乙肝病毒核心抗原的ctl表位及其相關(guān)應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及乙肝病毒核心抗原的CTL表位及其相關(guān)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 全世界有超過(guò)4億人感染乙型肝炎病毒，每年有1百萬(wàn)人死于感染綜合癥，包括肝 硬化、肝細(xì)胞癌或者其他并發(fā)癥。現(xiàn)有技術(shù)大多采用中藥或者西藥治療乙肝，雖然有一定療 效，但是不能根治乙肝或其他并發(fā)癥，尤其不能有效阻斷因乙型肝炎病毒感染所造成的肝 臟纖維化和硬化、阻斷乙肝病毒通過(guò)胎盤傳染給胎兒、阻斷乙肝病毒通過(guò)乳汁傳染給母乳 喂養(yǎng)的新生兒。
[0003] 肽合成技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)外有一些機(jī)構(gòu)都有開展，組織相容性復(fù)合體(MHC)I類限制 性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)在控制胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起極為重要的作用。通過(guò)蛋白 質(zhì)基本性質(zhì)分析，疏水性分析，跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，抗原性位點(diǎn)預(yù) 測(cè)，可以對(duì)基因編碼蛋白的性質(zhì)作出初步判斷和預(yù)測(cè)。尤其通過(guò)疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 可以預(yù)測(cè)基因是否為膜蛋白。將該212個(gè)氨基酸與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白片段進(jìn)行Blast，結(jié) 果顯示100條肽與目標(biāo)肽有同源性，其中16條同源性100%，84條為99%，而這100條肽均為 HBV的precore/core蛋白。利用CLC Protein Workbench軟件對(duì)該212個(gè)氨基酸的分析，可以 得到該蛋白質(zhì)片段的一般生物學(xué)特性。
[0004] 細(xì)胞免疫反應(yīng)在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。當(dāng)外源性抗原被抗原呈遞細(xì)胞 捕獲后，蛋白質(zhì)抗原在內(nèi)吞系統(tǒng)被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T細(xì)胞表位與 MHC I類分子結(jié)合，被轉(zhuǎn)運(yùn)至APC表面供T細(xì)胞受體識(shí)別，從而激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫 調(diào)節(jié)作用，對(duì)其氨基酸序列特征的了解將有助于亞單位疫苗分子的設(shè)計(jì)與研制以及增加對(duì) 免疫系統(tǒng)的更進(jìn)一步理解。因此，對(duì)T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造具有重 要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能有效治療乙肝及其各種并發(fā)癥，阻斷阻斷乙肝病毒通 過(guò)胎盤傳染給胎兒、阻斷乙肝病毒通過(guò)乳汁傳染給母乳喂養(yǎng)的新生兒的，基于DC細(xì)胞的乙 肝病毒T表位肽。
[0006] 具體來(lái)說(shuō)，所述T表位肽的氨基酸序列為:QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨 酸-組氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-異亮氨酸-X);其中，氨基酸X和Z為任意氨基酸。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸X選自精氨酸(R)，谷氨酸(E)，苯丙氨酸 (F)，絲氨酸(S)，色氨酸(W)，異亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。
[0008] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸Z選自精氨酸（R)，谷氨酸(E)，亮氨酸 (L)，絲氨酸(S)，脯氨酸(P)，異亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。
[0009] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述T表位肽的氨基酸序列選自：QLFHLELIR， QLFHLEUY 或 QLFHLPUY 中的一種。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種負(fù)載所述T表位肽的樹突狀細(xì)胞，其通過(guò)以下方 法進(jìn)行制備：
[0011 ] 1)分離出外周血單核細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀收集CD14+細(xì)胞;在經(jīng)過(guò)GM-CSF和a-4 處理后采用DC培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天半量更換培養(yǎng)基，使細(xì)胞變成明顯的樹突狀；
[0012] 2)在培養(yǎng)10天后，向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1mg/L的T表位肽，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，收獲活化的樹突狀細(xì)胞即得。
[0013] 本發(fā)明對(duì)已知的乙肝病毒表位肽進(jìn)行了氨基酸替換或修飾，從而獲得了一種免疫 原性較佳的乙肝病毒T表位肽。另外，通過(guò)DC細(xì)胞體外負(fù)載該表位肽，并將成熟的DC細(xì)胞輸 注特定人群體內(nèi)，特異性的產(chǎn)生針對(duì)乙肝病毒感染所帶來(lái)的危害，尤其是針對(duì)慢性乙肝的 所產(chǎn)生的清除體內(nèi)病毒和改善臨床癥狀的作用;阻斷因乙型肝炎病毒感染所造成的肝臟纖 維化和硬化;阻斷乙肝病毒通過(guò)胎盤傳染給胎兒;阻斷乙肝病毒通過(guò)乳汁傳染給母乳喂養(yǎng) 的新生兒。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面將結(jié)進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要 求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所 附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0015] 在本發(fā)明中，所述的表位肽均可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC純化后，其 純度應(yīng)大于98% ;當(dāng)然也可以將表位肽的氨基酸序列交予專業(yè)的多肽合成公司進(jìn)行合成。
[0016] 實(shí)施例1負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞的抗病毒活性研究
[0017] 負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞的制備：無(wú)菌條件下提取小鼠股骨骨髓細(xì)胞，放入 PRMI1640培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清，0. lml青-鏈霉素）中吹打混勻，3h后取貼壁細(xì)胞加入IL-4(終濃度為500U/ml)和GM-CSF(終濃度為1000U/ml)，于37°C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天 半量更換1次培養(yǎng)液，同時(shí)加入GM-CSF和IL-4，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的生成。培養(yǎng)10天后，加入終 濃度0. lmg/L表位肽與1 X 106個(gè)/L的樹突狀細(xì)胞共孵育，37°C，24h，收集所活化的樹突狀細(xì) 胞。
[0018] 取6~8周齡雌性HBV轉(zhuǎn)基因 Babl/c小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組 10只，與小鼠尾部皮下注射免疫原，每只l〇〇yL，之后每間隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫1次， 共免疫3次。對(duì)照組以1 X 106個(gè)/L的未負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞作為免疫原，空白組以生理 鹽水作為免疫原，實(shí)驗(yàn)組以負(fù)載不同表位肽的IX 1〇6個(gè)/L樹突狀細(xì)胞作為免疫原，實(shí)驗(yàn)組 中各組負(fù)載的表位肽的具體序列如下：
[0019]
L0020J 1 )ELISP0T法檢測(cè)樹突狀細(xì)胞激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力
[0021] 末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟，，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì) 胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞;采用ELISP0T檢測(cè)試 劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書操作，具體結(jié)果如下：
[0022]
[0023]
[0024] 2)血清HBV DNA抑制率檢測(cè)
[0025]
[0026] 實(shí)施例2負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞的抗病毒臨床研究
[0027]臨床收集200例患者，HBeAg陽(yáng)性，并且給藥前6個(gè)月沒(méi)有進(jìn)行過(guò)抗病毒或免疫調(diào)節(jié) 藥物治療。經(jīng)檢測(cè)其HBV-DNA2 1000copies/mL(ALT2 40IU，ALT〈40IU)。
[0028] 制備負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞:采用白細(xì)胞分離法分離出患者外周血單核細(xì)胞， CD14+細(xì)胞選擇的純度達(dá)到94%。在經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4處理后，細(xì)胞變成明顯的樹突狀，在 培養(yǎng)第10天，大部分細(xì)胞表達(dá)輔刺激分子標(biāo)記⑶86、CD40、⑶80和HLA-DR、MHC-I分子。隨即 加入終濃度〇.lmg/L的表位肽(表位肽序列同實(shí)施例1)與1X10 6個(gè)/L的樹突狀細(xì)胞共孵育， 37°C，培養(yǎng)24h，收集所活化的樹突狀細(xì)胞。
[0029] 對(duì)上述患者靜脈注射lml含有1 X 106個(gè)/L負(fù)載表位肽的樹突狀細(xì)胞的溶液，每周1 次，治療48周，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體結(jié)果如下：
[0030] l)HBeAg陽(yáng)性患者HBV DNA定量檢測(cè)及轉(zhuǎn)陰率
[0031]
[0032]
[0033] 在治療48周后，給予負(fù)載組1表位肽序列樹突狀細(xì)胞的患者轉(zhuǎn)陰率為17.3%;而給 予負(fù)載組4表位肽序列樹突狀細(xì)胞的患者轉(zhuǎn)陰率為4.6%。
[0034] 2)治療48周后，對(duì)患者血清ALT含量進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果如下：
[0035]
[0036] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技 術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽，所述T表位肽的氨基酸序列為:QLFHLZLIX (谷 氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-異亮氨酸-X);其中，氨基酸X和Z為任 意氨基酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸X選自精氨酸(R)， 谷氨酸(E)，苯丙氨酸(F)，絲氨酸(S)，色氨酸(W)，異亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸Z選自精氨酸(R)， 谷氨酸(E)，亮氨酸(L)，絲氨酸(S)，脯氨酸(P)，異亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述T表位肽的氨基酸序列選 自：QLFHLELIR，QLFHLEUY 或 QLFHLPUY中的一種。5. -種負(fù)載權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述T表位肽的樹突狀細(xì)胞，其通過(guò)以下方法進(jìn)行制 備： 1) 分離出外周血單核細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀收集⑶14+細(xì)胞;在經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4處理 后采用DC培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天半量更換培養(yǎng)基，使細(xì)胞變成明顯的樹突狀； 2) 在培養(yǎng)10天后，向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加終濃度為O.lmg/L的T表位肽，繼續(xù)培養(yǎng)24h后， 收獲活化的樹突狀細(xì)胞即得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種能有效治療乙肝及其各種并發(fā)癥，阻斷阻斷乙肝病毒通過(guò)胎盤傳染給胎兒、阻斷乙肝病毒通過(guò)乳汁傳染給母乳喂養(yǎng)的新生兒的，基于DC細(xì)胞的乙肝病毒T表位肽。所述T表位肽的氨基酸序列為：QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-異亮氨酸-X)；其中，氨基酸X和Z為任意氨基酸。
【IPC分類】C07K14/02, C12N5/0784
【公開號(hào)】CN105622731
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610186162
【發(fā)明人】閻平希, 羅進(jìn), 閆小君
【申請(qǐng)人】江蘇安泰生物技術(shù)有限公司, 閻平希
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日