專利名稱：冷凍干燥的不含白蛋白的重組人第Ⅷ凝血因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于用作血友病A的治療劑的、冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子混合物，更詳細(xì)地說，是關(guān)于作為使冷凍干燥時(shí)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)即重組人第VIII凝血因子穩(wěn)定化的穩(wěn)定劑，使用沒有病毒感染危險(xiǎn)的氨基酸來代替來自人血液的白蛋白，以穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子冷凍干燥組成成分。
背景技術(shù)：
血友病是一種因先天性凝血障礙而無法進(jìn)行止血的遺傳性疾病，被認(rèn)為是由于缺乏在人血漿中正常存在的蛋白質(zhì)之一的生物學(xué)活性凝血因子而引起。
血友病是一種隱性的伴性遺傳病，因而在女性的情況下即使帶有血友病遺傳因子也不會(huì)發(fā)病，發(fā)病只限于男性，根據(jù)其所缺乏的凝血因子的種類，血友病可分為血友病A、血友病B、血友病AB、血友病C等。
血友病A是因缺乏人體內(nèi)的第VIII凝血因子(抗血友病因子)而所致，在2萬人中發(fā)病率約為1人或2人。血友病B是因缺乏人體內(nèi)的第IX凝血因子(克里斯馬斯因子)而所致，在10萬人中發(fā)病率約為1人。血友病AB是因缺乏重組人體內(nèi)的第VIII或第IX凝血因子而所致。還有，血友病C是因缺乏人體內(nèi)的第XI凝血因子而所致。
大約30年來，血友病A的治療劑一直是從人的血漿中分離第VIII凝血因子后再進(jìn)行精制、濃縮而獲得的，正是由于這種治療劑才能夠使血友病患者們維持著生命。
然而，用作以往血友病治療劑的來自人血的第VIII凝血因子，由于是從人的血漿中提取，因此具有被肝炎或HIV、TTVirus等各種經(jīng)血液傳遞的病毒所感染的問題。為了克服這類問題，如在文獻(xiàn)J.Gitschier et al.，Nature 312，330-37，1984和EP160457中所報(bào)道那樣，目前通常使用從利用了重組DNA技術(shù)的重組動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中分離、精制而制備重組人第VIII凝血因子的方法。
重組人第VIII凝血因子產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及其生物化學(xué)反應(yīng)記載在文獻(xiàn)Kaufman Tibtech，Vol 9，1991 and Hematology，63，155-65，1991中。
從人血漿中分離得到的人第VIII凝血因子濃縮物中包括多個(gè)被片段化的活性穩(wěn)定的第VIII凝血因子形態(tài)參考文獻(xiàn)Andersson etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol 83，2979-83.May 1986。最小活性形態(tài)的分子量為170kDa，它是90kDa和80kDa的兩個(gè)鏈通過金屬離子交聯(lián)而構(gòu)成參照EP 197901。Kabi Pharmacia公司開發(fā)出了從來自人血的第VIII凝血因子濃縮物中去除相當(dāng)于170kDa分子量大小的B-domain部分后獲得的重組人第VIII凝血因子產(chǎn)物。被切斷的重組人第VIII凝血因子被命名為r-VIIISQ，它是通過在無血清的培養(yǎng)基中利用Chinese Hamster ovary(CHO)細(xì)胞株用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)。r-VIII SQ的結(jié)構(gòu)以及生物化學(xué)反應(yīng)被記載于WO 91/09122號中。
像重組人第VIII凝血因子這樣的蛋白質(zhì)的情況下，為了保存、儲(chǔ)藏和處理而制成冷凍干燥形態(tài)后市售，在向患者給藥時(shí)，是以再用合適的溶劑再溶解(reconstitution)后向患者注射的方式給藥。但是，像冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子這種蛋白質(zhì)的情況下，在精制、滅菌、冷凍干燥、包裝和再溶解后給藥的期間，存在蛋白質(zhì)的活性大幅度下降的問題以及干燥后塊狀外觀(cake appearance)不良的問題，因此以往是添加來自人血液的白蛋白來作為重組人第VIII凝血因子冷凍干燥時(shí)的穩(wěn)定劑以穩(wěn)定重組人第VIII凝血因子。來自人血液的白蛋白起到精制、滅菌以及冷凍干燥時(shí)的一般穩(wěn)定劑的作用參照Wang et al.，J.of Parenteral Sci.and Tech.Vol 42，Number2S，Supplement.1988。來自人血液的白蛋白也是一種冷凍干燥用劑型中的良好的塊狀(cake)成形劑。為了穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子而使用白蛋白是公知的，并且正被使用于目前市售的所有高純度的重組人第VIII凝血因子部分產(chǎn)品中。但是，來自人血液的白蛋白是從人血漿中分離得到，因此如上所述要面臨被肝炎、HIV、TTVirus等來自血液的病毒所感染的問題，因此不適合作為利用重組DNA技術(shù)制得的血友病治療劑。并且，在對最終產(chǎn)品進(jìn)行異化學(xué)檢驗(yàn)時(shí)，會(huì)發(fā)生因相對于少量的主藥效成分過量存在的白蛋白所引起的干擾現(xiàn)象，因此難以進(jìn)行嚴(yán)格的品質(zhì)管理。
因此，需要一種在干燥或冷凍干燥期間在溶液中穩(wěn)定以及作為冷凍干燥之后再溶解之后的溶液穩(wěn)定的、不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子劑型。
為了使重組人第VIII凝血因子穩(wěn)定化，提出了各種方案。
US 5,763,401(EP 818204，Bayer)，提出了使用15～60mM蔗糖作為穩(wěn)定化劑來穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子的方法。
US 5,733,873(EP627924，Pharmacia & Upjohn)，提出了使用0.01～1mg/ml的非離子性表面活性劑(聚三梨糖醇酯20或80)作為穩(wěn)定化劑來穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子的方法。
US 4,877,608(EP315 968，Rhone-Poulenc Rorer)，提出了利用0.5～15mM NaCl、CaCl2以及0.01～10mM的鹽酸賴氨酸來穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子的方法(添加了麥芽糖、蔗糖、甘露糖等糖)。
US 5,605,884(EP 314 095，Rhone-Poulenc Rorer)，提出了利用高濃度離子即0.35～1.2M NaCl、1.5～40mM CaCl2來穩(wěn)定化重組人第VIII凝血因子的方法(添加了麥芽糖、蔗糖、甘露糖等糖)。
WO 96/22107(Quadrant Holings Cambrige Limited)，提出了使用海藻糖作為穩(wěn)定劑。
WO 89/09614(Genentech)中記載了包括甘氨酸、甘露醇和緩沖劑的人生長激素的穩(wěn)定化劑型，在優(yōu)選實(shí)施例中還添加了聚三梨糖醇酯80等非離子性表面活性劑。非離子性表面活性劑是為了被還原的凝聚和變性而添加。冷凍干燥過程和再溶解后的劑型的穩(wěn)定性提高。
在EP 268 110(Cetus)中記載了包含特定蛋白質(zhì)例如白細(xì)胞間介素-2的溶液，所述特定蛋白質(zhì)溶解在作為溶解劑/穩(wěn)定劑而包含非離子性聚合物澄清劑的惰性載體培養(yǎng)基中。優(yōu)選的澄清劑有辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇一硬脂酸酯和聚失水山梨糖醇脂肪酸亞乙酯。
在US 4,783,441(Hoechst)中記載了包含蛋白質(zhì)例如胰島素以及表面活性物質(zhì)的水溶液。
在US 4,165,370(Coval)中記載了γ球蛋白溶液及其制造方法。溶液中含有聚乙二醇(PEG)?？梢詫⒎请x子性表面活性劑添加到溶液中。
EP 77 870(Japan Green Cross)中，提出了為了改善含有重組人第VIII凝血因子的溶液的穩(wěn)定性而添加氨基酸、單糖類、低聚糖或糖醇或烴羧酸的技術(shù)，在EP 117064號中記載了為了提高熱處理期間的穩(wěn)定性而在重組人第VIII凝血因子的水溶液中添加糖醇或二糖的技術(shù)。
在WO 91/10439(Octopharma)中提出了包含二糖類優(yōu)選是蔗糖和1種以上氨基酸的第VIII凝血因子或第IX凝血因子的穩(wěn)定的注射用溶液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，解決可能由一直以來作為人第VIII凝血因子的穩(wěn)定劑來使用的來自人血液的白蛋白而發(fā)生的病毒感染的問題，同時(shí)提供與上述含白蛋白的產(chǎn)品相比藥效上沒有差別的新型的不含白蛋白的冷凍干燥重組人第VIII凝血因子制劑。
本發(fā)明的不含白蛋白的冷凍干燥重組人第VIII凝血因子劑型是使用精氨酸、異亮氨酸和谷氨酸的混合物作為穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑與以往的含有白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑相比，在塊狀外觀以及再溶解后的活性、再溶解后的澄清度方面具有大致同樣的效果。
本發(fā)明提供即使不含白蛋白穩(wěn)定性也高的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑。
本發(fā)明者們?yōu)榱藢ふ夷軌蛱娲鷣碜匀搜旱陌椎鞍椎睦鋬龈稍镏亟M人第VIII凝血因子時(shí)的穩(wěn)定劑，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了在按照特定的比率來添加特定氨基酸進(jìn)行冷凍干燥的情況下，即使在冷凍干燥之后其活性、塊狀外觀和澄清度優(yōu)異。
下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的重組人第VIII凝血因子原液是指，利用親和層析和離子交換層析對含有重組人第VIII凝血因子的溶液進(jìn)行精制而得到的溶液，所述含有重組人第VIII凝血因子的溶液是培養(yǎng)利用重組DNA技術(shù)制備的動(dòng)物細(xì)胞來得到的。
另外，重組人第VIII凝血因子最終原液是指，在重組人第VIII凝血因子原液中添加堿性緩沖劑(Basic Buffer)和穩(wěn)定劑進(jìn)行稀釋后得到的冷凍干燥之前的溶液。
本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，作為穩(wěn)定劑含有精氨酸(L-Arginine)、異亮氨酸(L-Isoleucine)、谷氨酸(L-Glutamic Acid)。
冷凍干燥之前上述精氨酸的濃度優(yōu)選為6～100mM，更優(yōu)選為6～42mM。
冷凍干燥之前上述異亮氨酸的濃度優(yōu)選為3.5～50mM，更優(yōu)選為7～35mM。
冷凍干燥之前上述谷氨酸的濃度優(yōu)選為10～100mM，更優(yōu)選為10～70mM。
另外，作為本發(fā)明的重組人第VIII凝血因子最終原液的堿性緩沖劑可以是由適當(dāng)量的組氨酸、NaCl和CaCl2的混合物來構(gòu)成。
上述組氨酸、NaCl和CaCl2被作為人體蛋白質(zhì)的緩沖劑來廣泛使用的是大家所公知的。


圖1是表示本發(fā)明的重組人第VIII凝血因子制劑的冷凍干燥過程的圖。
圖2是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，以及含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑進(jìn)行比較的照片。
圖3是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，以及含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑的活性(activity)進(jìn)行比較的圖表。
圖4是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，以及含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑的塊狀外觀(cake appearance)進(jìn)行比較的圖表。
圖5是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑，以及含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑的澄清度(clarity)進(jìn)行比較的圖表。
具體實(shí)施例方式
下面，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本實(shí)施例僅僅是優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明并不限定于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1為了尋找替代以往的來自人血液的白蛋白使重組人第VIII凝血因子穩(wěn)定化的物質(zhì)，作為穩(wěn)定劑使用卵磷脂(磷脂酰膽堿)、蔗糖、甘氨酸、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和氨基酸(精氨酸、異亮氨酸、谷氨酸)而制備了各重組人第VIII凝血因子的冷凍干燥用最終原液混合物，并且為了確認(rèn)冷凍干燥后的活性，對于所制得的各冷凍干燥后的重組人第VIII凝血因子混合物測定了其活性(activity)、塊狀外觀(cake apperance)、和澄清度(clarity)。
所使用的材料和儀器如下。
-L-精氨酸(M.W.210.7 Sigma)-L-異亮氨酸(M.W.131.2 Sigma)-L-谷氨酸(M.W.169.1 Sigma)-L-一鹽酸組氨酸(M.W.209.63 Fluka)-蔗糖(M.W.342.3 Sigma)-Tween 80(Sigma)-PEG 3350(M.W.3350 Carbowax)-人血清白蛋白(20％ KGC)-甘氨酸(M.W 75.07 Sigma)-PVP(K30)(M.W.4000，F(xiàn)luka)-磷脂酰膽堿(卵磷脂 Doosan)-FVIII顯色分析試劑盒(Coamatic kit，Chromogenix)-96well培養(yǎng)箱(Sanofi-BMS)-ELISA讀數(shù)器(Magellan)-凝血計(jì)-FVIII deficient plasma(DADE BEHRING)-肌動(dòng)蛋白(DADE BEHRING)-CaCl2(DADE BEHRING)
-CA緩沖劑(巴比妥鹽，DADE BEHRING)-冷凍干燥機(jī)VIRTIS-GENESIS 25XL-濁度計(jì)2400(HACH)重組人第VIII凝血因子的精制利用親和層析和1次和2次離子交換層析精制含重組人第VIII凝血因子的培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液是培養(yǎng)利用重組DNA技術(shù)制得的動(dòng)物細(xì)胞而獲得的。并且將該精制得到的溶液稱為重組人第VIII凝血因子原液。
不同組成的含穩(wěn)定劑的重組人第VIII凝血因子制劑的制備按照以下表1制備不同組成的堿性緩沖劑和穩(wěn)定劑，將精制得到的重組人第VIII凝血因子原液與上述堿性緩沖劑和穩(wěn)定劑混合進(jìn)行稀釋，制造重組人第VIII凝血因子最終原液(第VIII凝血因子濃度50～125IU/ml)，然后向10ml用VIAL分別注入該最終原液4ml，使最終達(dá)到200～500IU/Vial，進(jìn)行了冷凍干燥。
表1


冷凍干燥向精制得到的重組人第VIII凝血因子原液混合上述堿性緩沖劑和穩(wěn)定劑而得最終原液混合物后，分別裝入在VlAL，加入到冷凍干燥機(jī)(VIRTIS-GENESIS 25XL)中，然后如圖1所示急劇冷卻到-45℃，維持6小時(shí)，然后轉(zhuǎn)換為真空狀態(tài)并維持6小時(shí)，接著以0.2℃/min的速度用2小時(shí)緩慢升溫到-20℃(第1次加溫)，在-20℃維持80小時(shí)平衡。接著，以0.1℃/min的速度用7小時(shí)緩慢升溫至25℃(第二次加溫)，在25℃維持平衡3小時(shí)，以0.1℃/min的速度再次升溫至33℃，然后在33℃維持溫度平衡20小時(shí)，完成了冷凍干燥。
冷凍干燥結(jié)束之后，分別在2～8℃的冷藏室中保管各產(chǎn)品，必要時(shí)同時(shí)測定了活性、塊狀外觀和澄清度。
效果的確認(rèn)對于按照上述方法制備的重組人第VIII凝血因子制劑測定了其塊狀外觀、再溶解后的澄清度和再溶解后的活性，并將結(jié)果示于以下表2中。
表2

塊狀外觀是用肉眼進(jìn)行了比較；澄清度是利用濁度計(jì)2400(HACH)進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)；活性是用層析分析和凝固分析(APTT)進(jìn)行了比較試驗(yàn)，并以使用來自人血液的白蛋白的情況作為基準(zhǔn)評價(jià)了相對值，也就是說，將含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)1)的塊狀外觀、澄清度和活性分別作為100％來進(jìn)行了評價(jià)。冷凍干燥之前的活性為107IU/ml。
由上述表2可以看出，把作為穩(wěn)定劑添加來自人血液的白蛋白并進(jìn)行冷凍干燥而獲得的重組人第VIII凝血因子制劑的塊狀外觀、澄清度、和活性看作為100％時(shí)，可以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)2的含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子混合物，其澄清度優(yōu)良，但其塊狀外觀和活性不太好。另一方面，使用了本發(fā)明的穩(wěn)定劑精氨酸、異亮氨酸和谷氨酸的情況下，可以確認(rèn)塊狀外觀、澄清度和活性均優(yōu)良(實(shí)驗(yàn)13、14)。
使用卵磷脂作為穩(wěn)定劑的情況下，在活性方面獲得了優(yōu)良的效果，但可以確認(rèn)再溶解之后的澄清度不好。并且，使用蔗糖和甘氨酸作為穩(wěn)定劑的情況下雖然在活性方面上顯示了較好的效果，但可以確認(rèn)塊狀外觀不良。在使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作為穩(wěn)定劑的情況下雖然在塊狀外觀上較好，但可以確認(rèn)活性不良。
圖2是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)16)與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)1)和含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)2)進(jìn)行比較的照片。
圖3是將本發(fā)明的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑與含白蛋白的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)1)和含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑(實(shí)驗(yàn)2)的活性進(jìn)行比較的圖表。具體分析為如下將含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均活性作為100％基準(zhǔn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)2的含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子混合物的平均活性為80±5％，作為本發(fā)明組成的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均活性為90±5％，效果優(yōu)良。
圖4是比較了冷凍干燥之后塊狀外觀的圖表。具體分析為如下將含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均塊狀外觀作為100％基準(zhǔn)時(shí)，含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子混合物的平均塊狀外觀為80％，作為本發(fā)明組成的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均塊狀外觀為100％，效果優(yōu)良。
圖5是比較澄清度的圖表。具體分析為如下將含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均澄清度作為100％基準(zhǔn)時(shí)，含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子混合物的平均澄清度為100％，作為本發(fā)明組成的不含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的平均塊狀外觀為100％，效果沒有差別。
實(shí)施例2為了尋找如在上述實(shí)施例1中所示的那樣，作為能夠取代白蛋白穩(wěn)定劑而顯示出最佳條件的氨基酸(精氨酸、異亮氨酸、谷氨酸)重組人第Ⅷ凝血因子混合物其冷凍干燥之后塊狀外觀的最佳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于以下表3中。
表3

如上表3所示，與對照樣品(含白蛋白)相比，在精氨酸12～36mM、異亮氨酸4～18mM、谷氨酸19～57mM的條件下顯示了最佳的塊狀外觀。
實(shí)施例3參照上表3的結(jié)果，在3種氨基酸中將2種氨基酸的濃度恒定在形成塊狀外觀的最小濃度(精氨酸12mM、異亮氨酸3.5mM、谷氨酸19mM)，并且為了按照精氨酸、異亮氨酸、谷氨酸的各個(gè)濃度調(diào)查活性的變化，改變一種氨基酸的濃度，如上實(shí)施例1那樣進(jìn)行冷凍干燥而制得重組人第VIII凝血因子混合物，并且根據(jù)層析分析和凝固分析將活性表示為相對于含白蛋白的重組人第VIII凝血因子混合物的％進(jìn)行了分析。
將異亮氨酸和谷氨酸濃度分別恒定在冷凍干燥之后形成完整的塊狀外觀的最小濃度3.5mM和19mM，并在6～100mM的范圍內(nèi)僅改變精氨酸的濃度，評價(jià)了其活性，并將結(jié)果示于下表4中。冷凍干燥之前的活性為107IU/ml。
表4異亮氨酸濃度恒定為3.5mM且谷氨酸濃度恒定為19mM時(shí)

如表4中所示，在6～100mM的精氨酸濃度范圍內(nèi)顯示了較好的活性。特別是在12～48mM范圍內(nèi)顯示了含白蛋白的重組人第VIII凝血因子活性的80％以上活性，隨著精氨酸濃度的增加活性也隨之上升，達(dá)到了最佳活性(90％)。
將精氨酸濃度恒定在顯示出最佳活性的36mM，將異亮氨酸濃度恒定在3.5mM后，在10～100mM范圍內(nèi)僅改變谷氨酸濃度，評價(jià)了其活性，并將其結(jié)果表示于下表5中。冷凍干燥之前的活性為107IU/ml。
表5精氨酸濃度恒定為36mM且異亮氨酸濃度恒定為3.5mM時(shí)

如表5中所示，在10～100mM的谷氨酸濃度范圍內(nèi)顯示了較好的活性。特別是在29～76mM范圍內(nèi)顯示了較好的活性(80％以上)活性，隨著谷氨酸濃度的增加活性也隨之上升，在57mM時(shí)顯示了最佳活性。
將精氨酸和谷氨酸濃度分別恒定在顯示出最佳活性的36mM和57mM后，在0～50mM的范圍內(nèi)僅改變異亮氨酸的濃度，評價(jià)了其活性，并將結(jié)果示于下表6中。冷凍干燥之前的活性為107IU/ml。
表6精氨酸恒定為36mM且谷氨酸恒定為57mM時(shí)

如表6中所示，在0～50mM的異亮酸濃度范圍內(nèi)顯示了較好的活性。特別是在0～18mM范圍內(nèi)顯示了較好的活性，在異亮酸濃度為7mM時(shí)顯示了最佳活性。
通過實(shí)驗(yàn)調(diào)查在冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑中顯示出最佳條件的白蛋白替代物氨基酸穩(wěn)定劑的最佳活性維持條件的結(jié)果，在精氨酸36mM、異亮氨酸7mM、谷氨酸57mM時(shí)相對于對照樣品(含白蛋白)顯示了最佳的活性維持條件。
本發(fā)明的重組人第VIII凝血因子制劑通過不使用以往的有病毒感染危險(xiǎn)的白蛋白而使用特定的氨基酸，不會(huì)發(fā)生病毒感染并且在人體內(nèi)產(chǎn)生副作用的幾率減少，同時(shí)在其活性、塊狀外觀、澄清度方面顯示了與白蛋白近似的效果。并且，與含非離子性表面活性劑的重組人第VIII凝血因子制劑相比，其活性和塊狀外觀上顯示出更優(yōu)異的效果。
權(quán)利要求
1.一種冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其中作為用作血友病治療劑的重組人第VIII凝血因子的穩(wěn)定化劑，包含精氨酸、異亮氨酸和谷氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述精氨酸的濃度為6～100mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述精氨酸的濃度為6～42mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述異亮氨酸的濃度為3.5～50mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述異亮氨酸的濃度為7～35mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述谷氨酸的濃度為10～100mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述谷氨酸的濃度為10～70mM。
8.一種冷凍干燥的重組人第VIII凝血因子制劑，其特征在于，冷凍干燥之前上述精氨酸的濃度為6～42mM，上述異亮氨酸的濃度為7～35mM，上述谷氨酸的濃度為10～70mM。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于用作血友病治療劑的重組人第VIII凝血因子冷凍干燥制劑，作為使冷凍干燥時(shí)活性不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)即重組人第VIII凝血因子穩(wěn)定化的穩(wěn)定劑，使用6～100mM精氨酸(L－Arginine)、3.5～50mM異亮氨酸(L－Isoleucine)、10～100mM谷氨酸(L－Glutamic acid)的混合物來代替來自人血液的白蛋白。
文檔編號C07K14/755GK1712067SQ20041008690
公開日2005年12月28日 申請日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者白相勛, 辛龍男, 金振晚, 許在旭, 李正湜, 權(quán)起圣, 千知玄 申請人:株式會(huì)社綠十字