Gln－Leu－Leu－Glu－Gln－Trp－Asn－Leu－Val；(2)Trp－Ser－Phe－Asn－Pro－Glu－Thr－Asn－Ile；(3)Val－Thr－Arg－Pro－Leu－Met－Glu－Ser；(4)Ser－Tyr－Tyr－Lys－Leu－Gly－Ala(5)Val－Gly－Thr－Asp－Ser－Gly－Phe－Ala－Ala－Tyr。本發(fā)明的多肽制備的診斷芯片能特異性地識別SARS感染者血清，是理想的診斷工具，而且這類肽及其組合物基本上不含SARS病毒原的其它蛋白及感染體本身，因此把它用作疫苗，可有效地預(yù)防SARS病毒感染。
文檔編號G01N33/569GK1580073SQ200310116639
公開日2005年2月16日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者胡章立, 張仁利, 邢苗 申請人:深圳大學(xué)