一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué) 檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯噻氰（TCMTB)是一種十分經(jīng)濟(jì)、有效的綠色殺菌劑，它與美國(guó)Buckmam公司的 BUSAN30L，法國(guó)Progiven公司的BIOCIDEMT30均屬同一類產(chǎn)品，它能有效地應(yīng)用于種子處 理，對(duì)存在的主要細(xì)菌、真菌和藻類都有極強(qiáng)的滅殺和控制作用，對(duì)于種子拌種、浸種和噴 霧治療炭疽、稻瘟、猝倒、立枯和柑橘潰瘍等病害有特效，因此，苯噻氰及其代謝產(chǎn)物在植物 與土壤都有較大的殘留。
[0003] 目前檢測(cè)苯噻氰的方法主要有氣相色譜法（GC)，液相色譜法（HPLC)，分光光度 法、電化學(xué)測(cè)定法、氣質(zhì)聯(lián)用法等方法。但是這些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較貴等缺 點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，因此建立一種快速簡(jiǎn)便的苯噻氰檢測(cè)方法具有重要意 義。酶聯(lián)免疫法（ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要 求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高特異性和高靈敏度的 單克隆單體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的抗 體對(duì)苯噻氰具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立苯噻氰的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為1B2,已保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10862。
[0006] 所述苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1B2的制備，步驟為： 1) 完全抗原的合成： A液的制備：稱取28. 6mgTCMTB類似物2-苯并噻唑硫代乙酸BTAC，EDC(碳二亞胺） 38. 3mg，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）23.Omg，用ImL無(wú)水DMF溶解，稱為A液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 8h； B液的制備：稱取BSA(牛血清蛋白）112mg溶于20mLpH7. 4的0? 01mol/LPBS中，得 至IjB液； 在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，得到偶聯(lián)物BTAC-BSA混合液即 為苯噻氰完全抗原，通過(guò)透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃 描方法鑒定； 2) 小鼠的免疫： 苯噻氰完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑；首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加 強(qiáng)免3次，加強(qiáng)免之間間隔21天；最后用苯噻氰完全抗原，不含佐劑，沖擊免疫；通過(guò)間接 ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制； 3) 細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立： 通過(guò)聚乙二醇PEG4000法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基培 養(yǎng)，利用間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑 制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交 瘤細(xì)胞株1B2; 4) 雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過(guò)ELISA法測(cè)定靈敏度和特異性。
[0007] 通過(guò)苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1B2分泌產(chǎn)生苯噻氰單克隆抗體。
[0008] 將苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1B2通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于 食品接觸相關(guān)材料中苯噻氰的快速檢測(cè)，具體步驟如下： (1) 包被：將包被原TCMTB-0VA用0. 05MpH9. 6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開(kāi)始倍比稀 釋，100ML/孔，37°C反應(yīng) 2h; (2) 洗滌：將酶標(biāo)板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min; (3) 封閉：拍干后，加入200ML/孔封閉液，37°C反應(yīng)2h;洗滌后烘干備用； (4) 加樣：將抗血清從1:1000開(kāi)始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100ML/ 孔，37°C反應(yīng)Ih;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100ML/孔，37°C反應(yīng) Ih； (5) 顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100ML的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng) 15min； (6) 終止和測(cè)定：每孔加入50ML2MH2SO4終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔 的OD45。值； (7) 結(jié)果判讀：以O(shè)D45。值大于或等于陰性對(duì)照孔的2. 1倍，即P/N彡2. 1，所對(duì)應(yīng)的血 清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)； (8) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置0，1，2, 5,10, 20, 50,IOOyg/L苯噻氰標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其IC5。為7yg/L。
[0009] 溶液的配置如下： 碳酸鹽緩沖液CBS:稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2. 93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加 雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9. 6,加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆茫?磷酸鹽緩沖液PBS:8. 00gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2PO4, 2.9gNa2HPO4* 12H2O,溶 于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7. 2~7. 4,定容至1000 mL; PBST:含 0? 05% 吐溫-20 的PBS; TMB顯色液：A液：Na2HPO4 ? 12H20 18. 43g，檸檬酸 9. 33g，純水定容至 1000mL;B液： 60mgTMB溶于IOOmL乙二醇中；A、B液按1 : 5體積比混合即為T(mén)MB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的抗苯噻氰單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)苯噻氰有較好 的檢測(cè)靈敏度和特異性（IC5。值為7yg/L)。
[0011]生物材料樣品保藏：一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1B2,已保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10862,保藏日期2015年5月19 曰。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是1B2單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014] 本發(fā)明通過(guò)將苯噻氰完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)， 通過(guò)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)苯噻氰有較好特異性和靈 敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0015] 實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株1B2的制備 (1) 完全抗原的合成 稱取28. 6mgTCMTB類似物2-苯并噻唑硫代乙酸（BTAC)，EDC(碳二亞胺）38. 3mg，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)23.Omg，用ImL無(wú)水DMF溶解(稱為A液)，室溫