專利名稱：Toll樣受體14(TLR14)及其用途的制作方法
Toll樣受體14 (TLR14)及其用途
背景技術(shù)：
Toll樣受體(Toll-like receptor)/白介素-1受體(TLR)超家族在炎癥和宿 主對(duì)細(xì)菌感染的應(yīng)答中發(fā)揮主要的作用。TLR家族成員的特征為具有稱 為Toll-IL-IR (TIR)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和由一系列富亮氨酸重復(fù)組成 的細(xì)胞外區(qū)域。多種微生物成分與Toll樣受體的結(jié)合引起大量促炎蛋白 的表達(dá)，例如誘導(dǎo)型環(huán)加氧酶、粘附分子和趨化因子。迄今已經(jīng)鑒定了 IO個(gè)人類TLR。 TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的TLR，其在細(xì)菌脂多糖(LPS)應(yīng)答 中起關(guān)鍵作用(1，2)。 TLR2與TLR1和TLR6偶聯(lián)以分別識(shí)別二?；?和三?；?。TLR5識(shí)別并應(yīng)答于細(xì)菌鞭毛蛋白(Flagdlin) (3)，而TLR9 對(duì)于識(shí)別存在于細(xì)菌DNA中的未甲基化的CpG基序是必需的(4)。最近 已經(jīng)描述了小鼠的TLRll、 12和13，但在人類中沒有其直系同源物(5，6)。 以合適的配體刺激TLR引起轉(zhuǎn)錄因子NF-kb的活化以及絲裂原活化的蛋 白激酶(MAPK)、 p38、 c-junN末端激酶(INK)和p42/p44的活化。
NF-kB的活化依賴于MyD88，后者是含有胞漿TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋 白(Adapter protein) (7,8,9)。 MyD88可作為除TLR3以外的全部TLR家族 的銜接蛋白，TLR3募集的是銜接蛋白TRIF(IO)。除了活化NF-kB， TRIF 對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)控因子3 (IRF3)依賴性基因的誘導(dǎo)也是必需的 (11)。這一途徑被稱為MyD88非依賴性途徑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)于躲避病毒 來源的病原體(evading pathogens of viral origin)具有重要作用(12)。另一種 TIR銜接蛋白，MyD88銜接物樣物(Adapter-like) (Mal，也稱為TIRAP) 參與MyD88依賴性途徑(13,14)，且對(duì)于TLR2和TLR4介導(dǎo)的信號(hào)途徑 是特別需要的(15，16)。在感染過程中，TLR與各種配體的結(jié)合導(dǎo)致產(chǎn)生 炎性介質(zhì)例如細(xì)胞因子和趨化因子，并活化免疫效應(yīng)細(xì)胞。這種協(xié)調(diào)性 的應(yīng)答旨在清除侵入的病原體，不過，在很多情況下，細(xì)菌產(chǎn)物可激活 來自宿主的介質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)，使之失控，這可導(dǎo)致多器官衰竭、心血管系統(tǒng) 衰竭以及死亡。這種狀況被稱為敗血癥，是醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房中的主要
死因，且在全世界范圍內(nèi)在逐漸增加。因此，TLR蛋白拮抗劑或許是對(duì) 抗免疫應(yīng)答過渡激活之有害作用的有用手段。對(duì)于將中斷TLR4信號(hào)傳 導(dǎo)作為對(duì)抗LPS的毒性效應(yīng)的手段正在進(jìn)行詳細(xì)研究。當(dāng)前的治療方法 包括針對(duì)TLR4及其共受體CD14的中和抗體以及合成的脂質(zhì)A類似物， 后者用于與LPS競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體(17，18)。
與敗血癥的情況一樣，針對(duì)其他TLR的治療也作為對(duì)抗病毒感染的 手段。例如TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特(Imiquimod)已經(jīng)成功用于治療由人乳 頭狀瘤病毒引起的生殖器皰疹(19)。對(duì)于自身免疫病，TLR激動(dòng)劑己經(jīng)被 認(rèn)為是將適應(yīng)性Th2應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門hl免疫應(yīng)答的手段，由此可防止發(fā)生 過敏。更加長(zhǎng)期的目標(biāo)涉及開發(fā)針對(duì)TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游成分的治療 方法。因此全面了解TLR信號(hào)傳導(dǎo)的各個(gè)方面是至關(guān)重要的。
鑒定TLR家族的其他成員或者TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的其他方面具有潛
在的藥用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分離的多肽或其變體或片段，其中所述多肽包含 SEQIDNO.l的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供一種分離的多肽或其變體或片段，其中所述多肽包含 SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述變體包含與SEQ ID NO.l或2的 氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施 方式中，所述變體包含與SEQ IDNO.l或2的氨基酸序列具有至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98°/。、至少99%、至少99.5%相同性的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述變體包含缺失或插入修飾。所述 變體還可包含翻譯后修飾。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述片段是包含SEQ ID NO.l或2的 至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述多肽展現(xiàn)出Toll樣受體活性。所 述Toll樣受體活性可以是TLR14活性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽展現(xiàn)出免疫調(diào)變活性。
本發(fā)明還提供多核苷酸，其編碼如上所述的多肽。
本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO.3 的核酸序列或其變體或片段或與之互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO.4 的核酸序列或其變體或片段或與之互補(bǔ)的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO.3或 4的核酸序列具有至少70%相同性的核酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述片段包含SEQ ID NO.3或4的 至少17個(gè)連續(xù)的核酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸展現(xiàn)出與編碼所述節(jié)段 的天然cDNA具有至少80%的相同性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸編碼Toll樣受體或肽或 其融合蛋白。
本發(fā)明還提供重組核酸，其包含SEQIDN0.3、 SEQIDNO,4的核酸
序列或其變體或片段或與之互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明還提供一種純化的蛋白質(zhì)或肽，其包含SEQ ID NO.l或2的 氨基酸序列或其變體或片段。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或肽的片段包含SEQID NO.l或2的至少12個(gè)連續(xù)的氨基酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)或肽源自哺乳動(dòng)物。所述 蛋白可以源自人類。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)或肽的分子量為至少
100kDa。所述蛋白質(zhì)或肽可以是糖基化形式的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種重組蛋白質(zhì)或肽，其包含SEQ ID
N0.1或2的氨基酸序列。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽可展現(xiàn)出Toll樣受體功能性/活性。 本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)，其包含選自SEQ ID NO.l或2或其變體
或片段的氨基酸序列。所述蛋白質(zhì)可以是Toll樣受體蛋白，特別是TLR14。 本發(fā)明還提供本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的抗原性片段。 本發(fā)明還提供一種重組載體，其包含如上所述的多核苷酸。本發(fā)明
還提供一種宿主細(xì)胞，其包含所述重組載體。本發(fā)明還提供一種基因治
療劑，其包含所述重組載體作為活性成分。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種佐劑，其包含如上所述的多肽。 本發(fā)明還提供融合化合物或嵌合分子，包含任何一種或多種如下
-蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列或其片段或變 體；禾口
-檢測(cè)或純化標(biāo)簽。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)或純化標(biāo)簽選自FLAG序列、
His6序列、Ig序列和另一種受體蛋白的異源性多肽中的一或多種。
本發(fā)明還提供配體/受體復(fù)合物，所述復(fù)合物包含重組或合成產(chǎn)生的
蛋白質(zhì)和TLR配體，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列。
優(yōu)選地，TLR配體是CpG核酸。
本發(fā)明還提供一種免疫原，其包含如上所述的蛋白質(zhì)的抗原決定簇。 本發(fā)明還提供單克隆或多克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合如上所
述的多肽或蛋白質(zhì)或肽的表位?？贵w可以制備為固定化的形式?？贵w可
通過綴合于或者附著于珠、磁珠、載片或容器而固定化?？贵w可固定化
于溴化氰活化的瓊脂糖或吸附于具有或不具有戊二醛交聯(lián)的聚烯烴表面。
本發(fā)明還提供用于鑒定調(diào)變Toll樣受體活性的化合物的方法，步驟 包括
-將包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列或其變體或片段的多肽 與測(cè)試樣品相接觸；
-監(jiān)測(cè)Toll樣受體活性的標(biāo)記物；和
-鑒定調(diào)變Toll樣受體活性的化合物。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，Toll樣受體活性的標(biāo)記物包括如下一組 中的任何一或多項(xiàng)
(i) NF-kB活化
(ii) NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸
(iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸
(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸
(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸
(vi) RANTES蛋白或其編碼多核苷酸
(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸，或
(viii) 任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括確定上述(i)至(viii)中各項(xiàng)的至少2 項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括確定上述(i)至(viii)中各項(xiàng)的至 少3項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異的步驟。
在一種情況中，確定的是與測(cè)試樣品有關(guān)的蛋白質(zhì)的量。或者，采 用核酸微陣列來確定與測(cè)試樣品有關(guān)的mRNA的量。所述Toll樣受體活 性可以是TLR14活性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過確定如下一組中的任何一或多項(xiàng) 與測(cè)試樣品有關(guān)的量、表達(dá)、活性或磷酸化而鑒定活化或抑制TLR活性 的化合物
(i) NF-kB活化
(ii) NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸
(iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸
(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸
(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸
(vi) RANTES蛋白或其編碼多核苷酸
(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸，或
(viii) 任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過如上所述的方法鑒定能夠調(diào)變TLR活性
的化合物。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物和藥用可接 受的載體。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含
-調(diào)變包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的TLR14多肽或包
含SEQ ID NO.3或4的核酸的多核苷酸的活性的試劑或化合物；和 -藥用可接受的載體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是TLR14激動(dòng)劑或拮抗劑。
優(yōu)選地，所述載體化合物是選自水、鹽水和緩沖液中的任何一或多 種的水性化合物。所述組合物可以是用于口服、直腸、鼻部、局部或者 胃腸外施用的形式。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物或組合物用于制備藥物， 所述藥物用于治療一或多種如下疾病過敏性疾病、自身免疫病、炎性 疾病、心血管疾病、CNS疾病、腫瘤性疾病和感染性疾病、和/或免疫介 導(dǎo)的疾病。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病是選自敗血癥或感染引起的 急性炎癥、創(chuàng)傷或損傷、慢性炎性疾病、移植物排異或移植物抗宿主病、 Crohn病、炎性腸病、多發(fā)性硬化、1型糖尿病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘 或特應(yīng)性疾病和變應(yīng)性腦病中的任何一或多種。
其他免疫介導(dǎo)的疾病包括如下一組的一或多種糖尿病、關(guān)節(jié)炎(包 括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié) 炎)、動(dòng)脈硬化、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、 皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、干燥綜合征包括繼發(fā)于干燥綜合 征的干燥性角膜結(jié)膜炎、斑禿、節(jié)肢動(dòng)物叮咬反應(yīng)引起的過敏反應(yīng)、口 瘡性潰瘍、虹膜炎、結(jié)膜炎、角結(jié)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、過敏性 哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥疹、麻風(fēng)逆轉(zhuǎn)反應(yīng)
(Leprosy reversal reactions)、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、自身免疫性葡萄膜炎、變 應(yīng)性腦脊髓炎、急性壞死性血性腦病、特發(fā)性雙側(cè)進(jìn)展性感音神經(jīng)性聽 覺喪失、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減 少、多軟骨炎、韋格納肉芽腫病、慢性活動(dòng)性肝炎、Stevens-Johnson綜 合征、特發(fā)性口炎性腹瀉、扁平苔癬、Graves眼病、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽 汁性肝硬化、Uveitisposterior、間質(zhì)性肺纖維化、阿爾茨海默病或乳糜瀉。
本發(fā)明還提供針對(duì)具有SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列或其變體的 TLR14多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑化合物。
本發(fā)明還提供調(diào)變細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞的生理或發(fā)育的方法，其包 括將所述細(xì)胞與哺乳動(dòng)物TLR14的激動(dòng)劑或拮抗劑相接觸。
本發(fā)明還提供篩選能夠抑制或促進(jìn)NF-kB活化的化合物的方法，其 包括如下步驟
-給細(xì)胞提供編碼如上所述的蛋白質(zhì)的基因和產(chǎn)生與NF-kB活 化相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)的成分；
-將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)于使得所述基因在所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 的條件下；
-將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與一或多種用于篩選的化合物相接觸； -測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)；和
-通過測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)來分離或鑒定活化劑化合物或抑制 劑化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟
-將所述分離的或鑒定的化合物優(yōu)化為一種藥用化合物。
本發(fā)明還提供用于篩選能夠調(diào)變Toll樣受體活性的化合物的試劑盒，
其包含
-包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞和在NF-KB活化后產(chǎn)
生可檢測(cè)信號(hào)的成分；和
-用于測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)的試劑。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因編碼Toll樣受體TLR14。 本發(fā)明還提供包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的片段或變體的
多肽在制備用于治療免疫性或炎性疾病的藥物中的用途，所述多肽能夠 抑制具有SEQ IDNO.l或2的氨基酸序列的TLR14的活性。
本發(fā)明還提供如上所述的多肽、多核苷酸或化合物在制備佐劑或疫 苗制劑中的用途。
本發(fā)明涉及一種新的哺乳動(dòng)物受體一Toll樣受體14 (TLR14)—及其 生物學(xué)活性。本發(fā)明包括編碼所述多肽的核酸及其制備和使用方法。本 發(fā)明的核酸的特征部分在于它們與在此所述的克隆的互補(bǔ)DNA (complimentary DNA， cDNA)序列具有同源性。
在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明包含選自如下一組的物質(zhì)組分 (composition of matter):基本上純的或重組的TLR14蛋白質(zhì)或肽，其展 現(xiàn)出與SEQ ID NO.l或2具有至少12個(gè)氨基酸的相同性；SEQ ID NO.l 或2的TLR14天然序列；包含TLR14序列物質(zhì)組分的融合蛋白新的 TLR (TLR14)。在具體的實(shí)施方式中，所述物質(zhì)組分是TLR14，其包含 SEQ ID N0.1或2的天然序列，或缺乏翻譯后修飾，或者所述物質(zhì)組分
可以是來自選自包括靈長(zhǎng)類(例如人)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的溫血?jiǎng)游锏牡鞍?質(zhì)或肽，蛋白質(zhì)或肽包含SEQIDN0.1或2中的至少一種多肽；是糖基 化的，分子量為至少100kDa，具有天然的糖基化，是合成的多肽；綴合 于另一種化學(xué)部分；是來自天然序列的較少取代的5倍或是天然序列的 缺失或插入突變。在具體的實(shí)施方式中，所述的TLR、 TLR的抗原性片 段、TLR的抗體、TLR的抗體片段、TLR配體的抗體也包括固定化的形 式。可以通過綴合或附著于珠、磁珠、載片或者容器而固定化?？赏ㄟ^ 本領(lǐng)域熟知的方法固定化于溴化氰活化的瓊脂糖，或吸附于具有或不具 有戊二醛交聯(lián)的聚烯烴表面。
其他的實(shí)施方式包括一種組合物，其包含無(wú)菌的TLR14蛋白或肽、 或所述TLR14蛋白質(zhì)或肽以及載體，其中所述載體是包括水、鹽水和/ 或緩沖液中的水性化合物，和/或所述組合物被配制為用于口服、直腸、 鼻部、局部或者胃腸外施用。
在特定的融合蛋白實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含SEQ ID NO.l或2的成熟蛋白質(zhì)序列，檢測(cè)或純化標(biāo)簽，其包括FLAG或His6 或Ig序列；或另一種受體蛋白的序列。
各種試劑盒實(shí)施方式包括試劑盒，其包含TLR14蛋白或多肽以及包 括所述蛋白或多^C的隔室；和/或使用或處理試劑盒中的試劑的說明。
結(jié)合化合物的實(shí)施方式包括的化合物包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其 特異性結(jié)合TLR14蛋白，其中所述蛋白是靈長(zhǎng)類的蛋白；所述結(jié)合化合 物是Fv、 Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物綴合于另一種化學(xué)部分；或 所述抗體是針對(duì)SEQIDN0.1或2的成熟多肽的肽序列產(chǎn)生的；是針 對(duì)成熟TLR14產(chǎn)生的；是針對(duì)純化的人TLR14產(chǎn)生的；是免疫篩選的； 是多克隆抗體；結(jié)合變性的TLR14;展現(xiàn)出至少30nM的抗原Kd;附著 于固相基質(zhì)，包括珠或塑料膜；存在于無(wú)菌組合物中或具有可檢測(cè)標(biāo)記 物，包括放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物。結(jié)合組合物試劑盒通常包括結(jié)合 化合物和包括所述結(jié)合化合物的隔室；和/或使用或處理試劑盒中的試劑 的說明。試劑盒通常能夠進(jìn)行定性或定量分析。
本發(fā)明提供了方法，例如制備抗體的方法，包括以免疫原量的靈長(zhǎng) 類TLR14免疫免疫系統(tǒng)，由此引起產(chǎn)生所述抗體，或制備抗原/抗體復(fù)合 物的方法，包括將此類抗體與哺乳動(dòng)物TLR14蛋白質(zhì)或肽相接觸，由此
使得所述復(fù)合物能夠產(chǎn)生。
可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用且在文獻(xiàn)中充分披露的免疫方法。 其他的組合物包括如下組合物，其包含無(wú)菌結(jié)合化合物，或所述 結(jié)合化合物和載體，其中所述載體是水性的，包括水、鹽水和/或緩沖液， 和域所述組合物被配制為用于口服、直腸、鼻部、局部或者胃腸外施用。 核酸實(shí)施方式包括編碼TLR14或肽或融合蛋白的分離的或重組的核 酸，其中TLR來自哺乳動(dòng)物；或所述核酸編碼SEQIDNa3或4的抗原 性肽序列；編碼多個(gè)SEQ ID NO.3或4的抗原性肽序列；包含來自SEQ ID NO.3或4的至少17個(gè)連續(xù)核苷酸，與編碼所述節(jié)段的天然cDNA展現(xiàn) 出至少80%的相同性；是表達(dá)載體；還包含復(fù)制起點(diǎn)；來自天然來源； 包含可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物或免疫原性標(biāo)記物； 包含合成的核苷酸序列；少于6kB、優(yōu)選地少于3kB;來自哺乳動(dòng)物，包 括靈長(zhǎng)類；包含天然的全長(zhǎng)編碼序列；是編碼所述TLR的基因的雜交探 針；或是PCR引物、PCR產(chǎn)物、或誘變引物。還提供了包含此類重組核 酸的細(xì)胞、組織或器官。優(yōu)選地所述細(xì)胞是原核細(xì)胞；真核細(xì)胞；細(xì)菌 細(xì)胞；酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；小鼠細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞；靈長(zhǎng)類細(xì)胞或 人類細(xì)胞。本發(fā)明提供包含此類核酸和含有所述核酸的隔室的試劑盒； 隔室還包含靈長(zhǎng)類TLR14蛋白或多肽；和/或使用或處理試劑盒中的試劑 的說明。所述試劑盒通常能夠進(jìn)行定性分析或定量分析。
還提供了用于產(chǎn)生配體/受體復(fù)合物的方法，包括將包括重組的或合 成方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基本上純的TLR14與候選TLR配體相接觸，由此 使得所述復(fù)合物功能形成。
TLR配體指的是能夠特異性結(jié)合TLR多肽的分子，在本發(fā)明中，TLR 多肽是TLR14多肽。在絕大多數(shù)情況中，當(dāng)與TLR在合適的條件下接觸 時(shí)，TLR配體還誘導(dǎo)TLR信號(hào)傳導(dǎo)。
本發(fā)明還提供調(diào)變細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞的生理或發(fā)育的方法，包括 將所述細(xì)胞與哺乳動(dòng)物TLR14的激動(dòng)劑或拮抗劑相接觸。
本發(fā)明涉及使用至少一種以下標(biāo)記物來鑒定和評(píng)價(jià)調(diào)變TLR14活性 的試劑的方法(i)NF-KB活化、(ii)NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸、(iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK 蛋白或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii)TLR4 蛋白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
本發(fā)明還涉及在細(xì)胞或組織中改變以下各項(xiàng)的表達(dá)、量、活性或磷 酸化的試劑的用途(i)NF-KB活化、(ii)NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸、 (m) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了新的TLR14蛋白，且TLR14的抑制或活化可通過 確定那些能夠?qū)е乱韵赂黜?xiàng)活化的信號(hào)分子的量、表達(dá)、活性或磷酸化 而檢測(cè)(i) NF-kB活化、(ii) NF-kB蛋白或其編碼多核苷酸、(iii) IRF3 蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK蛋白 或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii)TLR4蛋 白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種方法其通過確定以下各項(xiàng)與測(cè)試 樣品有關(guān)的水平的差異而監(jiān)測(cè)TLR14活化或抑制的效應(yīng):(i) NF-kB活化、 (ii)NF-kb蛋白或其編碼多核苷酸、(iii)IRF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸、(vi) RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii)TLR4蛋白或其編碼多核苷酸、或 (viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
"水平"在此包括但不限于蛋白質(zhì)的量、mRNA的表達(dá)量、基因活 性、蛋白活性、以及磷酸化的量。
觀賦樣品可包括但不限于肽核酸(PNA)、抗體、多肽、糖、脂質(zhì)、激 素和小分子。測(cè)試化合物也可包括參照免疫刺激性核酸(reference immunostimulatory nuclei acid)的變體。這些可得自天然的核酸來源基因組
核或線粒體DNA (或cDNA)或者是合成的(例如通過寡核苷酸合成而產(chǎn) 生)。
因此，本發(fā)明在一方面涉及鑒定和評(píng)價(jià)那些活化或抑制TLR14活性 的試劑的方法，其包括確定以下各項(xiàng)中的至少一項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量、 表達(dá)、活性或磷酸化的差異(i)NF-KB活化、(ii)NF-KB蛋白或其編碼多 核苷酸、(iii) 1RF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv)p38蛋白或其編碼多核苷 酸、(v)IKK蛋白或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷 酸、(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞 因子。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，此類方法包含確定上述(i)至(viii)中各項(xiàng)的至 少2項(xiàng)、至少3項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，確定的是與測(cè)試樣品有關(guān)的mRNA的 量的差異，可以通過例如采用核酸微陣列來確定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，確定是與測(cè)試樣品有關(guān)的蛋白質(zhì)的量 的差異。
本發(fā)明的另一個(gè)方法涉及鑒定或評(píng)價(jià)調(diào)變TLR14活性的試劑的方 法，所述方法包括(i)NF-KB活化、(ii)NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸、 (iii) 1RF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，此類方法包括確定上述(i)至(viii)中各項(xiàng)的至少2項(xiàng)、 至少3項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異。
在鑒定或評(píng)價(jià)那些調(diào)變TLR14活性的試劑的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 式中，所述方法包括(i)NF-KB活化、(ii)NF-KB蛋白或其編碼多核苷酸、 (iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸、(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸、(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸、(vi)RANTES蛋白或其編碼多核苷酸、(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸、或(viii)任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。在
另一個(gè)實(shí)施方式中，此類方法包括確定上述(i)至(viii)中各項(xiàng)的至少2項(xiàng)、 至少3項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異。
序列同源性
本發(fā)明的特別優(yōu)選的核苷酸序列是SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2所 示的人類序列。由SEQ ID NO:3的DNA編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。由SEQ ID NO:4的DNA編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
由于已知遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性，即存在一個(gè)以上的密碼子編碼同一 個(gè)氨基酸，因此不同于SEQ IDNO:3所示的DNA仍然可編碼具有SEQ ID NO.l的氨基酸序列的多肽。此類變體DNA序列可以是沉默突變(例如在 PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生)的結(jié)果，或者可以是對(duì)天然序列進(jìn)行刻意誘變的產(chǎn) 物。
因此本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的多肽的分離的DNA序列，其選自(a) 包含SEQ ID NCU的核苷酸序列的DNA、 (b)編碼SEQ ID NO:3的多肽 的DNA、 (c)能夠在中等嚴(yán)格性條件下與(a)或(b)的DNA雜交并編碼本發(fā) 明的多肽的DNA; (d)能夠在高嚴(yán)格性條件下與(a)或(b)的DNA雜交并編 碼本發(fā)明的多肽的DNA、和(e)作為(a)、 (b)、 (c)、或(d)的DNA的遺傳密 碼簡(jiǎn)并的結(jié)果而產(chǎn)生的并編碼本發(fā)明的多肽的DNA。當(dāng)然，本發(fā)明也包 括由此類DNA序列編碼的多肽。
因此本發(fā)明提供編碼具有生物學(xué)活性的人類干擾素a14多肽的等價(jià) 的分離的DNA序列，其選自(a)衍生自天然的哺乳動(dòng)物干擾素al4等位 基因c基因編碼區(qū)的DNA; (b) SEQ ID NO:3的DNA; (c)能夠在中等嚴(yán) 格性條件下與(a)或(b)的DNA雜交并編碼具有生物學(xué)活性的干擾素a" 多肽的DNA;禾B(d)作為(a)、 (b)、或(c)的DNA的遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果而 產(chǎn)生的并編碼具有生物學(xué)活性的干擾素a14多肽的DNA。
在此，本領(lǐng)域人員能夠根據(jù)例如DNA的長(zhǎng)度容易地確定中等嚴(yán)格性
條件?；镜臈l件可參見Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1， pp. 1.101-104， Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)。本領(lǐng)域人員能夠根據(jù)例如DNA的長(zhǎng)度容易地確定高嚴(yán)格性條件。
本發(fā)明的實(shí)施方式也包括編碼多肽片段以及包含失活的N糖基化位 點(diǎn)、失活的蛋白酶加工位點(diǎn)、或保守性氨基酸取代的多肽的DNA。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子還包含與天然序列具有至 少80%相同性的核苷酸序列。本發(fā)明也預(yù)期以下實(shí)施方式，其中核酸分 子包含與天然序列具有至少90%相同性、至少95%相同性、至少98%相 同性、至少99%相同性、或至少99.9%相同性的序列。
可通過視覺觀察和數(shù)學(xué)計(jì)算確定百分比相同性?；蛘撸刹捎?Devereux等所述的(Nucl. Acids Res. 12:387， 1984)并可自University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)得到的GAP計(jì)算機(jī)程序 6.0版，通過比較序列信息而確定兩個(gè)核酸序列百分比相同性。GAP程序 的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括(1)核苷酸的一元比較矩陣(相同的值為1，而不相 同的值為O)以及Gribskov and Burgess (Nucl. Acids Res. 14:6745， 1986)的 力卩權(quán)比較矢巨陣，見Schwartz and Dayhoff， eds.， Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) 對(duì)每一缺口的罰分為3.0，且對(duì)每一缺口中的每一符號(hào)有額外的0.10的罰 分；和(3)末端缺口不罰分。也可采用序列比較領(lǐng)域人員使用的其他程序。
本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生多肽的分離的核酸。此類多肽可通過多種常 規(guī)技術(shù)而制備?？蓪⒕幋a干擾素a14多肽的DNA或其所需片段亞克隆入 表達(dá)載體內(nèi)用于產(chǎn)生所述多肽或片段。有利地，將DNA序列融合于編碼 合適的前導(dǎo)肽或信號(hào)肽的序列?；蛘?，可采用已知的技術(shù)化學(xué)合成所需 的片段。也可通過對(duì)所克隆的全長(zhǎng)DNA序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化而產(chǎn) 生DNA片段，并在瓊脂糖凝膠上通過電泳進(jìn)行分離。如果需要，可將用 于在所需位點(diǎn)重建5'或3'末端的寡核苷酸連接于限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生 的DNA片段。此類寡核苷酸可額外地含有限制性內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)，其位于所需的編碼序列的上游，并將起始密碼子(ATG)置于編碼序列的N末 端。
也可采用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以分離和擴(kuò)增編碼所需蛋白質(zhì) 片段的DNA序列。限定所述DNA片段的所需末端的寡核苷酸可用作5' 和3'引物。寡核苷酸可額外含有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，以利于將擴(kuò) 增的DNA片段插入表達(dá)載體。PCR技術(shù)見于Saiki et ah, Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds.， Academic Press, Inc,， San Diego (1989)， pp. 189-196;和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, i皿is et al.， eds.， Academic Press, Inc. (1990)。
本發(fā)明包括各種形式的多肽及其片段，包括那些天然存在的或通過 各種技術(shù)例如涉及重組DNA技術(shù)的方法而制備的。例如，編碼干擾素al4 多肽的DNA可通過體外誘變而衍生自SEQ ID NO:3 ，誘變包括定點(diǎn)誘變、 隨機(jī)誘變和體外核酸合成。此類形式包括但不限于衍生物、變體和寡聚 物，以及融合蛋白或其片段。
本發(fā)明的多肽包括由SEQ ID NO:l的核酸序列編碼的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。 特別優(yōu)選的多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽可以是膜結(jié)合型的或者可以是分泌的且因此是可溶性 的?？扇苄远嚯哪軌虮槐磉_(dá)它們的細(xì)胞分泌。通常，可通過例如離心將 表達(dá)所需多肽的完整細(xì)胞與培養(yǎng)基分離，并測(cè)定培養(yǎng)基(上清液)中是否存 在所需多肽，從而鑒定可溶性多肽(并將它們與非可溶性的膜結(jié)合型對(duì)應(yīng) 物區(qū)分開)。培養(yǎng)基中存在所述多肽表明所述多肽自細(xì)胞分泌且因此是蛋 白質(zhì)的可溶形式。
在此還提供不同長(zhǎng)度的多肽片段。在此也提供所述多肽和片段的天 然存在的變體以及衍生變體。
本發(fā)明還涉及藥物組合物。所述組合物包含(a)調(diào)變TLR14多肽或 多核苷酸活性的試劑，和(b)藥用可接受的載體。所述試劑可以是TLR14 激動(dòng)劑或拮抗劑。所述組合物可用于治療例如過敏性疾病、自身免疫病、炎性疾病、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病和感染性疾病 等疾病。
本領(lǐng)域人員了解如何選擇包括生理學(xué)適當(dāng)?shù)幕衔镌趦?nèi)的藥用載體 以及根據(jù)施用途徑和擬定的施用方案選擇化合物。
治療(Treatment/Therapy)
術(shù)語(yǔ)"治療"在此指任何能夠使得人或非人類動(dòng)物獲益的療法。治 療針對(duì)的可以是已經(jīng)存在的病癥或者可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。治療 可包括治愈、減輕或預(yù)防等效果。
更確切地說，應(yīng)當(dāng)以最寬泛的含義來理解"治療性"和"預(yù)防性" 治療。術(shù)語(yǔ)"治療性"并不一定是指對(duì)個(gè)體的治療直至達(dá)到徹底痊愈。 類似地，"預(yù)防性"并不一定意味著個(gè)體將最終不出現(xiàn)病癥。
因此，治療性和預(yù)防性治療包括減輕特定病癥的癥狀或者預(yù)防特定 病癥的發(fā)生或降低其發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語(yǔ)"預(yù)防性"可以理解為降低特定 病癥的嚴(yán)重程度或其發(fā)病。"治療性"也可降低己有病癥的嚴(yán)重程度。
除非另有說明，本發(fā)明所描述的方法涉及細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、 分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、以及免疫學(xué)中 常規(guī)使用的技術(shù)，所有這些技術(shù)均是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明還涉及在來自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞和組織提取物中鑒定并純化的 TLR14內(nèi)源性配體。
本發(fā)明還涉及調(diào)變TLR4信號(hào)傳導(dǎo)，其中TLR14促進(jìn)或抑制TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)。
本發(fā)明的肽可用于篩選影響或調(diào)變所述肽的活性或功能的分子。此 類分子與所述肽的相互作用可具有治療性和預(yù)防性的用途。
已知為了鑒定到新的藥物，無(wú)論是前期還是在找到一種先導(dǎo)化合物 (先導(dǎo)化合物)之后，藥物研究均會(huì)涉及對(duì)極其大量的候選化合物進(jìn)行篩 選。此類方法用于篩選可能用于治療或預(yù)防癌癥的物質(zhì)。被鑒定為所述
多肽的調(diào)變劑的物質(zhì)代表了這些治療領(lǐng)域的進(jìn)步，這是因?yàn)樗鼈兪窃O(shè)計(jì) 和研究用于體內(nèi)用途的治療劑的基礎(chǔ)。
在多種其他方面，本發(fā)明涉及篩選和分析方法以及由此鑒定的物質(zhì)。 因此，本發(fā)明在另一個(gè)方面提供本發(fā)明的肽(包括其片段或衍生物) 在篩選或?qū)ふ液?或獲得或鑒定物質(zhì)中的用途，所述物質(zhì)例如是與本發(fā)明 的肽相互作用或結(jié)合和/或干擾其生物學(xué)功能或活性或另一種物質(zhì)的生物 學(xué)功能或活性的肽或化合物。例如，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面的方法包括提 供一種本發(fā)明的肽并使之與一種物質(zhì)相接觸，該接觸可導(dǎo)致所述肽與所 述物質(zhì)結(jié)合?？商峁┒喾N技術(shù)來定性和定量確定所述結(jié)合，這是本領(lǐng)域 人員所熟知的。
被鑒定為肽功能調(diào)變劑的物質(zhì)可以是肽或非肽。非肽"小分子"對(duì) 于多數(shù)體內(nèi)藥用用途而言通常是優(yōu)選的。因此，可設(shè)計(jì)所述物質(zhì)的模擬 物用于藥用用途。對(duì)于基于"先導(dǎo)"化合物的藥物研發(fā)而言，針對(duì)已知 的具有藥用活性的化合物設(shè)計(jì)模擬物是已知的方法。這對(duì)于以下情況是 有益的，即活性化合物難于合成或者合成費(fèi)用過高的情況或者其不適合 特定施用方式的情況，例如肽并不適合作為口服組合物的活性成分，因 為它們?cè)谙乐幸子诒坏鞍酌秆杆俳到??？赏ㄟ^模擬物設(shè)計(jì)、合成和 測(cè)試來避免根據(jù)目的特性對(duì)大量分子進(jìn)行隨機(jī)篩選。
從具有特定目的特性的化合物設(shè)計(jì)模擬物有一些常規(guī)采取的步驟。 首先確定化合物中對(duì)于決定目的特性是關(guān)鍵的和/或重要的那些特定部 分。對(duì)于肽，這可通過系統(tǒng)性地改變肽的氨基酸殘基而做到，例如依次 取代各個(gè)殘基。構(gòu)成化合物的活性區(qū)域的這些部分或殘基稱為"藥效團(tuán)"。
一旦確定了藥效團(tuán)，即可采用多種來源的數(shù)據(jù)，例如光譜技術(shù)、x
線衍射數(shù)據(jù)和NMR，根據(jù)其物理特性如立體化學(xué)、鍵、大小和威電荷， 對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模。計(jì)算機(jī)分析、相似性作圖(其對(duì)藥效團(tuán)的電荷和/或體 積而非原子間的結(jié)合鍵進(jìn)行建模)和其他技術(shù)也可用于建模方法。在該方 法的一個(gè)變體中，建立了配體及其結(jié)合伴侶的三維模型。這對(duì)于配體和/ 或結(jié)合伴侶在結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象改變的情況是特別有用的，能夠使得模型 考慮到模擬物的設(shè)計(jì)。
然后選擇模板分子，在上面移接模擬藥效團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)?？杀憷?選擇模板分子和移接于其上的化學(xué)基團(tuán)以便模擬物能夠易于合成、很可 能是藥用可接受的且在體內(nèi)不降解，但仍然保留先導(dǎo)化合物的生物學(xué)活 性。隨后可對(duì)以這種方式得到的模擬物進(jìn)行篩選，以確定它們是否具有 目的活性或展現(xiàn)出何種程度的目的活性。然后可進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化或修 飾以得到一或多種最終的模擬物，用于體內(nèi)或臨床測(cè)試。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種分析方法，其用于評(píng)價(jià)本發(fā)明 的至少一種肽與推定的結(jié)合分子的結(jié)合活性，其包括以下步驟將至少 一種肽與推定的結(jié)合分子或其他測(cè)試物質(zhì)相接觸，并確定所述至少一種 肽與推定的結(jié)合分子或測(cè)試物質(zhì)的相互作用或結(jié)合，其中所述至少一種 肽與推定的結(jié)合分子之間的結(jié)合代表所述至少一種肽的用途。
可分離和/或純化、制備與本發(fā)明的肽相互作用的物質(zhì)和/或用其調(diào)變 肽的活性。
本發(fā)明的測(cè)試兩種分子之間的結(jié)合的分析方法不一定使用本發(fā)明的 完整的肽?？刹捎帽绢I(lǐng)域人員已知的任何方式產(chǎn)生并使用片段。
此外，本領(lǐng)域人員可采用常規(guī)的技術(shù)和知識(shí)對(duì)本發(fā)明的分析方法的 確切形式加以變化。


通過以下實(shí)施例的方式并結(jié)合以下附圖進(jìn)行說明，可更加清楚地理 解本發(fā)明
圖1A是人TLR14的染色體定位的示意圖。TLR14位于7號(hào)染色體 的7pl5，如線條所示。其長(zhǎng)度為4.7 kb，兩側(cè)翼為CREB5和CPVL基因。 箭頭代表轉(zhuǎn)錄方向，TLR14以反向平行方向轉(zhuǎn)錄。上述信息是采用得自 NCBI網(wǎng)頁(yè)www.ncbi.nlm.nih.gov的人類基因組圖譜瀏覽工具獲得的;
圖IB顯示了人TLR14的核苷酸序列(SEQIDNO.l);
圖1C顯示了鼠TLR14的核苷酸序列(SEQ IDNO.2);
圖ID顯示了人類(SEQ ID N0.3)和鼠(SEQ ID N0.4)TLR14的推定的 蛋白質(zhì)序歹U。人類TLR14基因的推定的ORF編碼811個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)， 而鼠蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為809個(gè)氨基酸。下劃線標(biāo)出了推定的N末端信號(hào)序 列和跨膜結(jié)構(gòu)域；
圖1E顯示了 TLR4和TLR14胞外結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。推定的TLR與人 TLR4的比對(duì)發(fā)現(xiàn)這兩種受體之間具有高度的序列相似性?？设b定到至少 6個(gè)富亮氨酸重復(fù)并用框標(biāo)出；
圖2A是在若干組織中表達(dá)的人TLR14的mRNA表達(dá)譜。人類和鼠 的該新TLR的表達(dá)譜可得自HUGE蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。使用針對(duì)編碼所述蛋 白質(zhì)的mRNA的3'非翻譯區(qū)的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。在所有測(cè)試的組 織中均檢測(cè)到表達(dá)，表達(dá)水平最高的是腎臟、腦和卵巢；
圖2B是人類組織樣品中的TLR14蛋白質(zhì)表達(dá)譜。在腦和肺中檢測(cè) 到高表達(dá)水平；
圖3顯示了 TLR14的胞漿區(qū)與其他TLR家族成員的比對(duì)。TLR14 的胞漿區(qū)與其他TLR家族成員的比對(duì)發(fā)現(xiàn)推定的受體具有TLR特征性的 相似性區(qū)域。特別是有兩個(gè)區(qū)域是同源的(見框1和2)并被認(rèn)為是所有 含TIR結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的標(biāo)志性序列。TLR14的框2與TLR3的相同；
圖4是人類TLR14推定的啟動(dòng)子區(qū)域的示意圖。采用Promoter Inspector和Mat Inspector鑒定了 TLR14推定的啟動(dòng)子區(qū)域。所有上述轉(zhuǎn) 錄因子的矩陣積分*均高于0.8。
*矩陣積分測(cè)量的是啟動(dòng)子內(nèi)的序列與轉(zhuǎn)錄因子矩陣內(nèi)的保守性核 苷酸密切對(duì)應(yīng)的程度。明顯的匹配為>0.8;
圖5顯示了 LPS在U373和原代鼠胚胎成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)的TLR14 表達(dá)以及LPS處理的小鼠中誘導(dǎo)的TLR14的表達(dá)。(A)以lpg/ml LPS 按指定的時(shí)間處理U373和MEF。分離mRNA并進(jìn)行RT-PCR，如說明
書所述。(B)給小鼠腹腔內(nèi)注射LPS并放置3小時(shí)，然后處死。對(duì)未處 理的對(duì)照組和LPS處理的小鼠進(jìn)行RT-PCR;
圖6顯示了以TLR配體處理后的細(xì)胞中TLR14蛋白的表達(dá)。(A)以 Pam3Cys (lpg/ml)處理人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172不同的時(shí)間并檢測(cè) TLR14的表達(dá)。(B)以LPS(lpg/ml)處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TLR4 了的人HEK-293 細(xì)胞不同的時(shí)間并檢測(cè)TLR14的表達(dá)。(C)自未處理對(duì)照組小鼠和注射 LPS的小鼠的腦部制備蛋白提取物。檢測(cè)提取物的TLR14表達(dá)；
圖7顯示TLR14活性在HEK293和U373星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo) NF-kB-和ISRE-受體基因表達(dá)。TLR14活性在HEK293和U373星形細(xì)胞 瘤細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)NF-kB-和ISRE-螢光素酶活性。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 NF-kB 受體構(gòu)建體連同1 、 5和10 ng的TLR14 (A)。 HEK293細(xì)胞(B)和U373 細(xì)胞(C)轉(zhuǎn)染了ISRE報(bào)告基因構(gòu)建體和劑量逐漸增加(1、 10和100ng) 的TLR14d 24小時(shí)后，收集細(xì)胞并確定相對(duì)螢光素酶活性；
圖8顯示TLR14在U373星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)Rantes產(chǎn)生。通過 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定以劑量逐漸增加的TLR14轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的U373 細(xì)胞內(nèi)的RANTES產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為以空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的誘導(dǎo)量的倍 數(shù)；
圖9顯示了 TLR14和含TIR-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)TLR2、TLR4和MyD88 之間的相互作用。(A)將TLR14和以Flag標(biāo)記的TLR4、 TLR2或所述受 體的突變形式共轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞。以抗flag珠對(duì)復(fù)合物進(jìn)行免疫沉 淀并以抗TLR14抗體檢測(cè)。(B)將TLR14和以Myc標(biāo)記的MyD88共轉(zhuǎn) 染入HEK-293細(xì)胞。以偶聯(lián)了蛋白A瓊脂糖珠的抗myc抗體對(duì)復(fù)合物進(jìn) 行免疫沉淀并以抗TLR14抗體檢測(cè)；
圖10顯示TLR2和內(nèi)源性TLR14之間的相互作用。將Flag標(biāo)記的 TLR2自HEK-293細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀，并以抗TLR14抗體對(duì)western印 跡進(jìn)行檢測(cè)，以檢測(cè)是否存在與TLR2形成復(fù)合物的內(nèi)源性蛋白質(zhì)；
圖11顯示TLR14存在于細(xì)胞漿且以高水平見于血清。(A)細(xì)胞先以LPS進(jìn)行刺激，然后分離為細(xì)胞漿成分和膜成分。檢測(cè)這些成分中是否 存在TLR14。 (B)將含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行western印跡并檢 測(cè)是否存在TLR14;
圖12顯示以LPS (lng/ml)在指定時(shí)間點(diǎn)剌激細(xì)胞后，TLR14分泌 進(jìn)入IB73培養(yǎng)基。分泌的蛋白似乎是全長(zhǎng)形式的TLR14，最大分泌出現(xiàn) 于6小時(shí)。
發(fā)明詳述
我們已經(jīng)鑒定了一種新的基因，其與Toll樣受體/白介素-l受體(TLR)
家族成員具有顯著的同源性。在細(xì)胞水平的研究中，該新的受體活化轉(zhuǎn) 錄因子NF-kb和IRF3，并驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子RANTES。該蛋白與 TLR2、 TLR4和通用TLR銜接物(即MyD88)相互作用。我們將這種受 體命名為TLR14。
微生物產(chǎn)物例如LPS可增強(qiáng)這種推定的受體的表達(dá)，這提示其可能 具有免疫調(diào)變劑的作用。支持這一點(diǎn)的是，在以表達(dá)TLR14的載體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的情況下，轉(zhuǎn)錄因子NF-kb和IRF3被激活。由于NF-kB和IRF3対 于細(xì)菌和病毒病原體的清除均是至關(guān)重要的，因此抑制或活化TLR14對(duì) 于炎性疾病的治療是一種很有前景的新方法。此外，我們?cè)谘逯邪l(fā)現(xiàn) 了高水平的TLR14。主要由該受體的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的可溶形式TLR2 也以高水平出現(xiàn)于血清和乳汁中。這種形式的TLR2具有保護(hù)性作用， 因?yàn)槠湟种漆槍?duì)TLR2配體的主動(dòng)免疫應(yīng)答。全長(zhǎng)的TLR14多肽或胞外 結(jié)構(gòu)域本身可具有相似的生物學(xué)特性，且因此可被認(rèn)為是潛在的生物治療劑。
微陣列方法已經(jīng)用于鑒定受LPS調(diào)節(jié)并且是TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑的 成分的那些基因。如上所述，銜接物分子Mal對(duì)于受體活化后來自TLR2 和TLR4的信號(hào)的傳遞是必需的。我們使用基因?qū)蜉d體來破壞胚胎干 細(xì)胞中編碼Mal的基因。然后以LPS處理這些細(xì)胞并測(cè)定基因敲除細(xì)胞
與野生型細(xì)胞之間在基因表達(dá)上的差異。由此鑒定了與Toll樣受體/白介 素-1受體(TLR)家族成員具有顯著同源性的基因。
實(shí)施例
以下實(shí)施例僅僅是示例性的，屬于本發(fā)明范圍的各種變化和改動(dòng)對(duì) 于本領(lǐng)域人員來說是顯而易見的。
材料與方法 細(xì)胞培養(yǎng)
HEK293和U373細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)，添加了 100 u/ml青霉素、100 mg/ml 鏈霉素、和2mML-谷氨酰胺。
表達(dá)質(zhì)粒
嵌合TLR受體CD4畫TLR4由R. Medzhitov (Yale University, New Haven, CT)惠贈(zèng)。含有TLR14 cDNA (KIAA0644)的載體由Kazusa DNA Research Institute提供，并用作后續(xù)PCR克隆的靶。使用的引物包括 HindIII和EcoRV的限制性位點(diǎn)，引物序列如下 5'-GCAAGCTTATGGAGGCTGCCCGCGCCTTG (有義)(SEQ ID N0.5);禾口 5'-GCGATATCGGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGGCAAA TCGC (反義)(SEQ ID N0.6)。反義引物包括一編碼9個(gè)氨基酸的血凝素表 位標(biāo)簽的序列，以便檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)。將得到的 EcoRI-HindIII片段連接入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCDNA 3.1 (Invitrogen)的
多克隆位點(diǎn)。
產(chǎn)生Mai缺陷型胚胎干細(xì)胞以及微陣列分析
通過同源重組產(chǎn)生缺乏編碼Mai的基因的胚胎干細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，使 用導(dǎo)向載體對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，其中將編碼Mal基因絕大部分編 碼區(qū)的700 bp外顯子以新霉素抗性盒進(jìn)行置換。通過southern印跡鑒定 靶細(xì)胞，然后進(jìn)行第二輪基因打靶，以產(chǎn)生Mal缺失的純合子克隆。以 LPS刺激突變細(xì)胞和野生型細(xì)胞不同時(shí)間，并提取RNA用于微陣列分析。
啟動(dòng)子分析
人類Riken克隆KIAA0644和側(cè)翼區(qū)的完整核苷酸序列得自National Center for Biotechnology Information (NCBI)網(wǎng)頁(yè)www.ncbi.nlm.nih.gov。 采用NIX application (http:〃menu.hgmp.mrc.ac.uk)禾口 Repeat-masker禾呈序 Oittp:〃searchlaimcher.bcm.tmc.edu) (20)鑒定基因組序列中的轉(zhuǎn)錄核苷酸 序歹ij和重復(fù)序歹lj 。 采用 Matlnspector Release Professional (www.genomatix.de/cgi-bin/matinspector/matinspector.pl) (21)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。
自培養(yǎng)的細(xì)胞分離mRNA
以LPS(lng/ml)處理細(xì)胞不同時(shí)間后，自細(xì)胞提取mRNA。簡(jiǎn)言之， 將處理的細(xì)胞沉淀，并在lml的TRI試劑(Sigma)中裂解。向樣品中加 入氯仿(0.2 ml)并將混合物以12，000g離心15分鐘。取出含RNA的水 相，通過加入等體積的異丙醇自混合物中沉淀總RNA。 12,000g離心10 分鐘，然后以500pl的75%乙醇洗滌含RNA的沉淀。然后除去任何殘存 的乙醇，將沉淀置于室溫干燥10分鐘。將沉淀重懸于30^1的無(wú)RNAse 的水中，存放于-80。C。
逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)
使用Promega Impromptu RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 分兩個(gè)歩驟進(jìn)行，然后在合成的cDNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)。
步驟l:將lpl的隨機(jī)引物加到位于500^1薄壁PCR微量離心管中的
4pl的RNA中。將管置于熱循環(huán)儀中，70。C5分鐘，然后4。C5分鐘。
步驟2:加入第二組成分lnl脫氧核苷酸混合物(dNTP混合物)(各 種dNTP各500(jM)、 5.5nl的PCR試劑水、4.0(il的10X緩沖液、3.0|il 的氯化鎂、1^1 Rnase抑制劑(l單位4d)、 1^1的RT (1單位4U)。這使得PCR 管中的總體積達(dá)到20pl。將管置于熱循環(huán)儀中，時(shí)間和溫度如下，25°C5 分鐘、42。C60分鐘、70。C15分鐘。
在冰上的500nl薄壁PCR微量離心管中加入以下成分5pl的10X 緩沖液、1^dNTP(各種dNTP各200ioM)、 1^1 PCR引物(各0.4^1)、 2-5pl 模板DNA(cDNA)、 lpl Taq DNA聚合酶混合物(0.05單位/pl)和足量的 PCR試劑水，使得PCR管中的總體積為50^1。擴(kuò)增溫度如下變性/RT 滅活(步驟1) 94°C 2分鐘、變性(步驟2) 94°C 15秒、退火(步驟3) 55°C 30 秒、延伸6S。C 1分鐘(步驟2、 3和4重復(fù)35次)、最后延伸(步驟5) 68°C 5分鐘。然后將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳并以UV燈觀察。
檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)
針對(duì)該推定蛋白質(zhì)的C末端的肽抗體由Eurogentec， Liege Science Park, Belgium合成。用于免疫的肽由以下氨基酸組成 CGSLRREDRLLQRFAD (SEQ ID N0.7)。以TLR配體處理細(xì)胞系達(dá)指定 的時(shí)間。通過加入冷PBS終止刺激，將細(xì)胞在SDS-PAGE樣品緩沖液中 裂解。為western印跡，將TLR14抗體以1:1000稀釋于含有0.5% tween 20 的tris緩沖鹽溶液中。
螢光素酶報(bào)告基因分析
HEK 293細(xì)胞或U373細(xì)胞接種于96孔板(2 x 104細(xì)胞/孔)，次曰以 表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用Genejuice (Novagen)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。對(duì)涉及NF-kb或IRF3的實(shí)驗(yàn)，將80ng的NF-kB-或ISRE-螢光素酶報(bào)告基因(Stratagene)連同40 ng的Renilla螢光素酶內(nèi)對(duì)
照質(zhì)粒(Promega)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。24小時(shí)后，將細(xì)胞收集到被動(dòng)裂解緩沖 液(Promega)中，以光度計(jì)(luminometer)測(cè)定報(bào)導(dǎo)基因活性。在細(xì)胞被刺 激的情況中，在收集前6小時(shí)將LPS (Sigma)加入到細(xì)胞中，終濃度為 lpg/ml。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照水平的平均誘導(dǎo)倍數(shù)is.d，結(jié)果來自至少 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的代表性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
以劑量逐漸增加(l、 10和100 ng)的TLR14表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U373細(xì)胞。 細(xì)胞在37°C溫育24小時(shí)。96孔微滴定板以捕獲抗體(小鼠抗人RANTES) 包被，抗體終濃度為40ng/ml。 24小時(shí)后以含0.05。/。Tween20的PBS洗 滌板。然后以含1% BSA和5%蔗糖的PBS在室溫封閉板1小時(shí)。將細(xì) 胞上清液(100W)加入各孔，將板在室溫溫育2小時(shí)。然后向各孔加入檢 測(cè)抗體(生物素化的羊抗人RANTES)，終濃度為10ng/ml。將板在室溫再 次溫育2小時(shí)。洗滌后各孔加入lOOpl的鏈霉抗生物素HRP，將板加蓋 并在室溫溫育20分鐘。最后向孔內(nèi)加入100^1底物溶液(R&D Systems, Catalog #DY999)，然后加入50^1終止溶液(2NH2S04)。以讀板器測(cè)定各 孔在450nrn的光密度。
免疫共沉淀分析
HEK293細(xì)胞以1 x 105細(xì)胞/ml接種于10 cm板內(nèi)。次日以3嗎的flag 標(biāo)記的TLR2、 TLR4或Myc標(biāo)記的MyD88轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后在含有 1% NP40的Hepes緩沖液中裂解細(xì)胞。然后將細(xì)胞與M2抗flag瓊脂糖 珠(Sigma)—起溫育。3小時(shí)后以Hepes緩沖液洗滌珠3次，重懸于2(Hil 的SDS-PAGE樣品緩沖液中。將蛋白樣品在10。/。SDS-PAGE凝膠上電泳， 轉(zhuǎn)移至纖維素膜上進(jìn)行western印跡。印跡膜以抗TLR14和抗flag抗體 定位研究
細(xì)胞以1 x 1()S細(xì)胞/ml接種于10cm皿內(nèi)，24小時(shí)后以LPS刺激。 超速離心制備膜成分和細(xì)胞質(zhì)成分，并進(jìn)行SDS-PAGE和western印跡， 以確定TLR14的定位。對(duì)含10% FCS的培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行SDS-PAGE， 然后進(jìn)行印跡分析以確定是否存在TLR14。
表征編碼TLR14的基因
初步微陣列分析鑒定了 6個(gè)基因在Mal敲除細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)水平降 低。所鑒定的基因中有5種已經(jīng)有所表征，而另一種則是新的并由本發(fā) 明表征。該基因的序列可自HUGE (Human Unidentified Gene-Encoded Large Proteins)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，其是Kazusa DNA Research Institute的 人類cDNA工程的一部分(www.Kazusa.or.ip、。出于以下原因我們將這種 基因命名為TLR14。
我們使用NCBI的Map Viewer工具將該基因定位在人類7號(hào)染色體 上(圖1A)。該基因長(zhǎng)度為4.7 kb，兩側(cè)翼為CREB5和CPVL羧基肽酶。 人和鼠的TLR14的核苷酸序列分別在圖1B和圖1C中示出。推定的蛋白 質(zhì)的長(zhǎng)度為811個(gè)氨基酸(圖1D)，并含有N末端信號(hào)序列，該特征是所 有膜定位蛋白所共有的。該推定的蛋白質(zhì)的N末端還含有至少6個(gè)富亮 氨酸重復(fù)并與幾個(gè)TLR的細(xì)胞外區(qū)域高度同源(以TLR4為例，見圖IE)。
表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)該基因的產(chǎn)物在腦、腎臟和卵巢中十分豐富，見圖2A(信 息來自于Kazusa DNA Research Institute)。我們產(chǎn)生了針對(duì)TLR14的C
末端的多克隆抗體。用于免疫的肽包含氨基酸序列 CGSLRREDDRLLQRFAD (SEQ ID N0.7)。該抗體在人腦和肺組織中檢測(cè) 到一大約81kDa的蛋白質(zhì)(圖2B)。
如上所述，TLR家族成員均具有一細(xì)胞漿TIR結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域的 跨度約為200個(gè)氨基酸，在家族成員中存在不同程度的序列相似性?？?以鑒定到3個(gè)在家族成員中高度保守的特定的盒。盒1被認(rèn)為是家族的
特征性序列，而盒2和3中含有對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要的氨基酸。TLR1和 TLR2的TIR結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了一以盒2為中心的核芯結(jié)構(gòu)元件 (22)。該區(qū)域稱為BB袢，形成了一片暴露的表面并含有重要的脯氨酸或 精氨酸殘基。這些氨基酸位于袢的頂端，并被認(rèn)為形成了與下游信號(hào)傳 導(dǎo)成分的接觸點(diǎn)。對(duì)TLR14的深入研究發(fā)現(xiàn)其還含有高度保守的盒2和 可識(shí)別的(identifiable)盒l(wèi)和盒3 (圖3)，提示該新的蛋白質(zhì)屬于TLR超 家族。
以TLR2和TLR4配體處理細(xì)胞后誘導(dǎo)TLR14表達(dá) 如上所述，缺乏Mal的細(xì)胞在暴露于LPS后消除了 TLR14的表達(dá)。 這提示所研究的基因受到LPS的調(diào)節(jié)，并可能受到其他TLR配體調(diào)節(jié)。 為深入探討lt匕問題，我們采用NIX application (http:〃menu.hgmp.mrc.ac.uk) 禾口 Matlnspector Release Professional (www, genomatix ■ de/cgi-bin/matinspector/matinspector.pl)鑒定了 TLR14的啟動(dòng)子區(qū)域以及可能 的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。該功能性TLR14啟動(dòng)子很可能位于外顯子1近端 的4 kb區(qū)域內(nèi)。對(duì)該區(qū)域的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了若干個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的推定結(jié) 合位點(diǎn)，例如NF-kB、 IRF7和Ets-l (圖4)。以炎性刺激處理細(xì)胞后，通 過RT-PCR分析誘導(dǎo)TLR14 mRNA表達(dá)的情況。如圖5A所示，在暴露 于LPS后，腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞(U373)和原代鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)內(nèi) TLR14mRNA表達(dá)隨時(shí)間而誘導(dǎo)。還檢測(cè)到，從LPS處理的小鼠的腦制 備的TLR14 mRNA的水平也顯著升高(圖5B)。在以TLR2配體Pam3Cys 處理后的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172中也檢測(cè)到蛋白質(zhì)水平的誘導(dǎo)表達(dá)， 如圖6A所示。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 TLR4的HEK-293細(xì)胞在以LPS處理后也觀 察到了類似的情況(圖6B)。此外，在注射了 LPS的小鼠的腦部也發(fā)現(xiàn) TLR14蛋白表達(dá)的增加，如圖6C所示。
TLR14活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和IRF3
如上所述，NF-kB被TLR超家族的大多數(shù)成員活化，而IRF3的活 化限于TLR3和TLR4。為了闡明TLR14是否也能夠活化這些因子并由 此調(diào)變免疫應(yīng)答，我們將編碼該蛋白質(zhì)的cDNA克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載 體pcDNA3.1內(nèi)，并使用含有NF-kB和IRF3可與之結(jié)合的DNA元件的 螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體進(jìn)行功能性分析。該蛋白質(zhì)含有編碼血凝素(HA) 的標(biāo)簽，使用抗HA抗體在各種細(xì)胞系中檢測(cè)到其表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng) 將TLR14表達(dá)質(zhì)粒與kB和ISRE報(bào)告基因構(gòu)建體一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中時(shí)， 螢光素酶活性增強(qiáng)(圖7)，這提示TLR14同TLR4 —樣，既活化NF-kB 也活化IRF3。初步ELISA也發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了 TLR14的細(xì)胞中，RANTES (一種IRF3誘導(dǎo)型細(xì)胞因子)的產(chǎn)生增加(圖8)。
TLR14與TLR家族其他成員相互作用
含TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的共同特征是它們能夠發(fā)生同二聚化或與其 他含TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)發(fā)生異二聚化。我們用TLR14和含TIR結(jié)構(gòu)域 的受體TLR2和TLR4進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，以確定TLR14是否能夠 與這兩種抗體之一或兩者相互作用。我們發(fā)現(xiàn)TLR14與過表達(dá)的TLR2 和TLR4發(fā)生強(qiáng)烈相互作用，見圖9A。已知將TLR的TIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保 守性脯氨酸殘基突變?yōu)榻M氨酸能夠消除TIR-TIR相互作用(22)。因此，當(dāng) 突變(P/H)形式的這些受體與TLR14共表達(dá)時(shí)，TLR14與TLR2或TLR4 之間的相互作用明顯降低。還發(fā)現(xiàn)TLR14與含TIR-結(jié)構(gòu)域的通用銜接物 MyD88相互作用，見圖9B。這支持TLR14是含TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的 觀點(diǎn)。最后，我們得以檢測(cè)TLR2與內(nèi)源性TLR14的相互作用，見圖10。 為了對(duì)此進(jìn)行測(cè)試，我們給HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 flag標(biāo)記的TLR2。然后 裂解細(xì)胞并與抗flag珠一起溫育，以使得TLR2和任何相互作用的蛋白 質(zhì)免疫沉淀。Western印跡后，我們得以采用抗TLR14抗體檢測(cè)到相應(yīng) 于TLR14的條帶。TLR14以高水平存在于血清中且可以可溶性蛋白的形式產(chǎn)生 我們制備了細(xì)胞成分以便確定TLR14是否位于細(xì)胞膜。令人驚異的 是，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)了(圖IIA)。此夕卜，在胎牛血清中發(fā)現(xiàn)了 高水平的該蛋白質(zhì)(圖IIB)，提示該蛋白質(zhì)可以是可溶性分泌蛋白。質(zhì)譜 分析發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)于FCS中的條帶是人TLR14的牛同源物(數(shù)據(jù)未顯示)。初 步的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后，U373細(xì)胞分泌該蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì) 似乎沒有裂解，因?yàn)槠浞肿恿肯鄳?yīng)于全長(zhǎng)蛋白分子量。最大分泌出現(xiàn)于6 小時(shí)。
本發(fā)明并不限于上述的具體實(shí)施方式
，具體實(shí)施方式
在細(xì)節(jié)上可以 發(fā)生變化。
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權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其變體或片段。
2. —種分離的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO.2的氨基酸序 列或其變體或片段。
3. 權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述變體包含與SEQIDNO.l或 2的氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的多肽，其中所述變體包含與SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列具有至少95%相同性的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的多肽，其中所述變體包含缺失或插 入修飾。
6. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的多肽，其中所述變體包含翻譯后修飾。
7. 權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述片段是包含SEQIDNO.l或 2的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽，其展現(xiàn)出Toll樣受體活性。
9. 權(quán)利要求8的多肽，其中所述Toll樣受體活性是TLR14活性。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的多肽，其展現(xiàn)出免疫調(diào)變活性。
11. 一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的多肽。
12. —種分離的多核苷酸，其編碼一種多肽，所述多核苷酸包含 SEQ IDN0.3的核酸序列或其變體或片段或與之互補(bǔ)的序列。
13. —種分離的多核苷酸，其編碼一種多肽，所述多核苷酸包含 SEQIDNO,4的核酸序列或其變體或片段或與之互補(bǔ)的序列。
14. 權(quán)利要求12或13的多核苷酸，其包含與SEQIDNO.3或4的 核酸序列具有至少70%相同性的核酸序列。
15. 權(quán)利要求12或13的多核苷酸，其中所述片段包含SEQ ID NO.3 或4的至少17個(gè)連續(xù)核酸。
16. 權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸與 編碼所述節(jié)段的天然cDNA展現(xiàn)出至少80%的相同性。
17. 權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的多核苷酸，其編碼Toll樣受體或 肽或其融合蛋白。
18. —種分離的多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO.3或SEQ ID N0.4或其變體或片段的核酸序列或與其互補(bǔ)的序列，其編碼其融合蛋白。
19. 一種重組核酸，其包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或其變體 或片段或與之互補(bǔ)的序列的核酸序列。
20. —種純化的蛋白質(zhì)或肽，其包含SEQIDNO.l或2的氨基酸序 列或其變體或片段。
21. 權(quán)利要求20的蛋白質(zhì)或肽，其中所述片段包含SEQ ID NO.l 或2的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸。
22. 權(quán)利要求20或21的蛋白質(zhì)或肽，其中所述蛋白質(zhì)來源于哺乳 動(dòng)物。
23. 權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽，其中所述蛋白質(zhì)來 源于人類。
24. 權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽，其分子量為至少 100kDa。
25. 權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽，其為糖基化的形式。
26. —種重組蛋白質(zhì)或肽，其包含SEQ IDNO.l或2的氨基酸序列。
27. 權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽，其展現(xiàn)出Toll樣受 體功能性/活性。
28. —種Toll樣受體蛋白，其包含選自SEQ ID NO. 1或2或其變體或片段的氨基酸序列。
29. 權(quán)利要求28的Toll樣受體蛋白，其是TLR14。
30. 權(quán)利要求20至29中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽的抗原性片段。
31. —種重組載體，其包含權(quán)利要求11至18中任一項(xiàng)的多核苷酸。
32. —種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求31的重組載體。
33. —種基因治療劑，其包含權(quán)利要求31的重組載體作為活性成分。
34. —種佐劑，其包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的多肽。
35. —種融合化合物，其包含任何一或多種以下的-蛋白質(zhì)，其包含SEQIDN0.1或2的氨基酸序列或其片段或變體；和-檢測(cè)或純化標(biāo)簽。
36. 權(quán)利要求34的融合化合物，其中所述檢測(cè)或純化標(biāo)簽選自 FLAG序列、His6序列、Ig序列和另一種受體蛋白的異源性多肽中的任 何一或多種。
37. —種配體/受體復(fù)合物，其包含重組的或合成產(chǎn)生的包含SEQ IDNO.l或2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)和TLR配體。
38. 權(quán)利要求36的配體/受體復(fù)合物，其中所述TLR配體是CpG 核酸。
39. —種免疫原，其包含權(quán)利要求20至30中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的抗 原決定簇。
40. —種單克隆或多克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1 至10中任一項(xiàng)的多肽的表位或權(quán)利要求20至30中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽 的表位。
41. 權(quán)利要求40的抗體，其中所述抗體以固定化形式制備。
42. 權(quán)利要求41的抗體，其中所述抗體通過綴合于或者附著于珠、 磁珠、載片或容器而固定化。
43. 權(quán)利要求41或42的抗體，其中所述抗體固定化于溴化氰活化的瓊脂糖或吸附于具有或不具有戊二醛交聯(lián)的聚烯烴表面。
44. 用于鑒定調(diào)變Toll樣受體活性的化合物的方法，包括以下步驟: -將包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列或其變體或片段的多肽與 測(cè)試樣品相接觸；-監(jiān)測(cè)Toll樣受體活性的標(biāo)記物；和 -鑒定調(diào)變Toll樣受體活性的化合物。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中所述Toll樣受體活性的標(biāo)記物包含 以下一組中的任何一種或多種(i) NF-kB活化(ii) NF-kB蛋白或其編碼多核苷酸(iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸(vi) RANTES蛋白或其編碼多核苷酸(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸，或(viii) 任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
46. 權(quán)利要求44或45的方法，包括確定權(quán)利要求45中所述的(i) 至(viii)中各項(xiàng)的至少2項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異的步驟。
47. 權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的方法，包括確定權(quán)利要求45中 所述的(i)至(viii)中各項(xiàng)的至少3項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量的差異的步驟。
48. 權(quán)利要求44至47中任一項(xiàng)的方法，其中確定的是與測(cè)試樣品 有關(guān)的蛋白質(zhì)的量。
49. 權(quán)利要求44至48中任一項(xiàng)的方法，其中采用核酸微陣列確定 與測(cè)試樣品有關(guān)的mRNA的量。
50. 權(quán)利要求44至49中任一項(xiàng)的方法，其中所述Toll樣受體活性 是TLR14活性。
51. 權(quán)利要求44的方法，其中通過確定如下一組中的任何一或多 項(xiàng)與測(cè)試樣品有關(guān)的量、表達(dá)、活性或磷酸化而鑒定活化或抑制TLR活 性的化合物 (i) NF-kB活化(ii) NF-kB蛋白或其編碼多核苷酸(iii) IRF3蛋白或其編碼多核苷酸(iv) p38蛋白或其編碼多核苷酸(v) IKK蛋白或其編碼多核苷酸(vi) RANTES蛋白或其編碼多核苷酸(vii) TLR4蛋白或其編碼多核苷酸，或(viii) 任何促炎或抑制性細(xì)胞因子。
52. 通過權(quán)利要求44至51中任一項(xiàng)的方法鑒定的能夠調(diào)變TLR 活性的化合物。
53. —種藥物組合物，其包含權(quán)利要求52的化合物和藥用可接受 的載體。
54. —種藥物組合物，其包含-具有SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的試劑或化合物或包含SEQ IDN0.3或4的核酸的多核苷酸；和 -藥用可接受的載體。
55. —種藥物組合物，其包含-調(diào)變包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的TLR14多肽的活性或 包含SEQ IDNO.3或4的核酸的多核苷酸的活性的試劑或化合物；和 -藥用可接受的載體。
56. 權(quán)利要求54或55的組合物，其中所述試劑是TLR14激動(dòng)劑 或拮抗劑。
57. 權(quán)利要求54至56中任一項(xiàng)的組合物，其中所述載體化合物是 選自水、鹽水和緩沖液中的任何一或多種水性化合物。
58. 權(quán)利要求54至57中任一項(xiàng)的組合物，其為用于口服、直腸、 鼻部、局部或者胃腸外施用的形式。
59. 權(quán)利要求52的化合物或權(quán)利要求53至58中任一項(xiàng)的組合物 用于制備治療選自以下一組中的任何一或多種疾病的藥物過敏性疾病、 自身免疫病、炎性疾病、心血管疾病、CNS疾病、腫瘤性疾病和感染性 疾病。
60. 針對(duì)具有SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的TLR14多肽或其 變體的激動(dòng)劑或拮抗劑化合物。
61. 調(diào)變細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞的生理或發(fā)育的方法，包括將所述細(xì) 胞與哺乳動(dòng)物TLR14的激動(dòng)劑或拮抗劑相接觸。
62. 篩選能夠抑制或促進(jìn)NF-kB活化的化合物的方法，其包括以下 步驟-給細(xì)胞提供編碼權(quán)利要求20至29中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的基因和產(chǎn)生 與NF-kB活化相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)的成分；-將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)于使得所述基因在所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條 件下；-將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與一或多種用于篩選的化合物相接觸； -測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)；和-通過測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)來分離或鑒定活化劑化合物或抑制劑化 合物。
63. 制備藥物組合物的方法，其包含權(quán)利要求62的步驟并包括以 下步驟-將所述分離的或鑒定的化合物優(yōu)化為一種藥用化合物。
64. 用于篩選能夠調(diào)變Toll樣受體活性的化合物的試劑盒，其包括: -包含編碼權(quán)利要求20至30中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞和在NF-kB活化后產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的成分；和 -用于測(cè)定所述可檢測(cè)信號(hào)的試劑。
65. 權(quán)利要求64的試劑盒，其中所述基因編碼Toll樣受體TLR14。
66. 包含SEQ ID NO.l或2的氨基酸序列的片段或變體的多肽在制 備用于治療免疫性或炎性疾病的藥物中的用途。
67. 權(quán)利要求66的多肽的用途，其中所述多肽能夠抑制TLR14的 活性。
68. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求10至19中任一 項(xiàng)的多核苷酸、或權(quán)利要求52的化合物在制備佐劑或疫苗制劑中的用途。
69. 包含SEQ IDNO.l或2的氨基酸序列的片段或變體的多肽所編 碼的蛋白質(zhì)在制備具有免疫調(diào)變功能的治療劑中的用途。
全文摘要
一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO.1或2的氨基酸序列或其變體或片段。其變體可包含與SEQ ID NO.1或2的氨基酸序列具有至少70％或95％相同性的氨基酸序列。其片段可包含SEQ ID NO.1或2的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的肽。該多肽展現(xiàn)出Toll樣受體活性。該TLR被命名為TLR14。TLR受體識(shí)別多種配體，并活化一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以誘導(dǎo)免疫和炎癥基因。
文檔編號(hào)C07K14/705GK101198622SQ200680021612
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日
發(fā)明者A·鄧恩, L·A·J·奧尼爾 申請(qǐng)人:都柏林伊麗莎白女皇神學(xué)院