專利名稱：一種抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系及其所分泌的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)及細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系及其分泌的單克隆抗體，以及所述單克隆抗體的純化、標(biāo)記及應(yīng)用，特別是檢測(cè)豬血清中非洲豬瘟病毒的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高率，可高達(dá)100％，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷時(shí)極易誤診，表現(xiàn)高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。(William，Hess Adv.African swine fevera reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，2539～69)世界動(dòng)物組織(OIE)列為A類疫病，我國(guó)規(guī)定為動(dòng)物一類疾病，受到世界各國(guó)的高度重視(孫懷昌.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21(2)117～119)。
本病自1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直存在于撒哈拉以南的非洲國(guó)家，1957年先后流傳至西歐和拉美國(guó)家，多數(shù)被及時(shí)撲滅，單在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個(gè)國(guó)家流行，而且有不斷蔓延趨勢(shì)。2007年，亞美尼亞連續(xù)發(fā)生六起非洲豬瘟，我國(guó)尚無(wú)該病。
非洲豬瘟在國(guó)際病毒分類委員會(huì)第四次報(bào)告中歸于虹彩病毒科，在該委員會(huì)第五次報(bào)告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動(dòng)物痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表明它不屬于國(guó)際病毒分類委員會(huì)所核定的任何一科，是個(gè)新科，1995年第9次國(guó)際病毒分類委員第六次報(bào)告，將非洲豬瘟病毒列入“類非洲豬瘟病毒屬”，非洲豬瘟是唯一已知的代表種。
非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒。其基因組為末端共價(jià)閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長(zhǎng)為170kb～190kb，中央有125kb左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長(zhǎng)度差異的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208249～279)。ASF病毒基因組有5個(gè)編碼基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復(fù))以及蛋白修飾的酶，整個(gè)基因組含有151個(gè)ORF，可以編碼150～200種蛋白質(zhì)，已從ASFV感染的細(xì)胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研究進(jìn)展，中國(guó)獸醫(yī)科技，1998，28(11)42～43)。
非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性，其中P54蛋白為具有較好抗原性的蛋白之一。
ASFV P54蛋白是由E183L基因編碼的，約25kD的多肽，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。P54蛋白可以在體外培養(yǎng)，并能感染細(xì)胞。而且在感染細(xì)胞后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處短暫表達(dá)。P54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體時(shí)起著十分重要的作用(RodriguezJM，Garcia Escudero African Swine Fever Virus Structural Protein p54 IsEssential for the Recruitment of Envelope Precursors to Assembly Sites.Journalof Virology，2004，78(8)4299～4313)。另外ASFV P54蛋白與8kD的輕鏈細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白DLC8存在特殊的交叉反應(yīng)，并在細(xì)胞內(nèi)攝作用及病毒加工過(guò)程中起重要作用。感染病毒后復(fù)制早期，病毒可激活細(xì)胞凋亡蛋白酶而誘發(fā)細(xì)胞脫噬作用(Alonso C，J Miskin African Swine Fever Virus Protein p54Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding toLight-Chain Dynein.Journal of Virology 2001，759819～9827)。為了分析結(jié)構(gòu)蛋白P54在細(xì)胞脫噬中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G將其在非洲綠猴腎細(xì)胞內(nèi)短暫表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明可激活細(xì)胞凋亡蛋白酶，誘發(fā)細(xì)胞脫噬作用(Hernaez B，Diaz Gil G.The African swine fever virusdynein-binding protein p54 induces infected cell apoptosis.FEBS Letters2004，569(123)224～228)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分泌特異性識(shí)別非洲豬瘟病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的是提供上述細(xì)胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體，所述單抗對(duì)非洲豬瘟結(jié)構(gòu)蛋白P54抗原有較好的特異性。本發(fā)明的另一目的是提供上述抗體的純化及辣根過(guò)氧化酶的酶標(biāo)記物。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系的保藏號(hào)為CGMCCNO.3750。
所述的雜交瘤細(xì)胞系是通過(guò)雜交瘤技術(shù)以原核表達(dá)的重組可溶性蛋白P54作為免疫原建立的。
所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體。
所述的單克隆抗體純化后經(jīng)過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物的酶標(biāo)記物。
本發(fā)明的有益效果該發(fā)明所制備的雜交瘤細(xì)胞株ASFVP54Mab及其分泌的單克隆抗體能夠識(shí)別ASFV天然抗原，所獲得的單克隆抗體不僅在ASFV基礎(chǔ)研究，而且在ASFV抗原抗體免疫反應(yīng)的檢測(cè)試劑中均具有很高的應(yīng)用價(jià)值。



圖1為重組P54蛋白純化后SDS-PAGE圖。
圖2為重組P54蛋白純化后western blotting圖。
圖3為采用本發(fā)明的ELISA試劑盒檢測(cè)樣本非洲豬瘟抗體實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施例方式 抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC NO.3750，保藏日2010-04-22，分類命名雜交瘤細(xì)胞株。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一、建立細(xì)胞系 1.抗原制備 a)非洲豬瘟P54蛋白的表達(dá) 根據(jù)GenBank中非洲豬瘟(ASFV)P54基因序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物，采用PCR方法從ASFV DNA中擴(kuò)增出P54基因片段，將其克隆到表達(dá)載體pET28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-P54，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
設(shè)計(jì)的引物為 P54-1-5’-GCGGATCCCATTATTATCATCGTT-3’ P54-2-5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’ 下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)，P54-1為ASFV P54基因上游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點(diǎn)為BamHI；P54-2為ASFV P54基因下游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點(diǎn)為XhoI。
b)非洲豬瘟P54蛋白的純化。
誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用PBS洗滌重懸菌體，超聲裂解(超聲1s，間隔1s，共10min)，12000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白純化時(shí)使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)SDS-PAGE、western blotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性(見(jiàn)附圖1，2)。使用BCA法測(cè)定純化后蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值見(jiàn)表1。純化后P54蛋白的OD值為1.583，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為900μg/ml。
表1BCA法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量 2.抗原免疫 以純化的非洲豬瘟病毒P54蛋白為抗原，常規(guī)方法免疫6周齡BALB/c小鼠，首次基礎(chǔ)免疫皮下注射抗原200μg，使用完全弗氏佐劑；每隔3周進(jìn)行一次免疫，共三次，50μg/只/次，最后一次基礎(chǔ)免疫后3周后脾內(nèi)注射加強(qiáng)免疫，25μg/只，免疫完成。
3.雜交瘤細(xì)胞的制備 a)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 以BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。融合前1天，將小鼠拉頸處死，體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml RPMI 1640培養(yǎng)液至腹腔，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，1000r/min離心10分鐘，棄上清。用含20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml，置37℃，6％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
b)免疫脾細(xì)胞的制備 取免疫完成后的BALB/c小鼠，通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分鐘，無(wú)菌條件下取出脾臟，至于平皿中，RPMI 1640培養(yǎng)液清洗1次。將脾臟移入另一盛有10ml RPMI 1640培養(yǎng)液的平皿中，使脾細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)液。用吸管吹打數(shù)次。過(guò)濾，收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心10分鐘，用RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌2次，然后將細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)，用于細(xì)胞融合。
c)骨髓瘤細(xì)胞 于融合前48-36小時(shí)，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管。1000r/min離心10分鐘，棄去上清。加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。取骨髓瘤細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，用于細(xì)胞融合。
d)細(xì)胞融合及HAT選擇雜交瘤 將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1∶10比例混合，在50ml離心管內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗1次，1200r/min，離心10min，棄上清，用滴管小心吸出殘留液體。在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置40℃水浴中預(yù)熱。在45秒時(shí)加入預(yù)熱至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，作用90秒。加入20ml預(yù)熱至37℃的RPMI 1640培養(yǎng)液，室溫靜置10分鐘。1000r/min，離心5min，棄去上清。加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80ml。分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1ml，然后將培養(yǎng)板置37℃，6％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
24小時(shí)后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基，48小時(shí)后完全換液。兩周后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基，再維持兩周后，改用RPMI 1640培養(yǎng)液。
4.雜交瘤細(xì)胞的篩選 雜交瘤細(xì)胞融合兩周后，按照常規(guī)免疫酶技術(shù)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選。篩選出能分泌抗非洲豬瘟病毒抗體的雜交瘤孔。
5.雜交瘤的克隆化和凍存 a)雜交瘤細(xì)胞的克隆 克隆化方案為有限稀釋法，按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞克隆方法進(jìn)行，同法克隆進(jìn)行三次。
b)雜交瘤細(xì)胞的凍存 細(xì)胞凍存液50％小牛血清+40％RPMI 1640培養(yǎng)液+10％二甲基亞砜 將雜交瘤細(xì)胞離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為106-107/ml，轉(zhuǎn)移至凍存管中，每瓶1ml。置于-70℃冰箱中，次日轉(zhuǎn)入液氮中。
將制備抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC NO.3750，保藏日2010-04-22，分類命名雜交瘤細(xì)胞株。
二、單克隆抗體制備 本發(fā)明中，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方案為小鼠腹水法，步驟如下 本方案將上述獲得的雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，得到大量的腹水單抗。
具體方法為BALB/c小鼠腹腔接種液體石蠟，每只小鼠0.5ml。兩周后，腹腔接種用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/0.2ml。間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡時(shí)，處死小鼠，無(wú)菌條件下將腹水吸出。室溫靜止30min，1000r/min，離心10min，收集上清，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 三、單克隆抗體純化及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記 1.單克隆抗體的純化 上述獲得的腹水單抗的純化方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預(yù)處理過(guò)的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/LHCl調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了?，?0分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時(shí)，取出12000r/min離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過(guò)濾(125um)，加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調(diào)PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時(shí)；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS中，對(duì)50-100倍體積的PBS透析，4℃過(guò)夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?br> 2.單克隆抗體的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記 純化后的單克隆抗體的酶標(biāo)記物的制備方案為過(guò)碘酸鈉法，具體步驟如下 稱取5mg HRP溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對(duì)1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4℃過(guò)夜；向其中再加入20μl 0.2M pH9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸鹽緩沖液的單克隆抗體純品5mg(10mg/ml)，室溫避光輕柔攪拌2小時(shí)；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混勻，4℃放置2小時(shí)；所得產(chǎn)物對(duì)0.15M pH7.4PBS中4℃透析過(guò)夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。3000r/min離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M pH7.4的PBS緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。
四、標(biāo)準(zhǔn)ASFV陽(yáng)性血清及標(biāo)準(zhǔn)ASFV陰性血清的制備 在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，不同的操作人員和不同的檢測(cè)批次間會(huì)存在一定的誤差，操作誤差會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)樣品OD值的誤差。本發(fā)明研制了標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗體陽(yáng)性對(duì)照血清和標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗體陰性對(duì)照血清，用于檢測(cè)條件的優(yōu)化和檢測(cè)結(jié)果的判定。
a)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的制備 取健康成年家兔，體重2-3kg，剪去兩后腳掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮膚。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐劑(FCA)乳化的抗原(純化后重組P54)(以下稱FCA-P54)液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。間隔10-14天后，進(jìn)行第二次免疫，與兩側(cè)腘窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入弗式不完全佐劑(FIA-P54)，每個(gè)淋巴結(jié)0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近的皮下共1ml。間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5-1.0ml，分離血清，采用ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)，抗體效價(jià)可達(dá)到1∶100以上。
采用心臟采血法采血，將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中。將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱3小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后，用滴管吸取血清，3000r/min離心15min，取上清，加入終濃度為0.01％的硫柳汞防腐，分裝后，-20℃保存。
b)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備 取經(jīng)檢驗(yàn)合格的SPF兔，心臟采血，分離血清，加入萬(wàn)分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分裝于無(wú)菌管中，-20℃保存。
五、試劑盒的建立 a)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理 采用競(jìng)爭(zhēng)法，將重組的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白P54包被于微孔板中，然后用1％BSA將酶標(biāo)板封閉，加入待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的非洲豬瘟病毒抗體能與酶標(biāo)板中包被的P54抗原反應(yīng)，加入針對(duì)P54的酶標(biāo)單克隆抗體后參與結(jié)合表位的競(jìng)爭(zhēng)。隨后，加入辣根過(guò)氧化物酶底物TMB顯色，終止液終止反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值，OD值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測(cè)樣本中非洲豬瘟病毒抗體的含量成反比。
b)本發(fā)明試劑盒的組成 a)酶標(biāo)板的最佳制備方法 用pH9.60.05M的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組P54蛋白稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的P54含量為0.2ug。4℃包被過(guò)夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封閉液，37℃靜置2小時(shí)，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置 洗滌液(pH 7.4，0.15M PBS)KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲(chǔ)液。
血清稀釋液牛血清白蛋白0.1g，加洗滌緩沖液至100ml 底物緩沖液(pH 5.0磷酸檸檬酸)0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB(10mg/5ml無(wú)水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％H2O2 32ul 終止液(2M H2SO4)蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml c)檢測(cè)非洲豬瘟的競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的組建 組建檢測(cè)非洲豬瘟的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含以下組分 96孔酶標(biāo)板 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單抗 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照 濃縮洗滌液 血清稀釋液 TMB底物 終止液 產(chǎn)品說(shuō)明書 六、樣品中非洲豬瘟病毒抗體的檢測(cè) a)用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測(cè) 1)將待測(cè)血清、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標(biāo)單克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。(實(shí)驗(yàn)圖見(jiàn)附圖3) b)檢測(cè)結(jié)果分析 i.測(cè)中陰性對(duì)照血清(NC)的OD值至少是陽(yáng)性對(duì)照血清(PC)的4倍時(shí)，檢測(cè)被認(rèn)為有效。(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2) 表2采用本發(fā)明的ELISA試劑盒檢測(cè)樣本非洲豬瘟抗體數(shù)據(jù) NC/PC≥4 陽(yáng)性Cut Off＝NC-[(NC-PC)×0.5] 陰性Cut Off＝NC-[(NC-PC)×0.4] 其中NC＝陰性對(duì)照血清OD值 PC＝陽(yáng)性對(duì)照血清OD值 對(duì)表2中數(shù)據(jù)計(jì)算，得出陽(yáng)性Cut Off為0.800，陰性Cut Off為0.930。
ii.檢測(cè)時(shí)使用復(fù)孔，最終使用OD值為兩個(gè)的平均值。
當(dāng)血清樣本的OD值低于陽(yáng)性Cut Off值時(shí)，該樣本為ASFV抗體陽(yáng)性。
當(dāng)血清樣本的OD值高于陰性Cut Off值是，該樣本為ASFV抗體陰性。
當(dāng)血清樣本的OD值在兩個(gè)Cut Off值之間時(shí)，被認(rèn)為可疑，對(duì)于該樣本應(yīng)重新測(cè)試，或者采用其他檢測(cè)方法確認(rèn)。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系的保藏號(hào)為CGMCC NO.3750。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述的雜交瘤細(xì)胞系是通過(guò)雜交瘤技術(shù)以原核表達(dá)的重組可溶性蛋白P54作為免疫原建立的。
3.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體純化后經(jīng)過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物的酶標(biāo)記物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白P54單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系及其單克隆抗體的建立方法和應(yīng)用，其主要技術(shù)特征為以原核表達(dá)制備重組的P54可溶性抗原，免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)經(jīng)融合、篩選、克隆，獲得能穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒P54蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明也公開(kāi)了用該細(xì)胞系制備單克隆抗體、抗體提純方法及該抗體的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記法。該單克隆抗體可用于豬血清中非洲豬瘟病毒抗體的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K16/08GK101818129SQ20101015406
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者董志珍, 肖妍, 趙祥平, 侯艷梅, 王濤, 張瑞, 張立懷 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心