專利名稱：在蛋白質(zhì)純化過程中降低樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法
在蛋白質(zhì)純化過程中降低樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法
相關(guān)申請
本申請要求申請日為2011年8月19日的美國臨時專利申請61/575，349和申請日為2012年6月29日的美國臨時專利申請61/666，240的優(yōu)先權(quán)，其各自整體援引加入本文。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及改進的色譜方法和在蛋白質(zhì)純化過程中降低一種或多種雜質(zhì)水平的方法。
背景
色譜法在生物材料如單克隆抗體的純化中是主要的純化技術(shù)。
通常使用的色譜方法包括親和色譜介質(zhì)、離子交換色譜介質(zhì)、疏水作用、親水相互作用、尺寸排阻和混合模式(如不同色譜相互作用的組合)色譜法中的一種或多種。例如， 為了純化單克隆抗體，典型的純化方法包括最初的蛋白A親和俘獲(capture)步驟和隨后的一個或多個離子交換精制步驟，其目的是降低一種或多種雜質(zhì)如宿主細胞蛋白(HCP)的水平。此外，還可以使用其它色譜技術(shù)，如結(jié)合和洗脫(bind and elute)疏水作用色譜法 (HIC);流通(flow-through)疏水作用色譜法(FTHIC);流通陰離子交換色譜法(AEX);使用陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂或疏水作用樹脂的弱分配色譜法；混合模式色譜技術(shù)如結(jié)合和洗脫弱陽離子和陰離子交換、結(jié)合和洗脫疏水和離子交換相互作用以及流通疏水和離子交換混合模式相互作用(FTMM)，其均可使用諸如Capto Adhere, Capto MMC、HEA Hypercer'PPAHypercel 的樹脂。另外，疏水性電荷誘導(dǎo)(HCI)色譜法與其它一起以及不同技術(shù)的組合可用于精制。
雖然色譜法在較小規(guī)模的蛋白質(zhì)純化提供了許多優(yōu)勢，但在大規(guī)模下，色譜柱的填充不僅花費高強度的勞動和時間而且還昂貴。另外，色譜柱中的污垢是普遍問題，導(dǎo)致使用者必須處理掉柱，這是不希望的，特別是由于色譜樹脂的高成本。
最近，工業(yè)上有明顯的趨勢去嘗試和減少蛋白質(zhì)純化方法中的步驟數(shù)。同樣，使用生物反應(yīng)器獲得更高表達滴度的技術(shù)的應(yīng)用在工業(yè)中有上升的趨勢。這兩種趨勢的結(jié)合導(dǎo)致更多產(chǎn)物被裝載到柱上，由此導(dǎo)致相當(dāng)貴的色譜介質(zhì)上增加的負荷和較低的產(chǎn)物純度， 這兩點都是不希望的。
發(fā)明概述
本發(fā)明至少部分地基于以下令人驚訝的和出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)某些材料(如含碳材料例如活性碳(activated carbon))可以流通模式摻入到色譜柱基蛋白質(zhì)純化方法中，導(dǎo)致色譜柱負荷的減少，以及隨之而來的色譜柱壽命的增加。
進一步地，本發(fā)明基于以下令人驚訝的和出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)含碳物質(zhì)(如活性碳) 可以用于俘獲色譜步驟的上游或下游以降低一種或多種雜質(zhì)的水平。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，使樣品在陽離子交換(CEX)色譜步驟前與含碳材料接觸。在其它實施方案中，在樣品與含碳材料接觸前使用陽離子交換(CEX)色譜步驟。在另外的實施方案中，使樣品在蛋白A親和俘獲步驟后與含碳材料接觸?；蛘撸梢栽谒鰳悠放c含碳材料接觸后使用蛋白A親和色譜步驟。在某些實施方案中，可在蛋白A親和俘獲步驟后進行陰離子交換 (AEX)流通色譜步驟，并且進行或不進行CEX色譜結(jié)合/洗脫步驟。在其它實施方案中，可以在非親和俘獲步驟(如使用CEX結(jié)合和洗脫色譜法作為俘獲步驟)后使用含碳材料，并且隨后進行AEX色譜步驟。
進一步地，本發(fā)明提供色譜基蛋白質(zhì)純化方法，其包括比通常的方法更少的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供減少一個或多個色譜柱上的負荷的方法。在一些實施方案中，這樣的方法包括在包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品與一個或多個含有親和介質(zhì)、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)或混合模式介質(zhì)的色譜柱接觸之前使所述樣品以流通模式與以下之一接觸，從而減少所述一個或多個色譜柱上的所述負荷(i)含碳材料；( )含碳材料和CEX介質(zhì)的組合；(iii)含碳材料和AEX介質(zhì)的組合；(iv)含碳材料和混合模式介質(zhì)的組合；(V)含碳材料和HIC介質(zhì)的組合，以及(vi)含碳材料和CEX、AEX和混合模式介質(zhì)的組合。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一方面，提供降低含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)在使所關(guān)注的蛋白質(zhì)與一個或多個含有親和介質(zhì)、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)或混合模式介質(zhì)的色譜柱結(jié)合的條件下，使含有所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品與所述柱接觸；(ii)得到所述樣品的第一洗出液；(iii)使所述第一洗出液以流通模式與以下之一接觸(a)含碳材料；和(b)含碳材料與CEX介質(zhì)、AEX介質(zhì)、混合模式介質(zhì)和HIC介質(zhì)中的一種或多種的組合；以及(iv)得到所述樣品的第二洗出液；其中相對于所述第一洗出液中的所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第二洗出液含有較低或降低水平的所述一種或多種雜質(zhì)。
在另一方面，提供降低包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品中的所述一種或多種雜質(zhì)水平的方法，其中所述方法包括以下步驟(i)使所述包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品與含有親和介質(zhì)的色譜柱接觸；(ii)得到所述樣品的第一洗出液；(iii)使所述第一洗出液以流通模式與含碳材料接觸；(iv)得到所述樣品的第二洗出液；(V)使所述第二洗出液與陰離子交換色譜介質(zhì)接觸；以及(vi)得到所述樣品的第三洗出液，其中相對于所述第一洗出液未與所述含碳材料接觸時的所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第三洗出液含有較低或降低水平的所述一種或多種雜質(zhì)。
在一些實施方案中，這樣的方法包括在親和俘獲步驟之后和使樣品與陰離子交換色譜介質(zhì)(在一些實施方案中是膜吸附劑)接觸之前的CEX結(jié)合和洗脫色譜步驟。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法避免了進一步色譜步驟(如在親和俘獲步驟后使用的結(jié)合和洗脫CEX色譜步驟)的需要。示例性的可商購獲得的陰離子交換色譜介質(zhì)是膜吸附齊[J 如 ChromaSorb (MILLIPORE CORPORATION, Billerica, MA, USA)、Mustang Q(PALL CORPORATION, Port Washington, NY, USA)、Sartobind Q(SARTORIUS STEDIM, Germany)以及珠介質(zhì)(bead medium)如 Q Sepharose FF(GE HEALTHCARE, Philadelphia, PA，USA)。
在一些實施方案中,本發(fā)明的方法使用非柱基(non-column based)色譜步驟。
在另一個方面，提供降低包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法，所述方法包括以下步驟(i)得到含有所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的蛋白相；(ii)使用合適的緩沖液來復(fù)水所述含有所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的蛋白相，從而得到復(fù)水的蛋白質(zhì)溶液； (iii)使所述復(fù)水的蛋白質(zhì)溶液以流通模式與含碳材料接觸；(iv)得到包含所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的第一洗出液；(V)使所述第一洗出液與陰離子交換色譜介質(zhì)接觸；以及(vi)得到包含所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的第二洗出液，其中相對于當(dāng)步驟(iii)中復(fù)水的蛋白質(zhì)溶液不與所述含碳材料接觸時所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第二洗出液含有較低的或降低的水平的所述一種或多種雜質(zhì)。
在一些實施方案中，這樣的方法避免了任何結(jié)合和洗脫色譜步驟(如結(jié)合和洗脫親和色譜或CEX色譜步驟)的需要。
在一些本發(fā)明的方法中，使用一種或多種選自沉淀、絮凝、結(jié)晶、柱色譜法、使用可溶性小分子、使用聚合物配體、或使用懸浮色譜介質(zhì)的方法得到蛋白相。
在一些實施方案中，將含碳材料和AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)和混合介質(zhì)中的一種或多種組合需要混合所述含碳材料和一種或多種這樣的介質(zhì)。在另一些實施方案中，將含碳材料和AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)和混合介質(zhì)中的一種或多種組合需要在組合中按序使用不同的材料。
在依照本發(fā)明方法的各種實施方案中，所述親和介質(zhì)選自蛋白A或蛋白G。
在一些實施方案中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)是抗體或含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在另一些實施方案中，所述抗體是多克隆抗體。
在一些實施方案中，所述樣品包含細胞培養(yǎng)料(cell culture feed)。
在一些實施方案中，所述樣品是澄清的細胞培養(yǎng)料。
在一些實施方案中，所述澄清的細胞培養(yǎng)料是通過深層過濾(depth filtration) 和/或離心得到的。
在一些實施方案中，所述澄清的細胞培養(yǎng)料是通過用鹽、酸、聚合物或刺激反應(yīng) (stimulus responsive)聚合物沉淀得到的。
在各種實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的含碳材料是活性碳。在一些實施方案中，活性碳包括活性炭(activated charcoal)。
在一些實施方案中，含碳材料和CEX介質(zhì)、AEX介質(zhì)、混合模式介質(zhì)和HIC介質(zhì)中的一種或多種的組合包括活性碳和CEX樹脂、AEX樹脂、混合模式樹脂和HIC樹脂中的一種或多種的混合物。在一些實施方案中，將這樣的混合物填充入色譜柱中。在另一些實施方案中，將這樣的混合物填充入盤中。在另一些實施方案中，將這樣的混合物填充入倉(pod)、 筒(cartridge)或囊(capsule)中。
在一些實施方案中，將活性碳填充入色譜柱中。在另一些實施方案中，將活性碳填充入密封的一次性裝置如MiUistalk+ Pod中。在另一些實施方案中，將活性碳填充入筒或囊中。
在一些實施方案中，將活性碳浸入(impregnate)多孔材料中，如將活性碳摻入到多孔纖維介質(zhì)中。所述多孔材料可以容納在柱、盤、MiUistalk+ Pod、筒或囊中。在一些實施方案中，將活性碳填充入纖維素介質(zhì)中。
在一具體實施方案中，所述AEX介質(zhì)是具有涂層表面的膜，所述表面涂層包含一種或多種聚合伯胺或其共聚物。
在一些實施方案中，在包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品經(jīng)親和俘獲步驟之前使所述樣品與活性碳接觸。在另一些實施方案中，在親和俘獲步驟之后使樣品與活性碳接觸。
在本發(fā)明的不同方法中，使用應(yīng)用活性碳的方法所造成的所關(guān)注的蛋白質(zhì)的收率的損失為少于總蛋白量的20%。換句話說，本發(fā)明的方法導(dǎo)致80%或更高的所關(guān)注的蛋白質(zhì)的收率(總蛋白量為100% )。在又一實施方案中，使用應(yīng)用活性炭的方法所造成的所關(guān)注的蛋白質(zhì)的收率的損失為少于10%。換句話說，本發(fā)明的方法導(dǎo)致90%或更高的所關(guān)注的蛋白質(zhì)的收率(以總蛋白量為100% )。
在一具體實施方案中，活性碳用作從樣品(如洗出液，例如從流通純化步驟前進行的結(jié)合和洗脫色譜俘獲工藝步驟中回收的蛋白A洗出液)中純化靶分子(如含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)或抗體)的方法中的流通純化工藝步驟或單元操作的一部分。如在

圖19中所示，在這樣的流通純化工藝步驟或單元操作中，來自結(jié)合和洗脫色譜步驟(如蛋白A親和柱)的洗出液先后流經(jīng)活性碳、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)和病毒過濾器。在一些實施方案中，在AEX步驟和CEX步驟之間進行溶液改變(如pH改變)，其中所述溶液使用在線靜態(tài)混合器(in-line static mixer)和/或緩沖罐(surge tank)。在一些實施方案中，如本文描述的使用活性碳的流通純化工藝步驟或單元操作是純化靶分子的連續(xù)過程的一部分，其中所述流通純化步驟與所述流通純化工藝步驟的上游工藝步驟(如結(jié)合和洗脫色譜俘獲步驟)和下游工藝步驟(如配制(formulation)步驟)相流通，因此使液體樣品能夠連續(xù)流經(jīng)該過程。
在一具體實施方案中，完整的流通純化工藝步驟或單元操作采用單個制動器 (skid)(即控制或監(jiān)控裝置)。
附圖簡述
圖I描述了表明對于所評價的多種可商購獲得的吸附介質(zhì)中的每一種，在添加有多克隆IgG的零位(null)CHO-S料的流通洗出液中測量IgG收率的實驗結(jié)果的柱狀圖，所述吸附介質(zhì)即活性碳(AC);瓊脂糖陽離子交換樹脂SP Sepharose Fastflow(SPFF);聚合物陽離子交換樹脂ProResTM-S ;瓊脂糖陰離子交換樹脂QS印haroSe (QFF);和瓊脂糖HIC 樹脂Phenyl Sepharose 6Fastflow(ph FF)。如圖I所示，除了顯示高達約5%的IgG收率損失的HIC樹脂外，證明所有其它篩查的介質(zhì)沒有可檢測到的收率損失。
圖2描述了表明對于所評價的多種可商購獲得的吸附介質(zhì)中的每一種以及未處理的澄清料，在添加有多克隆IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中測量UV 280nm活性物質(zhì)的量的實驗結(jié)果的柱狀圖，所述吸附介質(zhì)即活性碳、Nuchar RGC、(AC)、SPFF、 ProReSTM-S、QFF和ph FF。如圖2所示，與其它吸附介質(zhì)相比，活性碳顯著降低了有色物質(zhì)的量。
圖3描述了表明對于以上所列的多種可商購獲得的吸附介質(zhì)中的每一種以及未處理的澄清料，在添加有多克隆IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中測量宿主細胞蛋白 (HCP)濃度的實驗結(jié)果的柱狀圖。用Cygnus CHO-CM HCP ELISA試劑盒測量HCP濃度(ng/ mL)。如圖3所證明，所有篩查的介質(zhì)(包括活性碳)在一定程度上除去HCP。然而，陽離子樹脂SPFF和ProRes -S除去HSP效率最高。
圖4描述了表明對于以上所列的每種介質(zhì)以及未處理的澄清料，在添加有多克隆 IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中測量DNA濃度的實驗結(jié)果的柱狀圖。使用PicoGreen 測定測量DNA濃度(yg/mL)。如圖4所證明，每種介質(zhì)在一定程度上除去DNA。然而，陰離子交換介質(zhì)除去HSP效率最高，其次是活性碳。
圖5描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的以上所列的所評價的每種介質(zhì) (以每10CV，至多100CV的載料量)，在添加有多克隆IgG和鯡魚精DNA的零位CHO-S料的流通洗出液中測量IgG濃度的實驗結(jié)果的x-y散布圖。在X軸顯示柱體積(CV)，并且在y 軸顯示IgG濃度(mg/mL)。所有所評價的介質(zhì)(包括AC、SPFF, ProRes -S和QFF)在裝載多達100CV的未處理的澄清料時顯示沒有顯著的IgG損失。
圖6描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的所評價的每種介質(zhì)(以每10CV， 至多100CV的載料量)，在添加有多克隆IgG和鯡魚精DNA的零位CHO-S料的流通洗出液中測量UV活性物質(zhì)峰面積(與對應(yīng)于UV活性物質(zhì)的量)的實驗結(jié)果的x-y散布圖。在X軸顯示柱體積(CV)，并且在y軸顯示蛋白A分析柱流通中的UV活性物質(zhì)峰面積。在所有所評價的材料中，AC除去多于70%的整個100CV的UV活性物質(zhì)；QFF除去約10%的整個100CV 的UV活性物質(zhì)；并且兩種陽離子交換樹脂SPFF和ProRes -S除去最少量的UV活性物質(zhì)。
圖7描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的以上所列的所評價的每種介質(zhì) (以每10CV，至多100CV的載料量)，在添加有多克隆IgG和鯡魚精DNA的零位CHO-S料的流通洗出液中測量宿主細胞蛋白(HCP)濃度的實驗結(jié)果的x-y散布圖。在X軸顯示柱體積(CV)，并且在y軸顯示HCP濃度(ng/mL)。SPFF和ProRes -S除去整個100CV中最多的 HCP。QFF除去一些HCP但很快通過。對于這種具有高濃度DNA的特定培養(yǎng)物，活性碳除去最少量的HCP。
圖8描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的所評價且以上所列的每種介質(zhì) (以每10CV，至多100CV的載料量)，在添加有多克隆IgG和鯡魚精DNA的零位CHO-S料的流通洗出液中測量DNA濃度的實驗結(jié)果的x-y散布圖。在X軸顯示柱體積(CV)，并且在y 軸顯示DNA濃度(μ g/mL)。但每種被評價的介質(zhì)(包括AC、SPFF、ProRes -S和QFF)在不同程度上除去整個100CV中的DNA。
圖9是可用于去除雜質(zhì)的操作的不同示例型模式的示意圖。左側(cè)的程序框圖描述了將未處理的澄清料先后裝載到含有AC的柱以及含有SPFF、Pix)ResTM-S或QFF介質(zhì)的柱中的代表性試驗。中間的程序框圖描述了將未處理的澄清料先后裝載到含有AC的柱以及含有SPFF或ProRes -S然后QFF的柱中的代表性試驗。右間的程序框圖描述了將未處理的澄清料裝載到含有I I (v/v) AC和SPFF混合物、或I I (v/v) AC和Pr0ResTM-S混合物、 或I : I : l(v/v/v)AC和ProRes -S和QFF混合物的柱中的代表性試驗。
圖10描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的圖9所示的每種材料組合，在添加有多克隆IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中的UV活性物質(zhì)峰面積(對應(yīng)于UV活性物質(zhì)的量)的柱狀圖?；钚蕴己秃谢钚蕴嫉幕旌衔镲@著減少了 UV活性物質(zhì)。在活性碳和陰離子交換樹脂都在一個方法中使用的情況下，無論是按序使用還是作為混合物使用，都除去更多的UV活性物質(zhì)，這證明了不同材料間的協(xié)同效應(yīng)。
圖11描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的圖9所示的每種材料組合，在添加有多克隆IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中宿主細胞蛋白(HCP)濃度的柱狀圖。所有的材料在一定程度上除去HCP ;然而，當(dāng)活性碳與諸如SPFF或Pr0ResTM-S的陽離子樹脂或與諸如QFF的陰離子樹脂在方法中一起使用時，無論是與樹脂按序使用或與樹脂作為混合物使用，除去HCP效率都是最高，這證明了不同材料間的協(xié)同效應(yīng)。
圖12描述了表明對于包括未處理的澄清料在內(nèi)的圖9所示的每種材料組合，在添加有多克隆IgG的零位CHO-S料的流通洗出液中DNA濃度的柱狀圖。所有的材料在一定程度上除去HCP ;然而，當(dāng)活性碳與QFF按序使用或與QFF作為混合物使用時，與其它所評價的材料和組合相比，DNA去除更加有效。
圖13描述了表明對于每種所評價的材料(即AC、SPFF、QFF、phFF)以及兩種材料組合(I I l(v/v/v)AC/SPFF/QFF 混合物和 I I I (v/v/v) PhFF/SPFF/QFF 混合物)， 在蛋白A柱洗脫合并液(elution pool)的流通洗出液中測量IgG收率的試驗結(jié)果的柱狀圖。所評價的不同材料的流通洗出液的料是使用Prosep Ultra Plus蛋白A樹脂從添加有多克隆IgG的零位CHO-S料產(chǎn)生的蛋白A柱洗脫合并液。所有篩查的材料顯示高于80%的收率。
圖14描述了表明對于每種所評價的材料(即AC、SPFF, QFF、phFF)以及兩種材料組合(I I l(v/v/v)AC/SPFF/QFF 混合物和 I I I (v/v/v) PhFF/SPFF/QFF 混合物)，在蛋白A柱洗脫合并液的流通洗出液中測量宿主細胞蛋白(HCP)濃度的試驗結(jié)果的柱狀圖。不同評價材料的流通洗出液的供應(yīng)是使用Prosep Ultra Plus蛋白A樹脂從添加有多克隆IgG的零位CHO-S料產(chǎn)生的蛋白A柱洗脫合并液。所有材料或材料組合從蛋白A洗脫合并液除去一定量的HCP ;然而，在單獨使用時，活性碳和陽離子交換樹脂更為有效。在作為混合物使用時，AC/SPFF/QFF和PhFF/SPFF/QFF比任何單獨成分除去更多的HCP。在單獨使用時，QFF和PhFF除去最少量的HCP。
圖15描述了表明對于每種所評價的材料(即AC、SPFF、QFF、phFF)以及兩種材料組合(I I 1AC/SPFF/QFF混合物和I : I : lPhFF/SPFF/QFF混合物)，在蛋白A柱洗脫合并液的流通洗出液中測量DNA濃度的試驗結(jié)果的柱狀圖。不同評價材料的流通洗出液的供應(yīng)是使用Prosep Ultra Plus蛋白A樹脂從添加有多克隆IgG的零位CHO-S料產(chǎn)生的蛋白A柱洗脫合并液。所有材料或材料組合從蛋白A洗脫合并液中除去一定量的DNA，其中樹脂混合物AC/SPFF/QFF和PhFF/SPFF/QFF表現(xiàn)出比任意單獨成分微小的優(yōu)勢。
圖16是表明對于單克隆抗體溶液(其中所述溶液是使用蛋白A色譜法從澄清細胞培養(yǎng)物俘獲到的(被稱為蛋白A洗出液)，并且隨后進行三個單獨的流通純化組列 (train))的各流分，測量相對于產(chǎn)物(即單克隆抗體)的HCP濃度(ppm)的實驗結(jié)果的示意圖。第一組列使用O. 2mL的由5層組成的ChromaSorb 陰離子交換膜裝置；第二組列使用ImL HD Nuchar活性碳填充柱；并且第三組列先后使用ImL活性碳柱和O. 2mL的 ChromaSorb 陰離子交換膜。從各純化組列收集洗出液的十個IOmL流分,并且分析所選流分的宿主細胞蛋白(HCP)和IgG濃度。示意圖的X軸描述了從活性碳柱中收集IOmL(柱體積(CV))洗出液流分的終點。示意圖的Y軸描述了對于活性碳洗出液的各流分，相對于產(chǎn)物 (即單克隆抗體)的HCP濃度(ppm)。該示意圖顯示了單獨或與陰離子交換介質(zhì)組合使用活性碳來流通處理親和俘獲洗出液對于從單克隆抗體溶液中除去雜質(zhì)有預(yù)料不到的效果。
圖17是表明對于單克隆抗體溶液(其中所述溶液是使用陽離子交換(CEX)色譜法(被稱為CEX洗出液)從澄清細胞培養(yǎng)物俘獲到的，并且隨后使用ImL HDNuchar活性碳填充柱進行純化)的各流分，測量相對于產(chǎn)物(即單克隆抗體)的HCP濃度(ppm)的實驗結(jié)果的示意圖。收集七個IOmL的洗出液流分，分析其宿主細胞蛋白(HCP)和IgG濃度。示意圖的X軸描述了從活性碳柱中收集IOmL(洗脫體積(mL))洗出液流分的終點。示意圖的Y軸描述了各流分相對于產(chǎn)物(即單克隆抗體)的HCP濃度(ppm)。該示意圖證明活性碳可用于從多種不同的蛋白質(zhì)溶液中除去雜質(zhì)。
圖18是表明對于單克隆抗體溶液(其中所述溶液是使用配備有蛋白A柱的三柱連續(xù)多色譜色譜(CMC)系統(tǒng)從澄清細胞培養(yǎng)物獲得的，并且隨后先后使用填充到柱中的HD Nuchar活性碳和陰離子交換色譜裝置(如ChromaSorb )純化)的各流分，測量相對于產(chǎn)物(即單克隆抗體，MAb II)的HCP濃度(ppm)的實驗結(jié)果的示意圖。示意圖的X軸描述了流分收集的終點，以陰離子交換裝置的每單位柱體積裝載的抗體重量(kg/L)測量。示意圖的Y軸描述了各流分相對于產(chǎn)物(即單克隆抗體)的HCP濃度(ppm)。該示意圖證明盡管單獨使用時活性碳和ChromaSorb 都除去極大量的HCP，但當(dāng)組合使用時，它們增加了起始溶液的純度(從I, 370ppm HCP到低于IOppm)。
圖19表明了如本文所述的連接的流通純化工藝步驟的示意圖。含有活性碳的裝置與陰離子交換裝置直接連接。來自陰離子交換裝置的流出物經(jīng)過靜態(tài)混合器(在此處加入酸溶液以降低pH)，然后經(jīng)過陽離子交換流通裝置和病毒過濾器。
圖20是描述測量經(jīng)過陰離子交換裝置(即ChromaSorb )后的HCP的實驗結(jié)果的示意圖。Y軸表示HCP濃度(ppm)且X軸表示AEX載樣量(kg/L)。
圖21是描述在流通純化工藝步驟中測量作為病毒過濾裝置裝載功能的MAb聚集物的去除的實驗結(jié)果的示意圖。X軸表示病毒過濾載樣量(kg/m2)且Y軸表示病毒過濾后樣品中的MAb聚集物的百分數(shù)。圖22是描述測量深層過濾、活性碳和病毒過濾后的壓力分布的實驗結(jié)果的示意圖。Y軸表示壓力(psi)且X軸表示時間(小時)。
詳述
本發(fā)明提供用于從含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品中純化所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的新的和改進的方法。
活性碳已被用于水純化過程。另外，活性碳已被用于從血清白蛋白中除去小分子雜質(zhì)如脂肪酸和膽紅素(參見例如Chen等人，J. Biol. Chem. , 242 =173-181 (1967)； Nakano 等人，Anal Biochem. , 129 :64-71(1983) ；Nikolaev 等人，Int. J. Art. Org. ,14 179-185(1991))?；钚蕴家惨驯挥糜谠谥参锊《炯兓^程中除去色素以及宿主蛋白、蛋白酶和核糖核酸酶(參見例如 Price, Am. J. Botany, 33 :45-54(1946) ；Corbett, Virology, 15 8-15 (1961) ；McLeana 等人，Virology, 31 :585-591 (1967))。
因此，通?；钚蕴急粓蟮罏榕c溶液中的分子(如水樣品中的雜質(zhì))非特異性結(jié)合。
本發(fā)明至少部分地基于以下出乎預(yù)料的和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)活性碳可選擇性地除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)和DNA群體，從而用于通過細胞中的重組表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的純化。
如本文的實施例所證明，活性碳可用于在蛋白質(zhì)純化過程中選擇性除去宿主細胞蛋白(HCP)和DNA雜質(zhì)而不顯著影響靶蛋白的收率。進一步地，如本文所述的實施例所證明，當(dāng)活性碳以流通模式用于蛋白質(zhì)純化過程時(無論是單獨使用或與一種或多種不同類型的色譜介質(zhì)混合使用)，其導(dǎo)致含有蛋白質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)的水平顯著降低以及減少下游色譜柱的負擔(dān)。進一步地，在某些實例中，活性碳減少了純化過程中可能使用的步驟數(shù)，從而降低了全部操作成本并節(jié)省了時間。進一步地，如本文所述的實施例所證明，活性碳可以在俘獲步驟前或后使用，從而降低含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)的水平。
在本文描述的一些實施方案中，活性碳用于純化靶分子的整個方法的流通純化步驟中，其中所述整個方法以及所述流通純化步驟均以連續(xù)的方式進行。
為了使本發(fā)明的內(nèi)容更加容易理解，首先對某些術(shù)語進行定義。闡述的附加定義貫穿詳述部分。
I.定義
本文使用的術(shù)語“含碳材料”是指任何由碳組成的或含有碳的物質(zhì)。在一些實施方案中，所要求保護發(fā)明的方法中使用的含碳材料是活性碳或活化碳。在一些實施方案中， 活性碳包括活性炭。在一些實施方案中，將活性碳摻入纖維素介質(zhì)中。
在本文中互換使用的術(shù)語“活性碳”或“活化碳”是指已經(jīng)過增強其孔結(jié)構(gòu)的過程的含碳材料。活性碳是具有非常高的表面積的多孔固體。它們可以來自多種來源包括煤、 木材、椰子殼、堅果殼和泥炭?？梢允褂冒ㄔ谑芸貧夥障录訜岬奈锢砘罨蚴褂脧娝?、堿或氧化劑的化學(xué)活化，從這些材料制備活性碳?；罨^程產(chǎn)生具有高表面積的多孔結(jié)構(gòu)，所述高表面積使活性碳具有高度雜質(zhì)去除的能力。可改變活化方法以控制表面的酸度。
典型的活化方法包括使碳源經(jīng)歷熱過程(如使用氧化氣體)或化學(xué)過程(如使用磷酸或金屬鹽如氯化鋅)，所述碳源例如樹脂廢料、煤、煤焦炭、石油焦炭、褐煤、聚合材料以及木質(zhì)纖維素材料包括紙漿和紙、來自紙漿生產(chǎn)的殘渣、木材(如木屑、鋸屑和木粉)、堅果殼(如杏仁殼和椰子殼)、谷粒(kernel)和水果核(如橄欖核和櫻桃核)。用磷酸(H3PO4) 化學(xué)活化木材基碳的實例公開于美國專利Re. 31，093中，其導(dǎo)致碳的脫色和氣體吸附能力的改進。同樣，美國專利5，162，286教導(dǎo)了木材基材料的磷酸活化，所述木材基材料密度特別大并且含有相對高(30%)的木素含量，如堅果殼、水果核和谷粒。在美國專利5，204,310 中還討論了作為制備高活性和高密度碳的步驟的木質(zhì)纖維素材料的磷酸活化。本段中所列的這些專利中各自的教導(dǎo)整體援引加入本文。
相對于大多其它吸附材料，活性碳被認為使用相對弱的范德華力或倫敦色散力與分子相互作用。典型的商業(yè)活性碳產(chǎn)品表現(xiàn)出至少300m2/g的表面積(通過本領(lǐng)域公知的基于氮吸附的 Brunauer-Emmett-Teller ( “BET”)方法測定)。
雖然活性碳或活化碳之前已用于純化液體或氣體的方法，但它之前還未用于從一種或多種蛋白質(zhì)雜質(zhì)中純化重組表達蛋白的方法。
術(shù)語“免疫球蛋白”、“Ig”或“IgG”或“抗體”(在本文中互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的基本四-多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，所述鏈通過例如具有特異性結(jié)合抗原能力的鏈間二硫鍵而被穩(wěn)定化。術(shù)語“單鏈免疫球蛋白”或“單鏈抗體”(在本文中互換使用)是指具有由重鏈和輕鏈組成的二-多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，所述鏈通過例如具有特異性結(jié)合抗原能力的鏈間肽連接基而被穩(wěn)定化。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域(domain)”是指通過例如 β-折疊片和/或鏈間二硫鍵而被穩(wěn)定化的包含肽環(huán)(P印tide loop)(如包含3-4個肽環(huán)) 的重鏈或輕鏈多肽的球狀區(qū)域。本文中的結(jié)構(gòu)域進一步被稱為“恒定的”或“可變的”，基于在“恒定的”結(jié)構(gòu)域的情況下的不同類成員結(jié)構(gòu)域中相對缺少組列變化，或在“可變的”結(jié)構(gòu)域的情況下的不同類成員結(jié)構(gòu)域中顯著的變化。在本領(lǐng)域中抗體或多肽“結(jié)構(gòu)域”通常被互換稱為抗體或多肽“區(qū)”。抗體輕鏈的“恒定的”結(jié)構(gòu)域被互換稱為“輕鏈恒定區(qū)”、“輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CL”區(qū)或“CL”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“恒定的”結(jié)構(gòu)域被互換稱為“重鏈恒定區(qū)”、“重鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CH”區(qū)或“CH”結(jié)構(gòu)域。抗體輕鏈的“可變的”結(jié)構(gòu)域被互換稱為“輕鏈可變區(qū)”、“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VL”區(qū)或“VL”結(jié)構(gòu)域。抗體重鏈的“可變的”結(jié)構(gòu)域被互換稱為“重鏈可變區(qū)”、“重鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VH”區(qū)或“VH”結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白或抗體可以是單克隆的或多克隆的，并且可以單體形式或聚合物形式存在，例如以五聚體形式存在的IgM抗體和/或以單體、二聚體或多聚體形式存在的IgA抗體。免疫球蛋白或抗體也可以包括多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段(只要它們保留或被修飾成包含配體特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。術(shù)語抗體的“片段”或“功能片段”是指抗體的部分或局部或包含比完整的或全部的抗體或抗體鏈少的氨基酸殘基的抗體鏈?？梢酝ㄟ^化學(xué)處理或酶處理完整的或全部的抗體或抗體鏈得到片段。也可以通過重組方法得到片段。當(dāng)重組生產(chǎn)時，可以單獨或作為被稱作融合蛋白的較大蛋白質(zhì)的一部分表達片段。示例性的片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fe和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fe融合蛋白。
在一具體實施方案中，本發(fā)明的方法用于純化抗體片段，所述抗體片段是含有Fe 區(qū)的片段。
術(shù)語“Fe區(qū)”和“含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)”意指所述蛋白含有免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(之前定義的CH和CL區(qū))。含有“Fe區(qū)”的蛋白質(zhì)可具有免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)物功能?！癋e區(qū)”如CH2/CH3區(qū)可與親和配體如蛋白A或其功能性變體選擇性結(jié)合。在一些實施方案中，含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)與蛋白A或其功能性衍生物、變體或片段特異性結(jié)合。在另一些實施方案中，含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)與蛋白G或蛋白L或它們的功能性衍生物、變體或片段特異性結(jié)合。
如以上討論的，在一些實施方案中，靶蛋白是含有Fe區(qū)的蛋白，如免疫球蛋白。在一些實施方案中，含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)是包含與另一多肽或其片段融合的免疫球蛋白的Fe 區(qū)的重組蛋白質(zhì)。
通常，免疫球蛋白或抗體針對所關(guān)注的“抗原”。優(yōu)選地，所述抗原是生物學(xué)上重要的多肽，并且向患有疾病或病癥的哺乳動物給藥抗體可以在該哺乳動物中產(chǎn)生治療益處。
在本文中互換使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“Mab”是指得自實質(zhì)上同種抗體的種群的抗體，即除了可能以較少量存在的可能自然發(fā)生的突變，該種群中的各抗體是一樣的。 單克隆抗體是高度特異性的，針對單獨的抗原基(antigenic site)。此外，相對于通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑，每個單克隆抗體針對抗原上單個決定子。修飾語“單克隆”表明作為從實質(zhì)上同種抗體種群得到的抗體的特征，并且其不被解釋為需要通過任何特定的方法產(chǎn)生抗體。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等人,Natrue 256 :495(1975)記載的雜交瘤方法制備,或可以通過重組 DNA方法(參見例如美國專利4，816，567)制備。也可以使用Clackson等人，Natrue 352 624-628(1991)和 Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)中記載的方法，從噬菌體抗體庫中分離“單克隆抗體”。
單克隆抗體可以進一步包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)(其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物質(zhì)或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)組列相同或同源，而鏈的剩余部分與來自另一物質(zhì)或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)組列相同或同源)以及這樣抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利4，816，567 ；以及Morrison等人，Proc. Natl. Acid. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。
在本文中使用時，術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。包含氨基酸殘基的高變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 24-34 (LI)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 31-35 (Hl)、50-65 (H2) 和 95-102 (H3) ;Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1990))的氨基酸殘基和/或那些來自“高變環(huán)(hypervariable loop) ”(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 26-32 (LI)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 26-32 (Hl) ,53-55 (H2) 和 96-101(H3) ；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))的殘基。“框架”或 “FR”殘基是那些不同于本文定義的高變區(qū)殘基的可變結(jié)構(gòu)域殘基。
非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是含有來自非人免疫球蛋白的最小組列的嵌合抗體。在大多數(shù)部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體(recipient antibody)), 其中所述受者的高變區(qū)殘基被具有所需的特異性、親和性和能力的來自非人物種如小鼠、 大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基(供體抗體)替代。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。另外，人源化抗體可以包含在受者抗體或在供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體會包含實質(zhì)上至少一個(通常為兩個)可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的高變環(huán)對應(yīng)于那些非人免疫球蛋白，并且所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的FR區(qū)是那些人的免疫球蛋白組列的FR區(qū)。人源化抗體可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的部分。進一步的細節(jié)參見Jones等人,Nature 321 :522-525(1986) ;Riechmann等人，Nature 332 :323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)。
在本文中互換使用的術(shù)語“多核苷酸”和“核酸分子”是指任意長度的聚合形式的核苷酸(無論是核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸)。這些術(shù)語包括單鏈、雙鏈或三鏈DNA，基因組DNA，cDNA, RNA, DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤和嘧啶堿基或其它天然的、通過化學(xué)或生物學(xué)方法修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基團(如可通常在RNA或DNA中發(fā)現(xiàn))，或修飾的或替代的糖或磷酸基團。另外，可以通過合成互補鏈并在適宜條件下將該鏈復(fù)性(anneal)，或者通過使用DNA聚合酶用適宜的引物從頭合成互補鏈，來從化學(xué)合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物得到雙鏈多核苷酸。核酸分子可以有多種形式，如基因或基因片段、一個或多個外顯子、一個或多個內(nèi)含子、mRNA、cDNA、 重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、分離的任意組列的DNA、分離的任意組列的RNA、 核酸探針以及引物。多核苷酸可以包括修飾核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸類似物、尿嘧 P定(uracyl)、其它糖和諸如氟代核糖(fIuororibose)和硫代酸酯(thioate)的連接基，以及核苷酸分支。本文使用的“DNA”或“核苷酸組列”不僅包括堿基A、T、C和G，還包括任何它們的類似物或這些堿基的修飾形式如甲基化核苷酸、核苷酸間修飾如不帶電的鍵和硫代酸酯、糖類似物的使用，以及修飾和/或備選的骨架結(jié)構(gòu)如聚酰胺。
本文使用的術(shù)語“溶液”、“混合物”或“樣品”是指所關(guān)注的蛋白質(zhì)或靶蛋白(例如含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)如抗體)和一種或多種雜質(zhì)的混合物。在一些實施方案中，將所述樣品在經(jīng)歷本發(fā)明的方法前進行澄清步驟。在一些實施方案中，所述樣品包括細胞培養(yǎng)料，例如來自哺乳動物細胞培養(yǎng)(如CHO細胞)的料。然而，樣品還包括用于產(chǎn)生所關(guān)注的蛋白質(zhì)的非哺乳動物表達系統(tǒng)。
本文使用的術(shù)語“非哺乳動物表達系統(tǒng)”是指所有用于產(chǎn)生治療蛋白質(zhì)的宿主細胞或生物體，其中所述宿主細胞或生物體是非哺乳動物來源。非哺乳動物表達系統(tǒng)的非限制性實例是大腸桿菌(E. coli)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。
本文使用的術(shù)語“UV活性物質(zhì)”是指如通過UV分光光度計所監(jiān)測的，澄清細胞培養(yǎng)物在經(jīng)歷蛋白A分析柱后的流通流分的組合物。在一些實施方案中，所述UV分光光度計監(jiān)測280nm的流分。該流分通常由雜質(zhì)(如染料(例如pH指示劑)、宿主細胞蛋白質(zhì)、DNA 和其它需要從該流分中除去的細胞培養(yǎng)基成分)組成，還包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)(如抗體)。 手動或通過預(yù)設(shè)算法積分流通雜質(zhì)峰，并且用于定量總雜質(zhì)水平。
本文使用的術(shù)語“多肽”通常是指具有多于約10個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。在本文中互換使用的術(shù)語“所關(guān)注的蛋白質(zhì)”或“靶蛋白”是指欲通過本發(fā)明的方法從一種或多種雜質(zhì)中純化的蛋白質(zhì)或多肽(包括但不限于含有Fe的蛋白質(zhì)如抗體)。
多肽的實例包括例如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -I-抗胰蛋白酶；胰島素α -鏈；胰島素β -鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和維勒布蘭德因子；抗凝血因子如蛋白C ;心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);蛙皮素 (combesin);凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ;腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)正常表達和分泌的T細胞的激活)；人巨噬細胞炎性蛋白質(zhì)MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白；繆勒管抑制物質(zhì)(Muellerian-inhibiting substance);松弛素α-鏈；松弛素β_鏈；松弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白如內(nèi)酰胺酶；DNase ；IgE ;細胞毒性T-淋巴細胞關(guān)聯(lián)抗原(CTLA)(如CTLA-4);抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子受體；蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)， 或神經(jīng)生長因子如NGF-β ;血小板源性生長因子(TOGF);成纖維細胞生長因子如aFGF 和3FGF;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β I、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ;胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-1 和 IGF-II)； des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I);胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白質(zhì)如CD3、CD4、 ⑶8、⑶19、CD20、⑶34和⑶40 ;促紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP);干擾素如干擾素-a、- β和-Υ ;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ； 白介素(IL)，如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ-細胞受體；表面膜蛋白(surface membrane protein);衰變加速因子；病毒抗原,例如艾滋病毒包膜的部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，如CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原，如HER2、HER3或HER4受體；以及任意上述所列的多肽的片段和/或變體。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽是與任意上述所列的多肽特異性結(jié)合的抗體、其片段或變體。
在本文中互換使用的術(shù)語“污染物”、“雜質(zhì)”和“殘留物(debris) ”是指任意外源的或不要的(objectionable)分子，包括生物大分子，如DNA、RNA、一種或多種宿主細胞蛋白(HCP)、內(nèi)毒素、脂質(zhì)和一種或多種添加劑，其可能存在于含有使用本發(fā)明的方法從一種或多種外來的或不要的分子中分離的靶蛋白的樣品中。另外，這樣的污染物可以包括任何可能在純化方法之前發(fā)生的步驟中使用或產(chǎn)生的試劑，如當(dāng)使用蛋白A親和色譜步驟的情況下浙出的(leached)蛋白A。
互換使用的術(shù)語“中國倉鼠卵巢細胞蛋白”和“CHOP”是指來自中國倉鼠卵巢 (“CH0”)細胞培養(yǎng)物的宿主細胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP通常作為包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)(如在CHO細胞中表達的抗體或免疫粘附素)的細胞培養(yǎng)基或裂解液(如收集的細胞培養(yǎng)液(“HCCF”))中的雜質(zhì)而存在。在包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)的混合物中存在的CHOP的量提供了所關(guān)注蛋白質(zhì)純度的量度。HCP或CHOP包括但不限于由宿主細胞(如 CHO宿主細胞)表達的所關(guān)注蛋白質(zhì)。通常，以相對于蛋白質(zhì)混合物中所關(guān)注的蛋白質(zhì)的量的百萬分數(shù)表示所述混合物中的CHOP的量。可以理解的是，當(dāng)宿主細胞是另一種細胞類型 (如除了 CHO外的哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或植物細胞)時，HCP是指在宿主細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)的除靶蛋白之外的蛋白質(zhì)。
在本文中互換使用的術(shù)語“百萬分之…”或“ppm”是指通過本發(fā)明方法純化的靶蛋白的純度的量度。單位PPm是指所關(guān)注的蛋白質(zhì)(毫克/毫升)中HCP或CHOP的量(納克/毫克)(即，CHOP ppm = (CHOP ng/ml)/(所關(guān)注的蛋白質(zhì)mg/ml),其中所述蛋白質(zhì)是溶液的形式)。
在本文中互換使用的術(shù)語“純化”、“分開”或“分離”是指從含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的組合物或樣品中提高所關(guān)注的多肽或蛋白質(zhì)或靶蛋白的純度。通常， 通過從所述組合物中(全部或部分地)除去至少一種雜質(zhì)來提高所關(guān)注的蛋白質(zhì)的純度。 “純化步驟”可以是導(dǎo)致“同質(zhì)”組合物或樣品的整個純化方法的一部分，本文使用的組合物或樣品是指在含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)的組合物中含有少于IOOppm HCP，或者少于90ppm、 少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于 lOppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP的組合物或樣品。
本文使用的術(shù)語“蛋白相”是指相對于樣品中靶蛋白的初始濃度，靶蛋白濃度實質(zhì)上增加的樣品中的部分。濃縮方法可以包括在固相多孔或非多孔支持物上的蛋白質(zhì)吸附； 在液體-空氣或液體-氣體界面的蛋白質(zhì)吸附；在兩種不混溶或部分混溶的液體間界面的蛋白質(zhì)吸附；作為純的成分或作為含有一種或多種分子或聚合物的復(fù)合制劑的結(jié)果的蛋白質(zhì)沉淀；或使用蛋白質(zhì)結(jié)晶。
本文使用的術(shù)語“液相”是指相對于樣品中蛋白質(zhì)的初始濃度，靶蛋白濃度實質(zhì)上降低的樣品中的部分?？梢耘c如上述定義的蛋白相同時產(chǎn)生液相。
在本文中互換使用的術(shù)語“流通過程”、“流通模式”和“流通色譜法”是指產(chǎn)品分離技術(shù)，其中樣品中的至少一種產(chǎn)物意圖流經(jīng)色譜樹脂或介質(zhì)，而至少一種潛在成分與所述色譜樹脂或介質(zhì)結(jié)合。
意圖流經(jīng)的樣品通常被稱為“流動相”?！傲魍Ｊ健蓖ǔＪ堑榷炔僮?即期間流動相的成分不變的色譜方法)。用于流通的介質(zhì)通常用含有靶蛋白分子的相同緩沖液預(yù)平衡。純化后，可以使用另外量的相同緩沖液沖洗介質(zhì)以增加產(chǎn)品的回收。在一些實施方案中，“流通模式”的流動相是含有所關(guān)注產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)料。在一些實例中，調(diào)節(jié)料的PH或?qū)щ娐室允褂昧魍ǚ椒ㄗ畲笙薅鹊爻ルs質(zhì)。
在本發(fā)明的方法以及如本文所列的實施例中所述的一些實施方案中，所述方法使用以流通模式進行的陰離子交換步驟。
在本文中互換使用的術(shù)語“結(jié)合和洗脫方式”和“結(jié)合和洗脫過程”是指其中樣品中含有的至少一種產(chǎn)品與色譜樹脂或介質(zhì)結(jié)合并隨后被洗脫的產(chǎn)品分離技術(shù)。
術(shù)語“色譜法”是指任意種類的將所關(guān)注的分析物(如含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)如免疫球蛋白)與存在于混合物中或結(jié)合和洗脫過程中的其它分子分離的技術(shù)，其中作為混合物中各分子在流動相影響下流經(jīng)固定介質(zhì)的速率不同的結(jié)果，將所關(guān)注的分析物與其它分子分離。
在本文中互換使用的術(shù)語“色譜樹脂”或“色譜介質(zhì)”是指任意種類的多孔或非多孔固相，其將所關(guān)注的分析物(如含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì)如免疫球蛋白質(zhì))與存在于混合物中或結(jié)合和洗脫過程中的其它分子分離。通常，作為混合物中各分子在流動相影響下流經(jīng)固定的固相的速率不同的結(jié)果，將所關(guān)注的分析物與其它分子分離。非限制性實例包括具有陽離子、陰離子、HIC或混合模式表面修飾的樹脂；具有陽離子、陰離子、HIC或混合模式表面修飾的膜；具有陽離子、陰離子、HIC或混合模式表面修飾的織造或非織造纖維；以及具有陽離子、陰離子、HIC或混合模式表面修飾的整料(monolith)。
本文使用的術(shù)語“親和分離”或“親和純化”是指包括使含有靶分析物(如含有Fe 區(qū)的蛋白質(zhì)如免疫球蛋白)的樣品與已知與所述靶分析物結(jié)合的親和介質(zhì)(如其上攜帶已知與所述分析物結(jié)合的親和配體(例如蛋白A或其變體)的固體支持物)接觸的任意純化或測定技術(shù)。
在本文中互換使用的術(shù)語“親和色譜法”和“蛋白質(zhì)親和色譜法”是指其中將靶蛋白(如含有Fe區(qū)的所關(guān)注的蛋白質(zhì)或抗體)與對所述靶蛋白具有特異性的配體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。在一些實施方案中，這樣的配體是蛋白A或蛋白G或它們的功能性變體，其與色譜固相材料共價連接，并且當(dāng)溶液接觸色譜固相材料時容易接近溶液中的靶蛋白。在色譜步驟過程中，靶蛋白通常保留其對配體的特異性結(jié)合親和力，而混合物中的其它溶質(zhì)和/或蛋白質(zhì)不與配體可測地或特異性地結(jié)合。靶蛋白與固定配體的結(jié)合允許污染蛋白質(zhì)(contaminating protein)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)通過色譜介質(zhì),而革巴蛋白保持與固相材料上的固定配體特異性結(jié)合。隨后在適宜的條件(如低pH、高pH、高鹽、競爭配體等)下以活性形式從固定配體上移出該特異性結(jié)合的靶蛋白，并且隨不含早些時候允許通過色譜柱的污染蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)的洗脫緩沖液通過色譜柱。任意成分均可用作用于純化其各自的特異性結(jié)合蛋白質(zhì)(如抗體)的配體。然而，在本發(fā)明的各種方法中，蛋白A用作用于含有 Fe區(qū)的靶蛋白或抗體的配體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定從配體(如蛋白A)中洗脫靶蛋白(如含有Fe區(qū)的蛋白質(zhì))的條件。在一些實施方案中，蛋白G或功能性變體可用作配體，在一些實施方案中，在pH范圍5-9下使用諸如蛋白A的配體與含有Fe區(qū)的靶蛋白結(jié)合，將該配體/靶蛋白結(jié)合物清洗或再平衡，隨后用PH約為4或低于4的緩沖液洗脫。
雖然親和色譜法對于結(jié)合所關(guān)注的蛋白質(zhì)是特異性的，但使用諸如蛋白A和蛋白 G的配體的親和色譜法往往相當(dāng)昂貴并且色譜柱被非特異性物質(zhì)(如一種或多種雜質(zhì))快速污染，導(dǎo)致工業(yè)上的巨大問題。本發(fā)明的方法提供通過使用通過從樣品中除去一種或多種非特異性物質(zhì)來減少色譜柱的負荷，從而降低整體費用并增加柱的使用壽命的材料(如活性碳)解決該問題的方法。另外，一些本發(fā)明的方法導(dǎo)致親和色譜步驟后更少色譜步驟的使用，從而提高整體方法的效率。
在重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的多步驟純化中，通常在方法的早期將靶蛋白與存在于細胞培養(yǎng)液中的多種不同的可溶性雜質(zhì)分離是有益的?？梢酝ㄟ^靶蛋白的色譜俘獲或非色譜分離來實現(xiàn)該分離。
本文使用的色譜“俘獲”步驟包括將靶蛋白與恰好位于所收集的通過細菌發(fā)酵或細胞培養(yǎng)表達產(chǎn)生的原料的下游的色譜介質(zhì)的結(jié)合。通常，將所收集的料澄清，然而也可以從未澄清的料實現(xiàn)俘獲。該步驟的主要功能是使用最小量的可能的樹脂從溶液中結(jié)合靶蛋白，但允許雜質(zhì)流過。隨后將靶蛋白洗脫入顯著較小體積的緩沖液中以供進一步的下游處理。選擇具有動態(tài)結(jié)合能力、回質(zhì)(mass recovery)和祀的生物學(xué)活性保持的最佳組合的色譜介質(zhì)。對于含有Fe結(jié)合區(qū)的抗體，通常使用親和色譜介質(zhì)，如那些基于蛋白A或蛋白 G的親和色譜介質(zhì)。
用于俘獲的色譜介質(zhì)選自多孔樹脂、膜、整料、織造或非織造多孔材料。
靶蛋白的非色譜分離可以通過一種或多種以下的步驟實現(xiàn)在固相多孔或非多孔支持物上的蛋白質(zhì)吸附；在液體-空氣或液體-氣體界面的蛋白質(zhì)吸附；在兩種不混溶或部分混溶的液體界面間的蛋白質(zhì)吸附；作為純的成分或作為含有一種或多種分子或聚合物的復(fù)合制劑的結(jié)果的蛋白質(zhì)沉淀；或使用蛋白質(zhì)結(jié)晶。
術(shù)語“離子交換”和“離子交換色譜法”是指其中混合物中所關(guān)注的溶質(zhì)或分析物 (如含有Fe區(qū)的靶蛋白)與通過例如共價連接與固相離子交換材料連接的帶電化合物相互作用，從而所述所關(guān)注的溶質(zhì)或分析物與多于或少于所述混合物中的溶質(zhì)雜質(zhì)或污染物的所述帶電化合物非特異性地相互作用的色譜方法。該混合物中污染物溶質(zhì)從離子交換材料柱上的洗脫比所關(guān)注的溶質(zhì)快或慢，或相對于所關(guān)注的溶質(zhì)與樹脂結(jié)合或從樹脂中排除。“離子交換色譜法”特別包括陽離子交換、陰離子交換和混合模式離子交換色譜法。例如，陽離子色譜法可以結(jié)合靶分子(如含有Fe區(qū)的靶蛋白)隨后進行洗脫(陽離子交換結(jié)合和洗脫色譜法或“CIEX”)，或者可以主要結(jié)合雜質(zhì)而使靶蛋白“流經(jīng)”該柱(陽離子交換流通色譜法FT-CIEX)。陰離子交換色譜法可以結(jié)合靶分子(如含有Fe區(qū)的靶蛋白)隨后進行洗脫，或者可以主要結(jié)合雜質(zhì)而使靶蛋白“流經(jīng)”該柱。在一些實施方案中并且如本文所列的實施例證明，陰離子交換色譜步驟以流通模式進行。在一具體實施方案中，陰離子交換色譜步驟采用包括多孔基質(zhì)和基質(zhì)上的多孔涂層的多孔吸附介質(zhì)，其中所述涂層含有一種或多種聚合伯胺或其共聚物。
本文使用的術(shù)語“混合模式色譜法”或“多模式色譜法”是指采用攜帶至少兩種不同類型的官能團(各自能夠與所關(guān)注的分子相互作用)的色譜固相的方法。混合模式色譜介質(zhì)的實例是Capto Adhere (GE Healthcare),其是AEX混合模式樹脂。混合模式色譜法通常使用具有多于一種的與靶蛋白和/或雜質(zhì)相互作用模式的配體。該配體通常包含至少兩個不同的但協(xié)同的位點，其與待結(jié)合的物質(zhì)相互作用。例如，這些位點之一可以與所關(guān)注的物質(zhì)具有電荷-電荷類型相互作用，而其它位點可以與所關(guān)注的物質(zhì)具有電子受體-供體類型相互作用和/或疏水和/或親水相互作用。電子供體-受體類型相互作用包括氫鍵合、JI-JI、陽離子-Ji、電荷轉(zhuǎn)移、偶極-偶極和誘導(dǎo)偶極相互作用。一般而言，基于相互作用總和的不同，靶蛋白和一種或多種雜質(zhì)可以在一定范圍的條件下分離。
本文使用的術(shù)語“疏水作用色譜法”或“HIC”是指基于分子的疏水性(即它們從水溶液中吸附至疏水表面的能力)分離分子的方法。HIC通常不同于反相(RP)色譜法，其區(qū)別在于特殊設(shè)計的HIC樹脂(相對于RP樹脂通常具有較低疏水性或疏水配體密度)。19
HIC色譜法通常依賴溶質(zhì)分子表面疏水基團的不同。這些疏水基團傾向于與不溶基質(zhì)表面上的疏水基團結(jié)合。由于HIC使用比反相液體色譜法更高極性、更少變性的環(huán)境， 其更普遍用于蛋白質(zhì)純化(通常與離子交換或凝膠過濾色譜法組合使用)。
術(shù)語“離子交換樹脂”、“離子交換介質(zhì)”和“離子交換材料”是指帶負電(即陽離子交換樹脂)或帶正電(即陰離子交換樹脂)的固相?？梢酝ㄟ^將一種或多種帶電配體附著在固相上(例如通過共價鍵或非共價涂層或吸附)來提供電荷?；蛘?，或附加地，電荷可以是所述固相的固有特性。
本文使用的術(shù)語“CEX”、“陽離子交換介質(zhì)”、“陽離子交換樹脂”和“陽離子交換材料”是指其帶負電荷并且因此具有用于與經(jīng)過或通過固相的水溶液中的陽離子交換的游離陽離子的固相。附著至固相上以形成陽離子交換樹脂的負電荷配體可以是例如羧酸鹽或磺酸鹽?？缮藤彨@得的陽離子交換樹脂包括羧甲基纖維、固定在瓊脂糖(如來自Pharmacia 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW 或 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE )上的磺丙基(SP)和固定在瓊脂糖(如來自Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOW )上的磺?；?。
本文使用的術(shù)語“混合模式介質(zhì)”、“混合模式樹脂”和“混合模式離子交換樹脂”是指用陽離子基團、陰離子基團和疏水基團共價修飾的固相?？缮藤彨@得的混合模式離子交換樹脂是BAKERBOND ABX (J. T. Baker,Phillipsburg,N. J.)，其含有弱陽離子交換基團、低濃度的陰離子交換基團以及附著在硅膠固相支持基質(zhì)上的疏水配體。
本文使用的術(shù)語“HIC介質(zhì)”或“HIC樹脂”或“HIC材料”是指用于HIC分離的色譜材料。HIC介質(zhì)通常來自用疏水配體(例如短脂族或芳族基團)修飾的多孔色譜樹脂。HIC介質(zhì)的實例包括Butyl Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF,兩者均可以從 GE Healthcare商購獲得。商購HIC樹脂的其它實例包括Fractogel Phenyl和Fractogel Propyl (MERCK KGA, Darmstadt, Germany)、Butyl Sepharose 和 Phenyl Sepharose (GE HEALTHCARE)。
本文使用的術(shù)語“AEX”、“陰離子交換介質(zhì)”、“陰離子交換樹脂”和“陰離子交換材料”是指帶有正電荷(如具有附著于其上的一種或多種帶正電的配體，例如伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基)的固相。商購陰離子交換樹脂包括DEAE cellose.QAE SEPHADEX 和 FAST SEPHAROSE (PHARMACIA)。
術(shù)語“蛋白A”和“Ρι·οΑ”在本文中可互換使用，并且包括從其天生來源回收的蛋白Α、(如通過肽合成或通過重組技術(shù))合成生產(chǎn)的蛋白Α、以及它們的保留結(jié)合具有CH2/ CH3區(qū)(如Fe區(qū))蛋白質(zhì)的能力的變體。蛋白A可商購自Repligen, GEHealthcare and Lonza0蛋白A通常固定在固相支持材料上。術(shù)語“ProA”也指含有與蛋白A共價連接的色譜固相支持基質(zhì)的親和色譜樹脂或柱。
可以通過對于小鼠IgG2a或人IgGl的Fe區(qū)的結(jié)合常數(shù)(至少K = 10_8M，優(yōu)選K =10_9M)表征本發(fā)明方法中使用的蛋白A功能性衍生物、片段或變體。符合這樣的結(jié)合常數(shù)值的相互作用在本發(fā)明上下文中被稱為“高親和性結(jié)合”。優(yōu)選地，這樣的蛋白A的功能性衍生物或變體包括至少部分的野生型蛋白A的功能性IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(選自天然結(jié)構(gòu)域 E、D、A、B、C)或其保留IgG結(jié)合功能性的工程突變體(engineered mutant)。
本發(fā)明的“污染物蛋白A”是任意類型的如上述定義的蛋白A或其功能衍生物的功能性IgG結(jié)合產(chǎn)物，其在從蛋白A親和色譜柱中洗脫結(jié)合的抗體時得到。這樣的污染物蛋白2A物質(zhì)可以來自例如肽鍵水解(其很可能通過(特別是工業(yè)生產(chǎn)中的)酶作用發(fā)生)。當(dāng)進行粗純化時，蛋白A色譜法被用作下游處理的早期步驟，新鮮的產(chǎn)物溶液仍然具有相當(dāng)大的蛋白酶活性。細胞培養(yǎng)肉湯中的瀕死細胞或在初始離心或過濾步驟中破裂的細胞很可能釋放游離的蛋白酶；為了調(diào)節(jié)的目的，相對于生物化學(xué)研究實踐，通常不在下游處理之前或在下游處理過程中用蛋白酶抑制劑補充細胞培養(yǎng)肉湯。實例是苯甲基磺酰氯(PMSF)或 e-己酸。這樣的化學(xué)試劑在生物制藥的生產(chǎn)中作為添加劑是不期望的。更加可能的是，取決于蛋白質(zhì)折疊的三級結(jié)構(gòu)，蛋白A的重組功能性衍生物或片段比野生型蛋白A的蛋白酶抗性更低。一旦減少結(jié)合結(jié)構(gòu)域的總數(shù)，則連接各IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸片段可能被暴露。結(jié)構(gòu)域間的接觸可能促進結(jié)構(gòu)域折疊的穩(wěn)定性。也可能由于抗體結(jié)合時誘導(dǎo)的構(gòu)型改變，蛋白A或其所述功能性衍生物的抗體結(jié)合影響或促進了蛋白酶作用的易感性。
將分子與色譜樹脂“結(jié)合”意味著在適宜條件(pH/導(dǎo)電率)下將分子暴露于色譜樹脂，使得通過配體-蛋白質(zhì)相互作用將所述分子可逆地固定在色譜樹脂之中或之上。非限制性實例包括所述分子和離子交換材料的一個或多個帶電基團間的離子相互作用以及蛋白A和免疫球蛋白間的生物特異性相互作用。
術(shù)語“清洗緩沖液”或“平衡緩沖液”在本文中可互換使用，是指在洗脫所關(guān)注的多肽分子前用于清洗或再平衡色譜樹脂的緩沖液。在一些情況下，清洗緩沖液和上樣緩沖液可以相同?！扒逑础鄙V介質(zhì)意味著包括使適宜的緩沖液通過或經(jīng)過所述介質(zhì)。
“洗脫緩沖液”用于從固相上洗脫靶蛋白。洗脫緩沖液的導(dǎo)電率和/或pH通常使得靶蛋白從色譜樹脂上洗脫下來。
從色譜樹脂上“洗脫”分子(如所關(guān)注的多肽或雜質(zhì))意味著通過改變?nèi)芤簵l件而從中除去分子，使得緩沖液與所關(guān)注的分子競爭與色譜樹脂結(jié)合。非限制性實例是通過改變離子交換材料周圍的緩沖液的離子強度來從離子交換樹脂上洗脫分子，使得所述緩沖液與所述分子競爭所述離子交換材料上的帶電位點。
本文使用的術(shù)語“洗出液”是指經(jīng)由洗脫得到的含有所關(guān)注的分子的溶液，以及作為流通純化結(jié)果得到的含有所關(guān)注的靶蛋白的流通流分。在一些實施方案中，術(shù)語“洗出液”是指從結(jié)合和洗脫色譜步驟(如蛋白A親和色譜步驟)得到的洗脫合并液。在一些實施方案中，在具有或沒有中間的病毒失活步驟的情況下，來自蛋白A親和色譜步驟的洗出液流入使用活性碳的流通純化過程。
術(shù)語“固相”或“多孔基質(zhì)”或“基質(zhì)(base matrix) ”是指一種或多種帶電配體可粘附于其上的非水性材料。所述固相可以是純化柱、多孔的或非多孔的離散顆粒的間斷相、 膜、織造或非織造纖維、整料或過濾器等。用于形成固相的材料的實例包括多糖(如瓊脂糖和纖維素)；和其它機械穩(wěn)定的基質(zhì)如二氧化娃(如定孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、 聚丙烯酰胺、聚乙烯醚(polyvinyl ether)、尼龍、高分子量聚乙烯(HDPE)、聚醚砜、陶瓷和任意上述物質(zhì)的衍生物。
“緩沖液”是通過其酸-堿結(jié)合物組分的作用抵抗pH改變的溶液?？梢愿鶕?jù)例如 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy，D.，e d. Calbiochem Corporation (1975)中描述的緩沖液的期望pH使用不同的緩沖液。在本發(fā)明的方法的一些步驟中，緩沖液具有2. O至4.0，或2. 8至3. 8的pH。在本發(fā)明的其它步驟中，緩沖液具有5. O至9. O的pH。在本發(fā)明的其它步驟中，緩沖液具有4. O至6. 5的pH。在本發(fā)明的方法的其它步驟中，緩沖液具有低于4. O的pH?？刂苝H在該范圍的緩沖液的非限制性實例包括MES、M0PS、M0PS0、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、 琥珀酸鹽和銨緩沖液，以及這些的組合。
術(shù)語“導(dǎo)電率”是指水溶液在兩個電極間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過離子轉(zhuǎn)運流動。因此，隨著水溶液中存在的離子量的增加，溶液會具有更高的導(dǎo)電率。導(dǎo)電率的測量單位是毫西每厘米(mS/cm或mS)，并且可以使用商購的電導(dǎo)儀(如Orion出售的) 測量?？梢酝ㄟ^改變?nèi)芤褐械碾x子濃度而改變其導(dǎo)電率。例如，可以改變?nèi)芤褐械木彌_劑濃度和/或鹽(如NaCl或KCl)濃度以達到期望的導(dǎo)電率。優(yōu)選地，改變不同緩沖液中的鹽濃度以實現(xiàn)如以下實施例中的期望導(dǎo)電率。
多肽的“pi”或“等電點”是指多肽的正電荷與其負電荷平衡時的pH。可以從氨基酸殘基或多肽上附著的碳水化合物的唾液酸殘基的凈電荷計算pi，或可以通過等電聚焦測定pi。
本文使用的“濾液”是指樣品通過介質(zhì)的部分。
本文使用的“保留物(retenate) ”是指基本被介質(zhì)保留的樣品部分。
本文使用的術(shù)語“澄清”是指通過除去懸浮顆粒來降低含有蛋白質(zhì)的溶液的(如在NTU中測定的)濁度的過程。澄清可以通過多種方法實現(xiàn)，包括分批和連續(xù)離心、深層過濾、正常和正切流動過濾以及沉淀(包括用小分子或聚合物質(zhì)進行凝絮)，或這些方法的任意組合。
短語“減少色譜柱的負荷”是指對含有蛋白質(zhì)的樣品的處理或加工，其中所述處理或加工導(dǎo)致減少了色譜柱的污垢，蛋白質(zhì)樣品隨后被裝載在所述色譜柱上。在典型的色譜試驗中，可能有非洗出液質(zhì)或雜質(zhì)留在固定相上，從而導(dǎo)致色譜柱的污垢。該問題在放大規(guī)模時進一步加劇，其中由于存在的雜質(zhì)水平增加導(dǎo)致柱污垢程度增加。柱污垢還導(dǎo)致通常相當(dāng)昂貴的柱壽命的顯著減少。本發(fā)明的方法提供改進的方法用于顯著減少色譜柱的負荷，從而增加柱的壽命并導(dǎo)致蛋白質(zhì)收率提高。本發(fā)明的方法導(dǎo)致在將樣品裝載到色譜柱前除去顯著量的雜質(zhì)，從而減少柱的負荷。典型的雜質(zhì)包括宿主細胞蛋白、DNA、脂肪酸(來自細胞碎片)、染料分子、消泡劑等。
在本文中互換使用的術(shù)語“工藝步驟”或“單元操作”是指在純化過程中使用一種或多種方法或裝置以實現(xiàn)特定的結(jié)果?？梢栽诒疚拿枋龅姆椒ɑ蛳到y(tǒng)中使用的工藝步驟或單元操作的實例包括但不限于澄清、結(jié)合和洗脫色譜俘獲、病毒滅活、流通純化和配制。應(yīng)理解，每種工藝步驟或單元操作均可使用多于一個步驟或方法或裝置以實現(xiàn)該工藝步驟或單元操作的預(yù)期結(jié)果。例如，在一些實施方案中，如本文描述的流通純化步驟可以使用多于一個步驟或方法或裝置以實現(xiàn)該工藝步驟或單元操作，其中至少一個這樣的步驟包括活性碳。在一些實施方案中，用于進行工藝步驟或單元操作的一種或多種裝置是一次使用的或一次性的，并且可以在不需要在方法中替換任何其它裝置或甚至停止方法運行的情況下被移除和/或替換。
本文使用的術(shù)語“合并液罐(pool tank)”是指其通常在多個工藝步驟間使用并且具有能夠收集來自工藝步驟的整個體積的產(chǎn)品的尺寸/容積的任何容器、器皿、貯液器 (reservoir)、罐或袋。合并液罐可用于保持或儲存或處理來自工藝步驟的整個體積的溶液狀態(tài)的產(chǎn)品。在一些實施方案中，本文描述的方法避免了使用一個或多個合并液罐的需要。
本文使用的術(shù)語“緩沖罐”是指在多個工藝步驟間或一個工藝步驟中(如當(dāng)單獨的工藝步驟包括多于一個步驟時)使用的任何容器、器皿或袋；其中來自一個步驟的產(chǎn)物流經(jīng)緩沖罐進入下一個步驟。因此，緩沖罐不同于合并液罐，在于它不意圖保留或收集來自某步驟的整個體積的產(chǎn)物；但能夠使產(chǎn)物從一個步驟連續(xù)流到下一個步驟。在一些實施方案中，本文描述的方法或系統(tǒng)中的兩個步驟間或一個步驟中使用的緩沖罐的容積不超過來自工藝步驟的產(chǎn)物的總體積的25%。在另一個實施方案中，緩沖罐的容積不超過來自工藝步驟的產(chǎn)物的總體積的10%。在一些其它實施方案中，緩沖罐的容積小于生物反應(yīng)器中細胞培養(yǎng)物的整個體積的35%、或小于30%、或小于25%、或小于20%、或小于15%、或小于 10%，其構(gòu)成欲從中純化靶分子的原料。在一些實施方案中，在先后使用活性碳、AEX色譜法、CEX色譜法和病毒過濾的流通純化工藝步驟中使用緩沖罐，其中所述緩沖罐用于在AEX 色譜步驟之后進行溶液的改變。
本文使用的術(shù)語“連續(xù)方法”是指用于純化靶分子的方法，其包括兩個或更多個工藝步驟(或單元操作)，使得來自一個工藝步驟的產(chǎn)物直接流入該方法中下一個工藝步驟而沒有中斷，并且其中所述兩個或更多個工藝步驟可以在它們的至少一部分持續(xù)時間同時進行。換言之，連續(xù)方法避免了在純化過程中在進行下一工藝步驟前完成工藝步驟的需要。 術(shù)語“連續(xù)方法”還用于一個工藝步驟中的多個步驟，在該情況中，在進行包括多個步驟的工藝步驟期間，樣品連續(xù)流經(jīng)該工藝步驟中必須進行的多個步驟。因此，在一些實施方案中，以連續(xù)方式進行使用活性碳的流通純化步驟，其中來自先于流通純化步驟的結(jié)合和洗脫色譜步驟(如蛋白A色譜俘獲步驟)的洗出液先后流入(填充入纖維素介質(zhì)中的)活性碳步驟、AEX色譜步驟、CEX色譜步驟以及病毒過濾步驟。
術(shù)語“靜態(tài)混合器”是指用于混合兩種流體材料(通常是液體)的裝置。該裝置通常由在圓柱狀(管)殼(housing)中所含的混合器元件(也被稱為非移動元件)組成。 當(dāng)液流流經(jīng)靜止混合器時，所述非移動元件將所述材料連續(xù)混合。完全混合取決于許多變量，包括流體的特性、管的內(nèi)徑、混合元件的數(shù)目和它們的設(shè)計等。在本文描述的一些實施方案中，在本文描述的方法中(如在AEX色譜步驟和CEX色譜步驟之間)使用一個或多個靜止混合器。
本發(fā)明進一步通過以下實施例進行說明，所述實施例不應(yīng)解釋為限制性的。所有在本申請全文中引用的參考文獻、專利和公開的專利申請的內(nèi)容以及附圖援引加入本文。
II.用于本發(fā)明的方法中的示例性含碳材料
在本發(fā)明的方法中，特定的含碳材料如活性碳被用于蛋白質(zhì)的純化?；钚蕴伎杀幻枋龀删哂蟹浅８叩谋砻娣e的多孔固體。在一些實施方案中，活性碳包括活性炭?；钚蕴伎梢詠碜远喾N來源，包括但不限于煤、木材、椰子殼、堅果殼和泥炭?？赏ㄟ^使用包括在受控氣氛下加熱的物理活化或使用強酸、堿或氧化劑的化學(xué)活化，從這些材料制備活性碳?；罨^程產(chǎn)生有高表面積的多孔結(jié)構(gòu)，所述高表面積使活性碳具有更高的雜質(zhì)去除的能力?？筛淖兓罨^程以控制表面的酸度。
活性碳可以從多種不同的商業(yè)途徑得到并且具有多種級別和形式。活性碳的一些商業(yè)提供者包括諸如 MeadffestVaco Corp.，Richmond, VA, USA ；Norit Americas Inc.， Marshall, TX, USA ；Calgon Carbon Corp.，Pittsburgh, PA, USA 的公司。
活性碳的兩種主要的形式是粉狀和顆粒狀的。粉狀活性碳含有小(通常直徑小于Imm)的顆粒，并且最常用于液體的純化。顆粒狀活性碳有較大的粒度并因而具有較小的表面積，所以其優(yōu)選用于氣體純化，其中擴散速度更快。
在消費者應(yīng)用(如水、食品、飲料和藥物的純化)中使用活性碳的安全性的重要考慮是可提取化合物的減少和控制。意圖供飲用水和食品接觸應(yīng)用的活性碳通常依照安全標準ANSI/NSF Standard 61 (其覆蓋所有加入水中的間接添加劑)制備。同樣，ASTM標準測試方法D6385描述了通過灰化測定活性碳中的酸可提取成分，并且可以用于研究和將來自活性碳的可提取物水平降到最小。
多種活性碳類型對于各種應(yīng)用是可獲得的。例如，MeadWestVaco Corp.提供至少12種類型的粉狀活性碳，它們的容量、表面酸度、對靶分子的孔易接近性(pore accessibility)以及預(yù)期應(yīng)用不同。通常期望將活性碳的容量最大化以用于雜質(zhì)的去除。
在本文所述的一些實施方案中，活性碳被摻入到纖維素介質(zhì)中。
III.常規(guī)流通純化方法
最常見的流通純化方法顯然依賴于所關(guān)注的靶蛋白和欲除去的雜質(zhì)間不同的表面相互作用。例如，單克隆抗體的常規(guī)AEX流通純化依賴于大多數(shù)抗體的等電點高于其它蛋白質(zhì)和核酸并且通常高于7的事實。由此，在低于被純化抗體的pi的pH下進行AEX流通純化方法，以確保固定相和抗體具有相同的電荷并且從而所述抗體流經(jīng)介質(zhì)而沒有與表面顯著結(jié)合。另一方面，許多蛋白質(zhì)雜質(zhì)核酸及內(nèi)毒素具有低于抗體的pl，其通常低于7， 并且因此它們與AEX介質(zhì)的表面結(jié)合。
像大多數(shù)離子交換色譜過程一樣，AEX流通純化通常對溶液的導(dǎo)電率敏感并且通常在較高鹽度時效果較低。在一典型的單克隆抗體純化方法中，AEX流通純化有時被稱為在一個或多個結(jié)合和洗脫柱色譜步驟后的“精制步驟”。
兩種最常用的工藝模板如下所示
I)蛋白A俘獲一CEX結(jié)合和洗脫純化及濃縮一稀釋一AEX流通
2)蛋白A俘獲一AEX流通一CEX結(jié)合和洗脫純化及濃縮
除了這些常用的工藝模板外，有時也使用其它純化方案，包括CEX俘獲及使用混合模式的和無機的結(jié)合和洗脫樹脂(如Ceramic Hydroxyapatite, CHT)。一般而言,流通純化的目的是除去痕量水平的雜質(zhì)，而使用結(jié)合和洗脫步驟進行純化的主體。然而，從主要使用結(jié)合和洗脫步驟到流通純化過程的轉(zhuǎn)變可以是非常節(jié)省成本的解決辦法，其節(jié)省時間、試劑及操作成本。因此，本文所述的方法提供對于常規(guī)方法的可行的解決方法，其中它們更加節(jié)省成本的并且降低整體的制造和操作成本。
在本文所述的一些實施方案中，提供改進的流通純化方法，其使得流通純化能夠以連續(xù)方式進行。
IV.純化過稈中含碳材料的使用
如以上討論的，本發(fā)明提供使用活性碳的新的和改進的純化方法?；钚蕴伎梢灾苯蛹尤氲郊兓襟E中，并且可以隨后通過沉淀或過濾除去；或者可以使溶液或氣體通過含有活性碳的裝置。活性碳可以獨立地填充如合適的裝置中或可以與其它增強其機械、流動或分離性質(zhì)的物質(zhì)混合。例如，活性碳可被摻入到含有纖維素的濕法鋪設(shè)纖維介質(zhì)中，隨后密封入一飲性裝置(如得自 Millipore Corporation 的Millistak+ Pod CR,或得自 Pall Corporation,Port Washington,NY,USA 的Seitz AKS Filter Media)中?；钚蕴嫉牧硪环N形式是活性碳塊(block)，其中活性碳通過與熱塑性粉末一起壓制而被摻入到多孔整料中。 與色譜介質(zhì)類似，顆粒形式的活性碳也可被填充到柱中，或其可被填充入合適的裝置中。通常公認活性碳介質(zhì)用于脫色、小分子雜質(zhì)的去除等。例如，得自Pall Corporation的數(shù)個等級的活性碳介質(zhì)可以基于靶雜質(zhì)的分子量進行選擇。提供三種分子量范圍200-400、 400-1，000和400-1，500道爾頓，后面的最大。然而，任何商購的活性碳介質(zhì)均未被描述用于從生物樣品中選擇性除去分子量為2000至200，000道爾頓的更大的雜質(zhì)。
本發(fā)明至少部分地基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)活性碳能夠選擇性地結(jié)合不期望的雜質(zhì)(如HCP和DNA)，同時表現(xiàn)出可忽略不計的與靶蛋白的結(jié)合。
本發(fā)明還認識到與所有吸附材料相似，活性碳的吸附能力并非無限的這一事實。 例如，在CHO-S料的情況中，當(dāng)HCP和DNA以如實施例I中所示的典型料中觀測到的濃度存在時，活性碳表現(xiàn)出有效地除去這些物質(zhì)。然而，如實施例2中所示，發(fā)現(xiàn)添加DNA至鮮有的高水平抑制活性碳的HCP去除效率。
在靶蛋白俘獲步驟之前或之后，活性碳也可以在除去可能存在于靶蛋白溶液中的細胞培養(yǎng)基的潛在成分中高度有益。細胞培養(yǎng)基中的典型成分包括表面活性劑(如 Pluronic F68)、胰島素、抗生素、甲氨蝶呤和止泡劑。由于存在這些成分中的一些會被攜帶入純化的靶蛋白的風(fēng)險，在蛋白純化組列中加入能夠除去這些成分的步驟是有利的。如進一步被本文的實施例所證明，活性碳可用于純化過程中以除去這樣的成分。
以下是摻入活性碳作為一個或多個中間步驟(其通過下劃線顯示在下表I中)的蛋白質(zhì)純化方法的實例。應(yīng)理解可以使用這些方法的許多變體。
表I
權(quán)利要求
1.用于從蛋白A洗出液中純化靶分子的流通方法，其包括下述步驟 (i)使回收自蛋白A色譜柱的所述洗出液與活性碳接觸； ( )使來自步驟(i)的流通樣品與陰離子交換色譜介質(zhì)接觸； (iii)使來自步驟(ii)的流通樣品與陽離子交換色譜介質(zhì)接觸；以及 (iv)得到來自步驟(iii)的包含所述靶分子的流通樣品，其中所述洗出液連續(xù)流經(jīng)步驟(i)-(iii)，并且其中步驟(iii)之后的所述流通樣品中的一種或多種雜質(zhì)的水平低于其在步驟(i)中所述洗出液中的水平。
2.權(quán)利要求I的流通方法，其還包括對來自步驟(iii)的所述流通樣品進行病毒過濾。
3.權(quán)利要求I的流通方法，其還包括在步驟(ii)和步驟(iii)之間使用在線靜態(tài)混合器和/或緩沖罐來改變pH。
4.權(quán)利要求I的流通方法，其中所述方法使用單個制動器。
5.權(quán)利要求I的流通方法，其中來自所述蛋白A色譜柱的所述洗出液在與活性碳接觸前經(jīng)過病毒滅活。
6.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進行。
7.用于從蛋白A洗出液中純化靶分子的流通純化方法，其包括使所述洗出液與兩種或更多種選自活性碳、陰離子交換介質(zhì)、陽離子交換介質(zhì)和病毒過濾介質(zhì)的基質(zhì)接觸，其中所述洗出液的流動是連續(xù)的。
8.在蛋白質(zhì)純化過程中減少一個或多個色譜柱上的負荷的方法，其中所述方法包括在包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和ー種或多種雜質(zhì)的樣品與ー個或多個含有親和介質(zhì)、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、用C介質(zhì)或混合模式介質(zhì)的色譜柱接觸之前使所述樣品以流通模式與以下之一接觸，從而減少所述ー個或多個色譜柱上的所述負荷 (i)含碳材料； (ii)含碳材料和CEX介質(zhì)的組合； (iii)含碳材料和AEX介質(zhì)的組合； (iv)含碳材料和混合模式介質(zhì)的組合；和 (v)含碳材料和HIC介質(zhì)的組合。
9.在蛋白質(zhì)純化過程中減少ー個或多個使用多孔介質(zhì)的色譜步驟中的負荷的方法，其中所述方法包括在包含所關(guān)注的蛋白質(zhì)和ー種或多種雜質(zhì)的樣品與ー個或多個使用多孔介質(zhì)的色譜步驟接觸之前使所述樣品以流通模式與以下之一接觸，從而減少所述ー個或多個色譜步驟中的所述負荷 (i)含碳材料； (ii)含碳材料和CEX介質(zhì)的組合； (iii)含碳材料和AEX介質(zhì)的組合； (iv)含碳材料和混合模式介質(zhì)的組合；和 (v)含碳材料和HIC介質(zhì)的組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述多孔介質(zhì)包括親和介質(zhì)、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)或混合模式介質(zhì)中的ー種或多種。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述親和介質(zhì)選自蛋白A或蛋白G。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)是抗體或其功能片段。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品包含細胞培養(yǎng)料。
16.權(quán)利要求8的方法，其中在所述樣品與(i)至(V)之一接觸前，所述樣品經(jīng)過澄清步驟。
17.權(quán)利要求9的方法，其中所述澄清步驟包括深層過濾、篩濾、絮凝和/或離心中的一種或多種。
18.權(quán)利要求8的方法，其中所述含碳材料包括活性碳。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述活性碳包括活性炭。
20.權(quán)利要求8的方法，其中所述含碳材料和AEX介質(zhì)的組合是活性碳和AEX樹脂的混合物，所述含碳材料和CEX介質(zhì)的組合是活性碳和CEX樹脂的混合物，所述含碳材料和混合模式介質(zhì)的組合是活性碳和混合模式樹脂的混合物，并且所述含碳材料和HIC介質(zhì)的組合是活性碳和HIC樹脂的混合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中將所述混合物填充入柱。
22.權(quán)利要求20的方法，其中將所述混合物填充入密封的一次性轉(zhuǎn)置中。
23.權(quán)利要求8的方法，其中所述CEX介質(zhì)包括CEX樹脂。
24.權(quán)利要求8的方法，其中所述AEX介質(zhì)包括AEX樹脂。
25.權(quán)利要求8的方法，其中所述HIC介質(zhì)包括HIC樹脂。
26.權(quán)利要求8的方法，其中所述混合模式介質(zhì)包含第一基團和第二基團，其中所述第一基團和所述第二基團通過不同機制均與所關(guān)注的分子相互作用。
27.權(quán)利要求18的方法，其中將所述活性碳填充入柱、密封的一次性裝置、筒或囊中。
28.權(quán)利要求18的方法，其中將所述活性碳浸入多孔材料中。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述多孔材料容納在柱、密封的一次性轉(zhuǎn)置、筒或囊中。
30.權(quán)利要求8的方法，其中所述AEX介質(zhì)是具有表面涂層的多孔吸附介質(zhì)，所述表面涂層包含一種或多種聚合伯胺或其共聚物涂層。
31.權(quán)利要求9的方法，其中所述AEX介質(zhì)是具有表面涂層的多孔吸附介質(zhì)，所述表面涂層包含一種或多種聚合伯胺或其共聚物。
32.權(quán)利要求8的方法，其中所述AEX介質(zhì)是具有表面涂層的多孔吸附介質(zhì)，所述表面涂層包含一種或多種伯胺、仲胺、叔胺和季胺。
33.權(quán)利要求9的方法，其中所述AEX介質(zhì)是具有表面涂層的多孔吸附介質(zhì)，所述表面涂層包含一種或多種伯胺、仲胺、叔胺和季胺。
34.降低樣品中與所關(guān)注的蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種雜質(zhì)水平的方法，所述方法包括以下步驟 (i)在使所關(guān)注的蛋白質(zhì)在ー個或多個含有親和介質(zhì)、AEX介質(zhì)、CEX介質(zhì)、HIC介質(zhì)或混合模式介質(zhì)的色譜柱中與所述介質(zhì)結(jié)合的條件下，使包含所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)和ー種或多種雜質(zhì)的樣品與所述ー個或多個色譜柱接觸； (ii)得到所述樣品的第一洗出液； (iii)使來自(ii)中的所述第一洗出液以流通模式與以下之一接觸(a)含碳材料；和(b)含碳材料與親和介質(zhì)、CEX介質(zhì)、AEX介質(zhì)、混合模式介質(zhì)和HIC介質(zhì)中的ー種或多種的組合；以及 (iv)得到所述樣品的第二洗出液； 其中相對于所述第一洗出液中的所述ー種或多種雜質(zhì)的水平，所述第二洗出液含有較低水平的所述ー種或多種雜質(zhì)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述親和介質(zhì)選自蛋白A或蛋白G。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述第二洗出液含有少于10%的所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)收率的損失。
37.降低含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和ー種或多種雜質(zhì)的樣品中的所述ー種或多種雜質(zhì)水平的方法，所述方法包括以下步驟 (i)使所述含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和ー種或多種雜質(zhì)的樣品與含有親和介質(zhì)的色譜柱接觸； (ii)得到所述樣品的第一洗出液； (iii)使來自(ii)中的所述第一洗出液以流通模式與含碳材料接觸； (iv)得到所述樣品的第二洗出液； (v)使所述第二洗出液與陰離子交換多孔介質(zhì)膜吸附劑接觸；以及 (Vi)得到所述樣品的第三洗出液， 其中相對于所述方法中未使用所述含碳材料時所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第三洗出液含有較低水平的所述ー種或多種雜質(zhì)。
38.降低含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法，所述方法包括以下步驟 (i)提供含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的樣品； (ii)使所述樣品與適宜的介質(zhì)接觸以俘獲所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)； (iii)得到所述樣品的第一洗出液； (iv)使所述第一洗出液與含碳材料接觸； (v)得到所述樣品的第二洗出液；以及 (vi)使所述第二洗出液與陰離子交換介質(zhì)接觸；以及 (vii)得到所述樣品的第三洗出液； 其中相對于未進行步驟(iv)時所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第三洗出液含有較低水平的所述ー種或多種雜質(zhì)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)是抗體。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述陰離子交換介質(zhì)是樹脂或膜。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述含碳材料是活性碳。
43.降低含有所關(guān)注的蛋白質(zhì)的樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法，所述方法包括以下步驟 (i)通過沉淀、絮凝、結(jié)晶、與可溶性小分子或聚合物配體結(jié)合、或與懸浮色譜介質(zhì)結(jié)合來從所述樣品中分離所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)，從而得到含有所述所關(guān)注的蛋白質(zhì)的蛋白相； (ii)通過將所述蛋白相溶解于合適的緩沖液中來復(fù)水所述蛋白質(zhì)； (iii)使所述復(fù)水的蛋白質(zhì)以流通模式與含碳材料接觸；(iv)得到所述樣品的第一洗出液； (V)使所述第一洗出液與陰離子交換色譜介質(zhì)接觸；以及 (Vi)得到所述樣品的第二洗出液， 其中相對于不進行步驟(iii)時所述一種或多種雜質(zhì)的水平，所述第二洗出液含有較低水平的所述ー種或多種雜質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及在蛋白質(zhì)純化過程中降低樣品中的一種或多種雜質(zhì)水平的方法。本發(fā)明提供新的和改進的蛋白質(zhì)純化方法，其引入某些類型的含碳材料并且導(dǎo)致在對所需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的收率沒有不利影響的情況下有效地且選擇性地去除某些不需要的雜質(zhì)。
文檔編號C07K1/22GK102977182SQ201210398359
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者N·比安, C·吉萊斯皮, M·T·斯通, M·科茲洛夫, J·陳, M·瓦克 申請人:Emd密理博公司