含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物制劑，尤其是一種含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 乙型肝炎是一種嚴重威脅人類健康的世界性傳染疾病，它是由乙型肝炎病毒 (HBV)的感染而引起的疾病。目前，接種乙肝疫苗是預防和控制HBV傳播的最有效的措施之 一。現(xiàn)在最常使用的乙肝疫苗是由基因重組技術獲得的乙肝表面抗原（HBsAg)經純化、滅 活及加入鋁佐劑吸附而成的鋁佐劑乙肝疫苗。然而，為了達到持久而有效的免疫應答效果， 鋁佐劑乙肝疫苗需在0,1，2個月或0,1，6個月進行三次注射的免疫程序，由于免疫程序復 雜，導致相當一部分人難以完成免疫程序，這種現(xiàn)象在發(fā)展中國家更為嚴重。此外，鋁佐劑 乙肝疫苗僅選擇性刺激機體產生體液免疫應答，而不能有效誘導產生細胞免疫應答，不能 有效清除細胞內存在的HBV病毒。因而，臨床需要研發(fā)新型強效乙肝疫苗，簡化免疫程序， 使更廣泛的人群受到有效的保護。
[0003] 聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物（PLGA)是一種高分子聚合物材料，將抗原包封在 PLGA微球內可以實現(xiàn)抗原的緩慢釋放，制成單次注射緩釋微球疫苗制劑。但是，在微球制備 過程中涉及到冷凍干燥和抗原在有機溶劑中分散的乳化過程，這兩個過程均容易導致抗原 變性，免疫原性下降。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是提供一種單次注射的重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑，以克 服乙肝表面抗原的免疫原性在微球制備和釋放過程中被破壞導致抗原變性進而影響免疫 效果的問題。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑的制備方法。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑，該緩釋微球制劑是 以穩(wěn)定性保護劑和重組乙肝表面抗原微粒組成內核，由高分子材料聚乳酸-聚羥基乙酸嵌 段共聚物作外包封層組合而成；所述穩(wěn)定劑為海藻糖、人血清白蛋白。
[0007] 本發(fā)明中，重組乙肝表面抗原與所述穩(wěn)定性保護劑的質量比優(yōu)選為I: (1~20)。 較優(yōu)選為I: (1~10)，考慮生產成本等影響因素，更優(yōu)選為1 : 5。
[0008] 本發(fā)明中，所述重組人乙肝表面抗原為酵母乙型肝炎表面抗原或中國倉鼠卵巢細 胞分泌的乙型肝炎表面抗原。
[0009] 本發(fā)明的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑的制備方法，包括以下步驟： (1) 將穩(wěn)定劑和重組人乙肝表面抗原混合得內水相，所述穩(wěn)定劑為海藻糖、人血清白蛋 白； (2) 將聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物溶于有機溶劑中制成油相，取上步所制內水相 加入上述油相攪拌勻化形成W/0初乳液； (3)將W/0初乳液加入外水相聚乙烯醇溶液中，攪拌勻化后形成W/0/W復乳液；再攪拌 4~6小時，離心洗滌，收集，真空冷凍干燥即可。
[0010] 本發(fā)明的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑的制備方法中，重組乙肝表面抗原 與所述穩(wěn)定性保護劑的質量比優(yōu)選為I: (1~20)，較優(yōu)選為I: (1~10)，考慮生產成 本等影響因素，更優(yōu)選為1 : 5。
[0011] 本發(fā)明的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑的制備方法中，第（2)步中攪拌轉 速為8500~20000轉/分；以15000轉/分為佳；攪拌時間為30~300秒；第（3)步中攪 拌勻化的轉速為8500~15000轉/分；以12000轉/分為佳；攪拌時間為10~20分鐘。
[0012] 本發(fā)明選用的聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物分子量為4.OXIO3~5. 5X10 4,其 中聚乳酸與聚羥基乙酸（PLA=PLG)的質量比為（50:50)~（85:15)。
[0013] 本發(fā)明所說的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑的制備方法中，所使用的有機 溶劑為二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液，其中當有機溶劑為二氯甲烷和丙酮的混合液 時，二氯甲烷與丙酮的體積比為75:25。
[0014] 本發(fā)明的制備方法中，所述的油相中聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物的濃度為 75~250mg/ml。所述的外水相分散介質聚乙稀醇的濃度為0.5%~5%，可加入濃度為 0~10%的無機鹽，以增加抗原的包封率。本發(fā)明中內水相、外水相的pH值應位于5. 0~ 7. 4之間，內水相、外水相pH值相同，優(yōu)選6. 0以利終產品的形成。
[0015] 本發(fā)明中，收積微球的離心速率為8500轉/分，時間大約為20分鐘。
[0016] 本發(fā)明選擇合適的穩(wěn)定劑保護乙肝表面抗原在微球制備過程中的穩(wěn)定性；然后使 用生物可降解高分子材料聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物（PLGA)為載體材料包封穩(wěn)定劑 和重組乙肝表面抗原，制備得到重組乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物緩釋 微球，可以有效保證在微球制備和釋放過程中乙肝表面抗原的免疫原性不被破壞。
[0017] 本發(fā)明通過添加穩(wěn)定性保護劑制得的緩釋微球，表面光滑，外觀均勻，顆粒規(guī)則無 粘連，平均粒徑在I. 〇 - 10. 〇ym;載藥量、包封率高。作為預防乙肝病毒傳播的單次注射 緩釋微球疫苗制劑，抗原穩(wěn)定性好，免疫活性高，緩釋期超過60天以上，適合于非靜脈注射 給藥，用于健康人群，提高人群HBsAb水平，又可以誘導細胞免疫，用于清除感染的細胞內 乙肝病毒。因此，本制劑不僅可以作為預防乙肝病毒傳播的，又可達到治療慢性乙肝和乙肝 病毒攜帶者的效果。另外，乳酸-羥基乙酸嵌段共聚物微球可生物降解，生物相容性好。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例8所制備的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑體外釋放的 形態(tài)變化的掃描電子顯微鏡照片。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例7和實施例8所制備的含重組乙肝表面抗原的緩釋微球制劑 的體外藥物釋放曲線。
[0020] 圖3為大鼠血清中抗HBsAgIgG抗體水平隨時間的變化。
[0021] 圖4為不同制劑誘導產生的大鼠體內IL-2和IFN-y水平。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明。
[0023] 微球的表面特征米用掃描電子顯微鏡觀察。
[0024] 包封率的測定方法：準確稱取20mgHBsAg微球于2ml離心管中，加入Iml乙腈， 14000r.mirT1離心20min，棄上清，將沉淀真空干燥2h后，用Iml磷酸鈉溶液（0.02 mol\pH7. 4)重新分散，再次離心，并保留上清液；重復上述過程，合并兩次的上清液， 用Lowry法測定HBsAg含量。計算微球的包封率和載藥量。微球的包封率=(微球中包封 的HBsAg含量/微球中包封和未包封的HBsAg總量）X100%。微球的載藥量=(微球中所 含HBsAg的重量/微球的總重量）X100%。突釋率的測定：準確稱取20mgHBsAg微球于 2ml離心管中，加入Iml磷酸鈉（0. 02mol? 1/ 1pH7. 4)緩沖液，置于37°C恒溫搖床，速率 160r?min\ 24h后離心取上清，用Lowry法試劑盒測定其HBsAg含量，計算微球的突釋率。 微球的突釋率=(20mg微球24h所釋放HBsAg的量/20mg微球中HBsAg的總量）X100%。
[0025] 微球體外釋放：分別準確稱取20mg所制備的HBsAg-HSA微球與HBsAg微球于2ml 的離心管中，向其中加入Iml磷酸鈉（0. 02mol?!/ 1pH7. 4)緩沖液，置于36. 5°C恒溫搖床， 速率120轉/分，按照預先設定好的時間間隔離心取上清，再在沉淀中加入新鮮的磷酸鈉 (0. 02mol? 1/ 1pH7. 4)緩沖液重新置于搖床中搖蕩釋放。用BCA法試劑盒測定上清液中 總蛋白含量，雙抗體夾心ELISA法測上清液中HBsAg抗原活性，體外釋放的HBsAg的穩(wěn)定性 采用體積排阻高效液相色譜法檢測。
[0026] 雙抗體夾心ELISA法測定HBsAg抗原活性：（1)包被：用0. 05MpH9. 6的碳酸鹽緩 沖