一種b區(qū)部分缺失型重組人凝血因子ⅷ的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。通過對全長凝血因子VID (coagulation factor VH，F(xiàn) VH )的改造，得到了 B區(qū)部分缺失型的基因重組人凝血因子VH (recombinant human F VDI，rhF VID)。實驗證明，通過與B區(qū)完全缺失型的rhF VID進行比較，該B區(qū)部分缺失 型產(chǎn)品具有結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的特性，有望被開發(fā)成為治療甲型血友病的一種新型rhF VDI產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002] 血友?。℉emophilia)，是由于血液中缺少某些凝血因子而導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴重凝 血障礙的遺傳性出血性疾病。該病分為四種類型：甲型、乙型、丙型及后來發(fā)現(xiàn)的vWF因子 (vonwillibrandfactor)缺乏的血管性假血友病。其中甲型血友病又稱凝血因子VDI缺乏 癥，發(fā)病率為80%，其首選治療藥物為F VIL
[0003] (一）F VID的分子結(jié)構(gòu)。
[0004] F VID mRNA長9kb，編碼一條由2351個氨基酸組成的前體多肽.去除N端19個殘 基的信號肽后，成熟蛋白質(zhì)由2332個氨基酸組成，分子量為280kDa。F VID蛋白含有3個結(jié) 構(gòu)區(qū)：
[0005] A區(qū)：由3個片段組成，在F VDI氨基末端出現(xiàn)2次，在羧基末端出現(xiàn)1次，每個A區(qū) 均含有約330個氨基酸；
[0006] B區(qū)：為含有908個氨基酸的中間片段，在凝血激活過程中無需B區(qū)的活化；
[0007] C區(qū)：2個片段，在F VDI的羧端部分出現(xiàn)2次，每一 C結(jié)構(gòu)域含有約150個氨基酸。
[0008] 3個區(qū)的排列順序為A1-A2-B-A3-C1-C2, F VID蛋白由兩條肽鏈組成，A1-A2-B或 A1-A2組成重鏈，分子量為90~200kDa不等；A3-C1-C2組成輕鏈，分子量為80kDa。
[0009] (二）F VID的生產(chǎn)技術(shù)。
[0010] F VDI的生產(chǎn)技術(shù)目前有兩種：血漿提純以及基因工程方法制備。
[0011] 1.血源性凝血因子VIL
[0012] 血漿提純的產(chǎn)品存在血漿制品帶來的感染嚴重致病微生物的可能性、危險性。
[0013] 目前我國生產(chǎn)的均為血楽提純的血源性F VH (plasma-derived F VH，pd F VH )，而 由于受到原料血漿供應(yīng)的限制和血漿提純技術(shù)的限制，國內(nèi)F VID年產(chǎn)僅約6000~7000萬 單位，導(dǎo)致國內(nèi)F VDI供應(yīng)持續(xù)緊張，連搶救用藥都無法滿足。
[0014] 2.基因重組人凝血因子VIL
[0015] 基因工程方法制備的rhF VDI從培養(yǎng)的真核細胞（中國倉鼠卵巢細胞）中表達，是 無菌、穩(wěn)定、高純度的生物制品，其效果與PdF VDI相同，且無血源污染的危險，目前在西方國 家應(yīng)用越來越廣泛。
[0016] 目前已上市的rhFW分為全長野生型以及B區(qū)缺失型兩類。全長野生型產(chǎn)品分子 較大，分子量為280kDa，表達率低，在特異活性及使用成本等方面均不能滿足人們的需要； 進一步研究發(fā)現(xiàn)，B區(qū)的缺失對F VDI的體內(nèi)外活性均無影響，且B區(qū)缺失型rhF VDI的的分 子量為170kDa，其表達水平較全長型高5-10倍，穩(wěn)定性亦顯著提高，極大降低了制備難度 和成本。目前我國已進口的rh F VDI有三個產(chǎn)品：拜科奇一Kogenate FS(Bayer)、百因止一 Advate (Baxter公司）以及任捷一Xyntha (Wyeth)，其中Xyntha為B區(qū)完全缺失型rhF VIL
[0017] 本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，B區(qū)完全缺失型rhF VDI產(chǎn)品在超過100倍稀釋時，會出現(xiàn) 活性降低，活性約損失30 %，收率只有50 %~70 %，而全長rh F VDI產(chǎn)品的稀釋過程不存在 此問題?？紤]B區(qū)可能在增強rh FW產(chǎn)品水溶液的穩(wěn)定性方面有一定作用，我們在研究中， 經(jīng)過篩選保留B區(qū)的部分氨基酸得到一種新型的B區(qū)部分缺失型rh F VIfl，結(jié)果顯示，本品的 目的蛋白表達率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及水溶液中稀釋穩(wěn)定性均有明顯提高，能進一步降低制備 rhF VID的難度，提高收率，降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明涉及一種重組人凝血因子VID的制備。
[0019] 從已知高表達人F VID (hF VID )的人胎兒肝臟cDNA Lambda噬菌體文庫中擴增hF VID 基因，并以此作為模板，以其特異引物進行PCR擴增獲得全長的hF VDI的基因片段；通過引物 設(shè)計和PCR的方法，獲得B區(qū)完全缺失的rh F VIfl目的基因和B區(qū)部分缺失的rh F VIfl目的基 因。
[0020] 以上目的基因與pMSG載體分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切后進行連接， 從而獲得重組質(zhì)粒PMSG-BDDhFVIII。
[0021 ] 將該重組質(zhì)粒與pDCHIP表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，經(jīng)過條件培養(yǎng)基篩選獲得 rhF VDI高表達細胞株，然后在5L細胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)7天，經(jīng)過離心，采用一步抗體親和層 析、以及離子交換層析的方法最終獲得純度大于98%的目的蛋白。
[0022] 經(jīng)測試，本發(fā)明的B區(qū)部分缺失型rhF VID的生物學(xué)活性同B區(qū)完全缺失型rhF VID 基本一致，并且稀釋穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性有了明顯提高。
【附圖說明】
[0023] 圖1是B區(qū)完全缺失的rhF VID引物設(shè)計圖；
[0024] 圖2是B區(qū)部分缺失的rhF VID引物設(shè)計圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下實例僅是對本發(fā)明的說明，而不會對本發(fā)明產(chǎn)生任何限制。
[0026](一）生產(chǎn)細胞株的獲得和培養(yǎng)。
[0027] I. CH0-DG44 細胞。
[0028] 中國倉鼠細胞-二氫葉酸還原酶（dhfr)缺陷性突變體DG44與二十世紀八十年代 早期使用的DXBll突變細胞系類似。該細胞的生長需要次黃嘌呤（或腺嘌呤）、甘氨酸和 胸腺嘧啶，而且與所有CHO細胞一樣，它們生長也需要脯氨酸。它的優(yōu)點在于不含有內(nèi)源性 dhfr序列，可被dhfr基因轉(zhuǎn)化，便于陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。轉(zhuǎn)化了 dhfr基因的細胞株，通常 會用不含核苷酸和脫氧核苷酸的-MEM培養(yǎng)基篩選出dhfr陽性轉(zhuǎn)化子。由于DG44是雙缺 失突變體，其中不含有倉鼠的dhfr基因，因而該細胞被導(dǎo)入dhfr基因時不存在背景干擾。 其培養(yǎng)方法如下。
[0029] CH0-DG44細胞使用含有10% cFBS的a -MEM培養(yǎng)基（含核苷酸和脫氧核苷酸） 接種于6-孔板中培養(yǎng)，細胞密度達到2 X 106/孔后，再按照3 X 105/孔的細胞密度進行傳 代培養(yǎng)。
[0030] 2. B區(qū)完全缺失型重組人凝血因子VID表達質(zhì)粒構(gòu)建。
[0031] 本項目采用pMSG載體作為重組人凝血因子VDI的表達載體。通過三次PCR獲得 B區(qū)缺失的人凝血因子VID基因片段。采用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI分別將B區(qū)缺失的 hF VID cDNA片段與pMSG真核表達載體進行雙酶切，T4連接酶將其連接后，轉(zhuǎn)化至克隆菌株 JM109中，再對經(jīng)篩選的單克隆重組質(zhì)粒進行目的基因測序，目的基因測序結(jié)果與理論序列 一致，完成B區(qū)缺失型pMSG-hF VID重組真核表達載體的構(gòu)建。具體構(gòu)建方法如下。
[0032] B區(qū)缺失的hF VID目的基因獲得。
[0033] 2. I. 1引物設(shè)計。
[0034] 1)首先在全長的hF VDI cDNA兩端設(shè)計兩條引物primer-Ι和primer-2 ;然后分別 在重鏈兩端設(shè)計了兩條引物primer-3 (含有NheI酶切位點）和primer-4,在輕鏈的兩端設(shè) 計了兩條引物primer-5和primer-6 (含有XhoI酶切位點）；primer_4和primer-5基因設(shè) 計重疊區(qū)域。具體位置如圖1所示。
[0035] 2)為了提高外源基因的表達量，在基因起始密碼子前面，即引物3的序列上設(shè)置 了 Kozak 序列（GCCACC)。
[0036] 3)所用到的引物序列如下：
[0037] primer-Ι :5' -ATG CAA ATA GAG CTC TCC ACC-3'，
[0038] primer-2 :5' -TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'
[0039] primer-3 :5' -CTA GCT AGC CAC CAT GCA AAT AGA GCT CTC CAC C-3'（劃線部分為 NheI酶切位點，粗體部分為Kozak序列）
[0040] primer-4 :5' -GGC GTT TCA AGA CTG GTG GAT TCT GGG AGA AGC-3'
[0041] primer-5 :5' -CCA TTG AAC CAA GAA GCT TCT CCC AGA AT-3'
[0042] primer-6 :5' -CCG CTC GAG TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'（劃線部分為 XhoI 酶切 位點）。
[0043] 2. I. 2PCR 擴增 B 區(qū)缺失的 hF VID cDNA。
[0044] (1)第一次 PCR。
[0045] 利用Wizard勢Lambda Preps DNA純化試劑盒提取Lambda嗤菌體DNA。以提取的 Lambda嗤菌體DNA作為模板，以primer-Ι和primer-2為引物，米用PfuTufbo1? DNA聚合酶， 進行第一次PCR反應(yīng)，擴增條件為