專利名稱：：N-甲基-n-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制備雙特異性蛋白激酶DyrklA抑制劑中的應用。
背景技術(shù)：
：雙特異性蛋白^敫酶(Dualspecificitytyrosine(Y)phosphorylationregulatedkinase,Dyrk)家族成員DyrklA的基因被發(fā)現(xiàn)與唐氏綜合征(Down'ssyndrome,DS)存在著緊密的聯(lián)系。DyrklA基因與果蠅minibrain(Mnb)基因同源，位于人體21號染色體DS關(guān)鍵區(qū)域(21q22.2)，它編碼的蛋白DyrklA廣泛分布于兒童和成人的各個組織中，尤其在腦組織中高表達，對神經(jīng)發(fā)育起重要的作用。DS患者和Ts65Dn小鼠DyrklA的表達含量都明顯比正常的表達水平高，而過表達Dyrk1A的轉(zhuǎn)基因小鼠會出現(xiàn)和DS相似的癥狀，如學習能力下降和記憶缺陷。2006年《nature》中的一篇文章(GwackY，RaoA，Nature.2006Junl;441(7093):646-50)闡述了DyrklA過表達與引起唐氏綜合征相似性癥狀關(guān)系的部分分子機制，指出21號染色體成三倍體后，DyrklA劑量增至正常的1.5倍，可使涉及NFAT轉(zhuǎn)錄因子的信號通道的調(diào)控失去穩(wěn)定性。另一項研究發(fā)現(xiàn)NFATcl-4突變的小鼠會表現(xiàn)出唐氏綜合征的幾乎全部特點。所以，DyrklA是唐氏綜合征的重要靶標，針對它設(shè)計的特異性阻斷劑很有可能成為研究和治療唐氏綜合征的潛在藥物。雙特異性蛋白激酶目前己報道的抑制劑包括茶多酚(EGCG)(Adayev，T.，etal，Biochemistry,2006.45(39》p.12011-9.)、harmin、roscovitine、purvalanol等(Bain,J.，etal，BiochemJ，2007.408(3):p.297-315.)。近期，剛有文章闡述利用EGCG來治療過表達DyrklA轉(zhuǎn)基因小鼠來緩解大腦功能缺陷的文章(Guedj,F.，etal，PLoSONE,2009.4(2):p.e4606)，這說明DyrklA抑制劑應用于臨床治療唐氏綜合征相關(guān)的腦功能缺陷疾病應該有廣闊的應用前景。N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺(N-benzyl-3-chloro-6-methoxy-N-methyl-1-benzothiophene-2-carboxamide)由荷蘭specs公司合成，至今未見該化合物的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供N-甲基^-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制備雙特異性蛋白激酶DyrklA抑制劑中的應用。本發(fā)明提供了N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺作為雙特異性蛋白激酶DyrkA抑制劑的新用途。N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺，化學結(jié)構(gòu)式如下所oN-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩—2-甲酰胺可購自荷蘭Specs公司(網(wǎng)址http:〃www.specs.com/)，是specs公司提供的化合物庫中的化合物，編號AN-329/41189598。N-甲基^-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺經(jīng)過體外激酶活性實驗，其有明顯的抑制DyrklA的作用，在50yM濃度對DyrklA的抑制率為80.9%，高于EGCG在50yM濃度對DyrklA的抑制率(75.39%)，本發(fā)明化合物抑制活性大于EGCG，可以用作DyrklA抑制劑。根據(jù)EGCG作為DyrklA抑制劑應用于臨床治療唐氏綜合征相關(guān)報道，提示N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺何作為制備治療唐氏綜合征的藥物。而且本發(fā)明化合物成本低廉，毒副作用小。圖1是本發(fā)明N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在體外抑制雙特異性蛋白激酶DyrklA的抑制曲線圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述。實施例1:N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺與EGCG體外激酶活性實驗體外激酶活性實驗應用promega公司提供的Kinase-GloPlusLuminescentKinaseAssay試劑盒，實驗步驟嚴格按照試劑盒附帶的說明書操作。步驟如下1、主要試劑和儀器DyrklA購自美國invitrogen公司，PartNumber:PV3785，LotNumber:38993E;Deph-osphorylatedMBP購自美國MILLIPORE公司，Catalog#13-110，Lot#DAM1475041;ATP購自Genebase(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司)，Amresco公司產(chǎn)；Kinase-GloPlusLuminescentKinaseAssay購自美國Promega公司，Catalog#V3771，SystemLot#257740;N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩—2-甲酰胺(本發(fā)明化合物)購自Specs公司；EGCG購自上海安普生物科技有限公司。酶稀釋緩沖液20mMTris(pH7.5)，10%Glycerol,0.02%TritonX-100,O.lmg/mLBSA，0.5mMNa3V04,2mMDTT;酶反應緩沖液25mMTris(pH7.5)，10mMMgC12,0.5mMEGTA，0.5mMNa3V04,2.5mMDTT,0.01%TritonX-100酶標儀為TecanGENios;酶標板為costarRsolidwhite,flat-bottom96-wellplates;水浴鍋為上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)的HHS型電熱恒溫水浴鍋。2、實驗歩驟檢測N-甲基-^節(jié)基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺和陽性化合物對照EGCG在50uM濃度對DyrklA激酶的抑制作用以100Q/o二甲亞砜(DMSO)為溶劑分別將^甲基->^-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺和EGCG配成10mM母液，臨用前用酶反應緩沖液稀釋成250uM(含5%DMSO)。(1)取3個EP管，編號1、2和3，向管1力口入6ul化合物(250"M)，另外2管加入6u1EGCG和含5%DMSO的酶反應緩沖液作陽性和陰性對照；(2)每管加入6u1酶反應緩沖液；(3)向管1和管2中加入6u1濃度為5ng/u1的DyrklA;向管3中加入6U1的酶稀釋緩沖液；(4)每管加入61MBP(lPg/u1);(5)每管加入6ulATP(5uM)，立即混勻；(6)3(TC反應2小時；(7)加入等體積的Kinase-GloRPlusReagent,混勻；(8)室溫避光反應IO分鐘；(9)點樣于costarRsolidwhite,flat-bottom96-wellplates中；(10)用酶標儀測相對熒光單位(relativeluminescentunit,RLU)，測定參數(shù)integrationtime值為lOOOms，Gain值為150。(11)計算化合物對DyrklA磷酸化的抑制率，用如下公式I=[RLU(DyrklA+MBP+EGCG+ATP+Reagent)-RLU(DyrklA+MBP+ATP+Reagent)]/[RLU(M畫BP+ATP+Reagent)-RLU(Dyrk1A+MBP+ATP+Reagent)]X100%3、實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>EGCG在50uM濃度對DyrklA的抑制率為75.39%，本發(fā)明化合物在50uM濃度對DyrklA的抑制率為80.9%，抑制活性大于EGCG。實施例2:不同濃度N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺體外激酶活性實驗1、主要試劑和儀器同實施例l2、實驗步驟對N-甲基_^-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在不同濃度下對DyrklA抑制活性做了量效分析仿照實例1的實驗步驟，將本發(fā)明化合物設(shè)置六個不同的終濃度(1)1.5625uM;(2)3.125yM;(3)6.25yM;(4)12.5線(5)25線(6)50線(7)100線每個濃度實驗重復三次。3、實驗結(jié)果得到的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>抑制曲線如圖1;并根據(jù)上述結(jié)果計算出N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺對DyrklA的IC50=6.39uM。本發(fā)明經(jīng)實驗表明，N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺對DyrklA有明顯的抑制作用，所以N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺可以用作DyrklA抑制劑。繼而提示N-甲基-N-節(jié)基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺可以作為制備治療唐氏綜合征的藥物。本發(fā)明具有良好的藥物應用前景。權(quán)利要求1、N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制備雙特異性蛋白激酶Dyrk1A抑制劑中的應用。2、N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制備治療唐氏綜合征藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。雙特異性蛋白激酶Dyrk1A的基因被發(fā)現(xiàn)與唐氏綜合征存在著緊密的聯(lián)系，雙特異性蛋白激酶目前已報道的抑制劑有EGCG、harmin、roscovitine、purvalanol等。本發(fā)明提供了N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制備雙特異性蛋白激酶Dyrk1A抑制劑中的應用。N-甲基-N-芐基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺經(jīng)過體外激酶活性實驗，證明其有明顯的抑制Dyrk1A的作用，抑制活性大于EGCG。文檔編號A61P25/00GK101524350SQ200910049630公開日2009年9月9日申請日期2009年4月21日優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日發(fā)明者朱維良,迪王,非王,王紅陽,蔣華良,談冶雄申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學;中國科學院上海藥物研究所