專利名稱：Toll樣受體4激動劑CRX-675抗肺纖維化的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計Toll樣受體4激動劑CRX-675在治療肺纖維化中的新用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維化是許多慢性疾病致殘和致死的主要原因，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。 據(jù)美國有關(guān)統(tǒng)計資料證明，接近45%的疾病致死病人可以歸因于組織纖維增生疾病。近年來肺纖維化(Pulmonary fibrosis)發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。例如特發(fā)性肺纖維化臨床診斷明確后的3年生存率不足50%，5年死亡率達(dá)65%。許多慢性肺疾病，包括哮喘、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、慢阻肺、肺結(jié)核、肺癌、間質(zhì)性肺病等，都伴有纖維化病理改變。肺纖維化可引起肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過度沉積，導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失。對于特發(fā)性肺纖維化、呼吸窘迫綜合征、嗜酸性肉芽腫等多種肺疾病而言，肺組織纖維增生和纖維化程度決定了該疾病的臨床后果。這些疾病發(fā)展到晚期，嚴(yán)重妨礙病人正常工作和生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致病人因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。肺纖維化的確切發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。除了吡非尼酮在日本已獲準(zhǔn)用于治療間質(zhì)性肺纖維化(但并未被美國FDA批準(zhǔn))外，目前還沒有其它有效的藥物和治療方法。因此，深入研究肺纖維化的發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新藥靶、開發(fā)治療肺纖維化防治藥物迫在眉睫。模式識別受體Toll樣受體(Toll-Like Receptors, TLRs)是先天免疫系統(tǒng)溝通獲得免疫系統(tǒng)的重要橋梁。雖然目前未見TLRs與肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的直接證據(jù)，但最近的研究發(fā)現(xiàn)TLRs與多種纖維化疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，例如本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，無論是敲除TLR2還是治療性給予中和性TLR2抗體均可顯著抑制肺臟抑制性免疫微環(huán)境的形成，降低博來霉素所致肺損傷、纖維化和動物死亡；TLR2+小鼠降低冠脈結(jié)扎引起心室重構(gòu)。TLR4+小鼠降低四氯化碳所致肝纖維化、降低腹主動脈狹窄引起的心肌重構(gòu)。我們的研究表明，在二氧化硅或BLM所引起的急性肺損傷和肺纖維化過程中TLR4均起重要調(diào)節(jié)作用。CRX-675 (氨烷基葡糖胺4磷酯)是TLR4激動劑家族成員之一，既可影響機(jī)體防御病原體的第一防線固有免疫，也可調(diào)節(jié)過敏原引起的活動性免疫反應(yīng)。已有研究表明，可減輕過敏反應(yīng)，抑制感染，特別是影響呼吸道的感染。

發(fā)明內(nèi)容
針對肺纖維化危害嚴(yán)重及缺少臨床有效藥物和治療方法的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種新的技術(shù)方案，即利用Toll樣受體4激動劑CRX-675用于治療肺纖維化。本發(fā)明通過系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)對于C57BL/6小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射博萊霉素(3U/Kg)造成肺纖維化模型，在造模后7天開始，腹腔注射CRX-675 (lOmg/kg/day)至第21天。通過病理組織學(xué)及生化檢測等方法分別分析和評價博萊霉素灌注小鼠肺部炎癥、損傷和纖維化的改變，發(fā)現(xiàn)激活TLR4信號通路能顯著降低博萊霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR4信號通路顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷，減小博萊霉素所致肺纖維化，包括降低肺部膠原沉積、羥脯氨酸含量和α -SMA的表達(dá)，改善肺纖維化小鼠的肺功能。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR4激動劑CRX-675能抑制博萊霉素所致肺纖維化，改善肺纖維化小鼠的肺功能，大大降低其死亡率。


Sham 假手術(shù)組
BLM 模型組
CRX-675 CRX-675 治療組
圖1. CRX-675顯著減少BLM所致動物死亡(小鼠生存率)。
圖2. CRX-675顯著減輕BLM致肺部炎癥。
A，肺HE染色；B，肺部炎癥指數(shù)。
圖3. CRX-675顯著降低BLM致肺部膠原沉積。
A，肺Masson染色；B，膠原沉積。
圖4. CRX-675顯著降低BLM致肺部組織中羥脯氨酸的含量。
圖5. CRX-675顯著降低BLM致肺部α -SMA的蛋白表達(dá)。
圖6. CRX-675顯著提高BLM致肺功能降低(n = 5)。
Α，小鼠總肺活量(TLC)；
B，小鼠深吸氣量(IC)；
C，小鼠肺活量(VC)；
D，小鼠肺順應(yīng)性(Cchord)；
Ε，小鼠更能殘氣量(FRC)；
F，小鼠最大肺活量(FVC)；
G，小鼠吸氣時間(Ti)；
H，小鼠呼氣時間(Te)；
I，小鼠用力呼氣量50ms(FEV50))；
J，小鼠用力呼氣量100ms (FEV100)。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合實(shí)施例對發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例材料和方法實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑C57BL/6J小鼠動物購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所(雄性，6-8周，16_18g)。 所有動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，恒溫恒濕，自由飲食。博萊霉素(Bleomycin，BLM)購自日本化藥株式會社；anti-IgG抗體購自 Biolegend ；CRX-675購自Invivogen公司；羥脯氨酸測定試劑盒購自江蘇南京建成生物有限公司；α-SMA抗體購自Boster公司；Western Blot實(shí)驗(yàn)中所使用的DAB顯色劑購自北京普利來生物技術(shù)有限公司；蘇木素染色液，伊紅試劑以及Masson三色染色試劑盒均購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司。肺纖維化動物模型(BLM致肺纖維化動物模型)雄性C57BL/6J(6-8周齡)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥鈉(45mg/kg, i. p.)麻醉。氣管內(nèi)注射BLM(3U/kg)，假手術(shù)組(Sham)氣管內(nèi)注射等體積的生理鹽水。造模后每日記錄體重及動物的死亡情況，至第觀天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。肺纖維化動物實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計共分為3組，即假手術(shù)組(Sham)、模型組(BLM)及CRX-675治療組(CRX-675)。BLM 造模后7天開始腹腔注射CRX-675(10mg/kg/day)至BLM造模后第21天。假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。病理切片和結(jié)果分析取動物右側(cè)下葉肺組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，并在最大橫截面積切片。 分別通過蘇木素/伊紅(HE)和Masson染色觀察炎癥和纖維化狀況。應(yīng)用SpotAdvanced 3. 0獲得高清晰的病理圖片，HE染色觀察病理基本改變，并進(jìn)行炎癥評分。通過Image-Pro Plus 5. 1分析Masson染色后膠原的著色面積和肺組織面積。使用Image-Pro Plus 5.1 測量出每個視野Masson染色后的膠原的著色面積、視野下肺組織面積。以著色面積、著色面積與視野肺組織面積比表示該膠原的相對含量。博萊霉素所致肺纖維化實(shí)驗(yàn)中每組分析 10個標(biāo)本，每個標(biāo)本隨機(jī)取6個視野，取均值代表一個動物膠原組織在肺組織內(nèi)的相對含量和表達(dá)強(qiáng)度；矽肺纖維化實(shí)驗(yàn)中每組分析12個標(biāo)本，每個標(biāo)本隨機(jī)取10個視野，取均值代表一個動物膠原組織在肺組織內(nèi)的相對含量和表達(dá)強(qiáng)度。通過非參數(shù)方差分析比較各組膠原面積。羥脯氨酸測定 BLM所致肺纖維化實(shí)驗(yàn)中，檢測動物左肺最大肺葉羥脯氨酸的含量，評價肺纖維化的情況。方法參照南京建成生物工程技術(shù)有限公司堿水解法測定組織羥脯氨酸含量試劑盒說明書。Western Blot 檢測 α -SMA 的表達(dá)提取實(shí)驗(yàn)組中小鼠肺臟組織總蛋白，應(yīng)用Bradford法進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行在 12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上進(jìn)行電泳。應(yīng)用Western Blot 免疫印跡法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉，二步法檢測α -SMA的表達(dá)， Gel-Pro 3. 1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。肺功能檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日，戊巴比妥鈉(45mg/kg，i. p.)麻醉，氣管切口，置入肺功能檢測系統(tǒng)，給予150次/min頻率的被迫呼吸，測定吸氣時間(Ti)、呼氣時間(Te)、功能殘氣量(FRC)、深吸氣量(IC)、肺活量(VC)、總肺活量(TLC)、肺順應(yīng)性(Cchord)、最大肺活量 (FVC)、用力呼氣量50ms (FEV50)和用力呼氣量100ms (FEV100)，每組檢測5只動物。統(tǒng)計分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用X士SE，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗(yàn)，經(jīng)比較P < 0. 05有統(tǒng)計學(xué)差異， P <0.01有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。病理學(xué)分級資料的統(tǒng)計使用卡方檢驗(yàn)，經(jīng)比較P < 0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異，P <0.01認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果
CRX-675顯著減少BLM所致動物死亡在所有肺纖維化動物模型中，BLM所致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制與人特發(fā)性肺纖維化最為類似。因此，我們選擇BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型。氣管注射BLM可造成動物急性肺損傷甚至引起死亡，隨著急性炎癥的消退逐漸形成明顯的肺纖維化。比較氣管注射博萊霉素之后觀天的時間段內(nèi)各組小鼠的生存率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模觀后，sham組動物無死亡，BLM可引起野生型小鼠40%動物死亡，TLR4激動劑CRX-675顯著減少BLM所致動物死亡(圖1)。 CRX-675顯著減輕BLM致肺部炎癥研究發(fā)現(xiàn)，引起肺間質(zhì)性疾病的原因高達(dá)150種以上，包括感染、毒物、藥物、自身免疫性疾病、嚴(yán)重創(chuàng)(外)傷和輻射等，但是不同原因引起的肺間質(zhì)性疾病都以肺組織炎癥和組織纖維增生為共同病理特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BLM能夠?qū)е滦∈蠓谓M織大量炎性細(xì)胞， 包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在肺組織內(nèi)的浸潤。 而TLR4激動劑CRX-675能夠顯著降低其炎癥程度，顯著減少淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞在肺組織浸潤(圖2，表1)。表1CRX-675降低BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量
權(quán)利要求
1.抗Toll樣受體4激動劑CRX-675在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了Toll樣受體4激動劑CRX-675抗肺纖維化的用途。發(fā)明人通過系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)對于C57BL/6小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射博萊霉素(3U/Kg)造成肺纖維化模型，在造模后7天開始，腹腔注射CRX-675(10mg/kg/day)至第21天；通過病理組織學(xué)及生化檢測等方法發(fā)現(xiàn)激活TLR4信號通路能顯著降低博萊霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR4信號通路顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷，減小博萊霉素所致肺纖維化，包括降低肺部膠原沉積、羥脯氨酸含量和α-SMA的表達(dá)，改善肺纖維化小鼠的肺功能。
文檔編號A61K31/7028GK102258527SQ20101018594
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者劉含智, 楊紅振, 王佳平, 胡卓偉, 花芳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所