專利名稱：鑒定及使用a的制作方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求在美國(guó)專利局申請(qǐng)?zhí)枮?0/183141專利申請(qǐng)的申請(qǐng)日為優(yōu)先權(quán)日，所述申請(qǐng)的申請(qǐng)日為在2000年2月17日，題述申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)在此作為參考。
(1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及鑒定A2B腺苷受體激動(dòng)劑和拮抗劑的方法，及使用A2B腺苷受體拮抗劑治療由A2B腺苷受體介導(dǎo)的細(xì)胞增殖疾病的方法。
視網(wǎng)膜的微血管異常，如視網(wǎng)膜病或早熟，黃斑變性及糖尿病性的視網(wǎng)膜病是非-創(chuàng)傷性失明的主要原因。這些疾病的特點(diǎn)在于由局部出血損傷視網(wǎng)膜血管而引起的新血管形成，即，代償性的血管生成。因而治療這些疾病的其中一個(gè)可能的療法是抑制新血管形成。
本發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是抑制表達(dá)A2B腺苷受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖的方法，包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的A2B腺苷受體拮抗劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是測(cè)定化合物以確定它們是否是A2B腺苷受體拮抗劑或A2B腺苷受體激動(dòng)劑的方法。該方法包括制備人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一和第二份樣品；將所要測(cè)試的化合物加入到人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一份樣品中，并使該化合物與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一份樣品持續(xù)接觸一定的時(shí)間；并比較在第一份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞數(shù)和在第二份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的A2B腺苷受體激動(dòng)劑或拮抗劑化合物。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A是NECA(10μmol/L)誘導(dǎo)的HREC增殖的時(shí)間曲線，NECA的增殖作用可被A2B-特異性拮抗劑3-N-丙基黃嘌呤(10μmol/L)或JW-V1-08(10μmol/L)完全阻斷；圖1B是與未受刺激的細(xì)胞(MEM，基本培養(yǎng)基)相對(duì)照，NECA誘導(dǎo)的HREC遷移率濃度依賴性增加的曲線圖，NECA-誘導(dǎo)的增殖和遷移率與未受刺激的細(xì)胞相比具有顯著性的差異(p＜0.05，ANOVA)；圖2A，2B，2C和2D是在Matrigel上，內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管形成的顯微照片。所有顯微照片均是在第48小時(shí)拍攝的。未受刺激的對(duì)照細(xì)胞(4A)在48小時(shí)的時(shí)候顯示出某些毛細(xì)血管的形成。在NECA作用48小時(shí)的時(shí)候，有大量毛細(xì)血管生成(4B)。與之相比，10μmol/L的A2B選擇性拮抗劑JW-V1-08(4C)和10μmol/L的A2B選擇性拮抗劑3-N-丙基黃嘌呤(4D)均減少了NECA誘導(dǎo)的毛細(xì)血管的生成。所有顯微照片均是從來(lái)源于三個(gè)獨(dú)立供體的細(xì)胞觀察到的典型結(jié)果。
縮略語(yǔ)概述HREC- 人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞AdoR- 腺苷受體NECA- 5’-N-乙基羧酰胺-腺苷ADA- 腺苷脫氨基酶JW-V1-08- 3-異丁基-8-吡咯烷黃嘌呤LDL- 低密度脂蛋白SFM- 無(wú)血清培養(yǎng)基VEGF- 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子本發(fā)明的具體描述本發(fā)明涉及鑒定有效的A2B腺苷受體拮抗劑的方法。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的A2B腺苷受體拮抗劑及使用A2B腺苷受體拮抗劑抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖的方法。
本發(fā)明的其中一個(gè)方面是篩選和鑒定化合物的方法，該化合物是指A2B腺苷受體激動(dòng)劑和拮抗劑。由本發(fā)明方法鑒定的化合物可包括有機(jī)化合物，無(wú)機(jī)化合物，寡核苷酸，反義寡核苷酸，核酶，蛋白，酶，抗體和其它經(jīng)得起本發(fā)明篩選方法評(píng)估檢驗(yàn)的化合物或組合物。
用于評(píng)估本發(fā)明有效的A2B腺苷受體拮抗劑或激動(dòng)劑化合物的其中一個(gè)方法是體外測(cè)定法，即測(cè)量化合物促進(jìn)或抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HREC)生長(zhǎng)的能力。該測(cè)定法在實(shí)施例1中詳細(xì)描述?；衔锸抢脺y(cè)定法，通過(guò)對(duì)暴露于所討論化合物中的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及在標(biāo)準(zhǔn)溶液中或在有標(biāo)準(zhǔn)化合物存在的情況下，人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行比較來(lái)篩選的。與標(biāo)準(zhǔn)品相比，刺激人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物是A2B腺苷受體激動(dòng)劑，而與標(biāo)準(zhǔn)品相比，抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物是A2B腺苷受體拮抗劑。
用于鑒定A2B腺苷受體拮抗劑和激動(dòng)劑的第二個(gè)測(cè)定法是小鼠體內(nèi)測(cè)定法。在小鼠模型中，使1星期大的C57BL/6J小鼠暴露于75％的氧中5天，然后使其暴露于室內(nèi)空氣中。在返回到標(biāo)準(zhǔn)氧條件后5天，小鼠產(chǎn)生可以計(jì)量的視網(wǎng)膜新血管叢。所述化合物是按照篩選方法，通過(guò)腹膜內(nèi)(IP)給予小鼠所討論的化合物，然后對(duì)處理過(guò)的小鼠眼睛中新血管叢的數(shù)量及未治療的小鼠眼睛中新血管叢的數(shù)量進(jìn)行比較而評(píng)估的。體內(nèi)抑制新血管叢生長(zhǎng)的化合物是A2B腺苷受體拮抗劑。
本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是發(fā)現(xiàn)了A2B腺苷受體拮抗劑可用于治療哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖疾病。這種疾病包括，但不局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，癌癥，再狹窄，宿主移植排斥，痛風(fēng)，普通的炎癥反應(yīng)，及其它增殖疾病。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A2B腺苷受體拮抗劑特別適用于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，所述血管內(nèi)皮細(xì)胞包括但不局限于冠狀內(nèi)皮細(xì)胞，來(lái)源于血管床的內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，真皮內(nèi)皮細(xì)胞等。本發(fā)明優(yōu)選的方法包括治療與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖(異常的新血管形成)有關(guān)的疾病，如糖尿病性的視網(wǎng)膜病及早熟的視網(wǎng)膜病。所用A2B腺苷受體拮抗劑可以是非選擇性的A2B腺苷受體拮抗劑，也可以是選擇性的A2B腺苷受體拮抗劑或可包括A2B腺苷受體拮抗劑的組合。
本發(fā)明利用A2B腺苷受體拮抗劑抑制細(xì)胞增殖，特別是抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法適用于任何一種哺乳動(dòng)物。然而，優(yōu)選本發(fā)明的方法用于治療人。本發(fā)明的方法是使用有效藥物劑量的一種或多種化合物進(jìn)行的，該化合物是指A2B腺苷受體拮抗劑。根據(jù)它們的預(yù)計(jì)用途，該組合物可以是固體，半固體或液體的給藥劑型，例如，可以是片劑，栓劑，丸劑，膠囊劑，粉劑，液體制劑，混懸劑，氣體，滴劑，膏劑等。優(yōu)選的一類給藥劑型是可以精確劑量口服給藥的固體，半固體或液體等給藥形式。該組合物可包括一種或多種常規(guī)的藥物賦形劑，及至少一種本發(fā)明的活性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，此外，還可包括其它醫(yī)學(xué)試劑，藥學(xué)試劑，載體，輔劑，稀釋劑等。
對(duì)于固體組合物而言，所用常規(guī)的無(wú)毒固體包括，例如藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等。使用聚亞烷基二醇，例如丙二醇作為載體，可將上述活性化合物配制成栓劑。通過(guò)在賦形劑，如水，生理鹽水，含水葡萄糖，甘油，乙醇等中溶解，分散上述活性化合物及可選擇的藥用輔劑，可制備液態(tài)的可服用的藥物組合物，并由此形成溶液或混懸液。如果需要，所服用的藥學(xué)組合物還可包括少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑，pH緩沖劑等，例如醋酸鈉，脫水山梨糖醇單月桂酸酯，三乙醇胺醋酸鈉，油酸三乙醇胺等。制備這種給藥形式的現(xiàn)行方法是已知的，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域的那些技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的；例如，見(jiàn)Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15th Edition，1975。無(wú)論如何，所給予的組合物或制劑均應(yīng)包括一些有效治療劑量的，即對(duì)減輕所治療患者癥狀有效量的活性化合物。對(duì)于口服給藥而言，藥學(xué)上可接受的非-毒性組合物是通過(guò)摻入任何一種常規(guī)使用的賦形劑，如藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等制備的。這些組合物可采取溶液，混懸液，片劑，丸劑，膠囊劑，粉劑，緩釋制劑等形式。這些組合物可包含10％-95％，優(yōu)選1-70％的活性成分。
通常，非腸道給藥的特點(diǎn)是可經(jīng)皮下，肌內(nèi)，或靜脈內(nèi)注射給藥?？勺⑸涞闹苿┛杀恢瞥沙Ｒ?guī)的劑型，如液態(tài)的溶液或混懸液，適于在注射前制成液態(tài)或混懸液的固體劑型，或乳濁液。適宜的賦形劑是，如水，生理鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等。此外，如果需要，所服用的藥物組合物還可包括少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑，pH緩沖劑等，如醋酸鈉，失水山梨糖醇單月桂酸酯，油酸三乙醇胺等。
當(dāng)用于治療視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可將本發(fā)明的組合物摻入到滴眼劑中，例如將一種或多種A2B腺苷受體拮抗劑與生理上適合的鹽溶液或凝膠結(jié)合，然后將其直接用于正?；咨系难劬χ?。
所服用活性化合物的劑量取決于所治療的患者，患者的體重，疾病的嚴(yán)重程度，給藥方式及處方醫(yī)師的判斷。然而，有效的給藥劑量約為1微克-50毫克/kg/天。更優(yōu)選，有效的給藥劑量約為1微克/kg/天。既然此處所述化合物的許多作用均是通過(guò)相似的機(jī)理獲得的，那么對(duì)于所有這些用途而言，所有給藥劑量通常在相同的一般和優(yōu)選范圍內(nèi)。
一般說(shuō)來(lái)，A2B腺苷受體拮抗劑是用本發(fā)明的方法，以有效治療劑量，即足以達(dá)到有效治療的量給藥的。所服用的活性化合物的量取決于所治療的患者，患者的體重，疾病的嚴(yán)重程度，給藥途徑及處方醫(yī)師的判斷。此外，給藥頻率取決于給藥方法，所治療的疾病，及所治療疾病的嚴(yán)重程度。例如，當(dāng)治療視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞疾病時(shí)，含有A2B腺苷受體拮抗劑的滴眼劑可按照每天1-6次有規(guī)律的時(shí)間表，甚至更頻繁地給藥。
將A2B腺苷受體拮抗劑給予哺乳動(dòng)物，從而治療細(xì)胞增殖疾病的方法不局限于上述公開(kāi)的那些方法，其廣泛地包括本領(lǐng)域已知的，給予哺乳動(dòng)物藥學(xué)活性化合物和治療劑的任何一種方法。
本發(fā)明的范圍還包括通過(guò)其它已知的藥學(xué)給藥途徑，包括但不局限于，通過(guò)大丸藥，靜脈內(nèi)，透皮，吸入，皮下，口服，非腸道，鼻飼，滴眼劑，使用微型泵的方法，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，任何其它的治療劑給藥方法或途徑給予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選給予人本發(fā)明的一種或多種化合物。
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，我們通過(guò)檢測(cè)選擇性A2BAdoR拮抗劑對(duì)AdoR-介導(dǎo)的HREC增殖，毛細(xì)血管的形成及信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑的作用而評(píng)估了A2B的是通過(guò)受體的途徑發(fā)揮作用的。
方法概述在沒(méi)有或有AdoR拮抗劑存在的情況下，使HREC暴露于腺苷類似物5’-N-乙基羧酰胺-腺苷(NECA)中。利用Boyden室測(cè)量遷移率。通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定增殖。AdoR活化對(duì)毛細(xì)血管生成的作用是利用Matrigel上細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)研究的。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)按照前述的方法制備HREC的原代培養(yǎng)細(xì)胞并維持其生長(zhǎng)。，將第3-6代的細(xì)胞用于這些研究。培養(yǎng)中內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定是利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中熒光標(biāo)記的乙酰化LDL的摻入情況確定的，。為了保持HREC的純凈，采取了許多預(yù)防性的步驟。HREC是在來(lái)源于血漿的血清中生長(zhǎng)的，其沒(méi)有血小板衍生的生長(zhǎng)因子，且不會(huì)促進(jìn)外膜細(xì)胞(這類制備方法中的污染細(xì)胞類型)的生長(zhǎng)。此外，在細(xì)胞傳代前，使胰蛋白酶消化HREC的時(shí)間僅為45秒。在此短暫的胰蛋白酶消化過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞漂浮下來(lái)，而外膜細(xì)胞仍然貼附在底物上。增殖的測(cè)定在24孔平板中以10個(gè)細(xì)胞/cm接種HREC，過(guò)夜，使其貼壁。用Hank’s平衡鹽溶液洗滌該細(xì)胞，并用沒(méi)有血清和生長(zhǎng)補(bǔ)給物的培養(yǎng)基(SFM)替換原來(lái)使用的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。再次洗滌該細(xì)胞，并用1U/mL的腺苷脫氨基酶(ADA)預(yù)處理30分鐘。在有或沒(méi)有3-N-丙基黃嘌呤(10μmol/L)或JW-V1-08(10μmol/L)存在的情況下，使細(xì)胞暴露于NECA(10μmol/L)中，相對(duì)于A2B受體，其顯示出比其它有效的拮抗劑更大的選擇性。對(duì)照組是暴露于SFM或標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的HREC。在接下來(lái)的3天，以24-小時(shí)的間隔用胰蛋白酶處理復(fù)制孔，收集細(xì)胞，并用Coulter Counter計(jì)數(shù)。一式三份，在三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中，使用各試驗(yàn)所需的，來(lái)源于不同供體的細(xì)胞檢測(cè)各種情況。趨化性如前所述(Neuroprobe，Inc，Bethesda，MD)，在避光良好的趨化性室中測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞的趨化性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，制備內(nèi)皮細(xì)胞的單細(xì)胞懸液(3.0×10個(gè)細(xì)胞/孔)，并用ADA(1U/mL)處理。在所述避光良好的趨化室下層的48個(gè)孔中每孔加入30微升上述細(xì)胞懸液。用多孔的(5μm直徑的孔)，且沒(méi)有聚乙烯和吡咯烷酮的多聚碳酸酯膜(Nucleopore，Pleasanton，CA)覆蓋所述細(xì)胞孔，用0.1％的真皮膠原包被。倒置趨化室2小時(shí)使所述細(xì)胞附著在膜上。然后垂直放置該室，并使其單獨(dú)暴露于50μL體積的NECA(10μmol/L)中，或使其暴露于與3-N-丙基黃嘌呤結(jié)合或與JW-V1-08(10μmol/L)結(jié)合或與非選擇性的AdoR拮抗劑黃嘌呤胺同源物(XAC，10μmol/L)結(jié)合的50μL體積的NECA(10μmol/L)，中。培養(yǎng)12小時(shí)后，回收該膜，并將附著細(xì)胞一側(cè)膜上的細(xì)胞刮下來(lái)。剩余的細(xì)胞，即已經(jīng)通過(guò)孔遷移的那些，用甲醇固定，并用改良的瑞氏染液染色，然后用蘇木精和曙紅復(fù)染。陽(yáng)性對(duì)照是10％的胎牛血清，陰性對(duì)照是1％的ablumin。應(yīng)答刺激物時(shí)，細(xì)胞遷移做為對(duì)刺激的一種反應(yīng)，其非—定向增加的化學(xué)增活現(xiàn)象是通過(guò)將等濃度的NECA或NECA加一種拮抗劑加入到下層和上層的室中測(cè)量的。處理情況是一式三份，在三個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)中檢測(cè)的。Matrigel測(cè)定內(nèi)皮毛細(xì)血管的生成是在Matrigel上評(píng)估的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，融解Matrigel并在4℃保持。將多孔平板和移液槍槍頭冷凍至-20℃，并將Matrigel(125μL)加入到48-孔板的各個(gè)孔中，使其在37℃最少硬化1小時(shí)。37℃時(shí)，在0.25％胰蛋白酶-EDTA中消化HREC 2分鐘使其分散，離心(300xg，5分鐘)，并在無(wú)血清培養(yǎng)基中重懸浮。制備2X最終濃度的試驗(yàn)試劑(100μL)，每孔加入100μL。然后加入HREC(3×10，100μL/孔)，在37℃培養(yǎng)該平板。接種后48小時(shí)給孔照相。照相是對(duì)各孔的同一區(qū)域進(jìn)行的，以使可能的改變達(dá)到最小，這種改變是由細(xì)胞沉降所引起的細(xì)胞密度的改變導(dǎo)致的。照片是數(shù)字化的，并使用圖像分析軟件(Scion Image)測(cè)量各孔中預(yù)先劃定的相應(yīng)區(qū)域中的總管長(zhǎng)。所有情況均是一式三份，使用不同供體的細(xì)胞，在三個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)中試驗(yàn)的。結(jié)果NECA和AdoR拮抗劑對(duì)細(xì)胞增殖的作用由細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量可知，NECA(10μmol/L)誘導(dǎo)的HREC增殖隨時(shí)間而增加，暴露于標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中3天，可達(dá)到約80％的細(xì)胞密度。所試驗(yàn)的兩種選擇性A2BAdoR拮抗劑，10μmol/L的3-N-丙基黃嘌呤和10μmol/L的JW-V1-08，可完全阻斷NECA的增殖作用(圖1A)。
NECA和AdoR拮抗劑對(duì)HREC遷移的作用采用Boyden室測(cè)定法測(cè)量時(shí)可看出，NECA可誘導(dǎo)HREC的趨化性。NECA可濃度-依賴性的增加遷移率。NECA和選擇性AdoR拮抗劑XAC的同時(shí)加入抵消了NECA誘導(dǎo)的HREC遷移率增加。同樣，NECA與選擇性A2B拮抗劑JW-V1-08或3-N-丙基黃嘌呤的共同加入也拮抗了NECA對(duì)趨化性的誘導(dǎo)作用(圖1B)。NECA單獨(dú)或與AdoR拮抗劑結(jié)合使用時(shí)，均不會(huì)誘導(dǎo)趨化性。
NECA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管生成的作用圖4表示在沒(méi)有或有NECA單獨(dú)存在，或NECA與AdoR拮抗劑相結(jié)合的情況下，Matrigel上，內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管生成的典型顯微照片。與未受刺激的對(duì)照細(xì)胞相比，一些毛細(xì)血管的生成在48小時(shí)后變得明顯(圖2A)。NECA(10μmol/L)處理使毛細(xì)血管的生成延伸(圖2B)，這種延伸可由JW-V1-08抑制(圖2C)。在第48小時(shí)的時(shí)候，3-N-丙基黃嘌呤(圖2D)抑制了毛細(xì)血管的生成，導(dǎo)致少數(shù)血管的長(zhǎng)度變短。
在數(shù)字化照片上，按照像素長(zhǎng)測(cè)量總的血管長(zhǎng)。與未處理的細(xì)胞相比，NECA將管長(zhǎng)增加了2倍以上(分別為74.2±2.4對(duì)35.7±1.6，p＜0.01)。3-N-丙基黃嘌呤或JW-V1-08的加入，減少但未完全抵消NECA-誘導(dǎo)的管長(zhǎng)增加(分別為53.7±0.9和66±1.2，p＜0.01)。
結(jié)論NECA對(duì)增殖的濃度-依賴性誘導(dǎo)可由選擇性的A2BAdoR拮抗劑3-N-丙基黃嘌呤和JW-V1-08所抑制。NECA可濃度-依賴性的誘導(dǎo)趨化作用。兩種拮抗劑均可阻斷NECA對(duì)遷移率的作用。NECA增加了Matrigel上毛細(xì)血管的生成，而兩種A2B選擇性拮抗劑均減弱了這種作用。
上述結(jié)果表明選擇性的A2BAdoR拮抗劑抑制了NECA-誘導(dǎo)的增殖，遷移率增加和毛細(xì)血管生成。對(duì)A2BAdoR的抑制為抑制血管生成，特別是視網(wǎng)膜的血管生成提供了一條新的途徑，為治療與異常的新血管生成，如糖尿病性的視網(wǎng)膜病和早熟的視網(wǎng)膜病等相關(guān)疾病的治療提供了一種新的方法。
實(shí)施例1的結(jié)果還表明腺苷類似物NECA可刺激與血管生成有關(guān)的重要步驟。NECA誘導(dǎo)了細(xì)胞的遷移(通過(guò)Boyden室測(cè)定法評(píng)估)和毛細(xì)血管的生成(通過(guò)Matrigel測(cè)定法評(píng)估)。NECA還誘導(dǎo)了與細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。我們所使用的選擇性A2B拮抗劑減弱或消除了這些作用。這些結(jié)果說(shuō)明選擇性的腺苷A2BAdoR拮抗劑可減弱在糖尿病性的視網(wǎng)膜病中見(jiàn)到的導(dǎo)致異常血管形成的細(xì)胞增殖。因此，A2BAdoR拮抗劑代表了一種新的，減輕異常的視網(wǎng)膜新血管反應(yīng)的治療方法。
權(quán)利要求
1.一種抑制表達(dá)A2B腺苷受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖的方法，包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的A2B腺苷受體拮抗劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中表達(dá)A2B腺苷受體的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中表達(dá)A2B腺苷受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞選自冠狀血管的內(nèi)皮細(xì)胞，及來(lái)源于血管床的內(nèi)皮細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述血管床內(nèi)皮細(xì)胞選自腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，真皮內(nèi)皮細(xì)胞，及腦內(nèi)皮細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是一種A2B腺苷受體的反義寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是一種A2B-特異性核酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是一種非選擇性的腺苷受體拮抗劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是一種選擇性的A2B腺苷受體拮抗劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是以約1微克/kg-50毫克/kg的劑量給藥的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是以約1微克/kg-10毫克/kg的劑量給藥的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體拮抗劑是通過(guò)口服，鼻飼，透皮，大丸劑，靜脈內(nèi)，滴眼劑，吸入，及使用微型泵的方式給藥的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受體激動(dòng)劑是以滴眼劑的方式給藥的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
16.一種確定化合物是否是A2B腺苷受體拮抗劑或A2B腺苷受體激動(dòng)劑的方法，包括下列步驟a.制備人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一和第二份樣品；b.將所要測(cè)試的化合物加入到人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一份樣品中，并使該化合物與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的第一份樣品持續(xù)接觸一定的時(shí)間；并c.比較在第一份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞數(shù)和在第二份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞數(shù)。
17.一種通過(guò)權(quán)利要求16的方法鑒定的A2B腺苷受體拮抗劑化合物，其中所述化合物使得在第一份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞少于在第二份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞。
18.一種通過(guò)權(quán)利要求16的方法鑒定的A2B腺苷受體激動(dòng)劑化合物，其中所述化合物使得在第一份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞多于在第二份樣品中生長(zhǎng)的新細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定A
文檔編號(hào)A61K48/00GK1420775SQ01805150
公開(kāi)日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2001年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者路易斯·貝拉爾迪內(nèi)利, 瑪麗亞·B·格蘭特 申請(qǐng)人:Cv治療公司, 佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)公司