專利名稱：一種負載輔酶q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備負載脂溶性藥物的納米載藥粒子，具體涉 及一種負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
輔酶Q10又稱泛醌，是一種細胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑，安全無 毒，能提高有機體的免疫力。將輔酶QIO用于人體皮膚的抗氧化和活化 劑，在老年皮膚中具有實質(zhì)功效，是一種既可作為藥物也可以作為保健 品的優(yōu)良抗衰老物質(zhì)。然而輔酶QIO的水溶性及光穩(wěn)定性較差，使其應(yīng) 用受到影響，選擇適宜的聚合物載體對輔酶QIO進行包埋并制備成納米 粒子，用于藥物的傳遞和控釋，具有超微體積，能夠直接作用于細胞， 增加藥物穩(wěn)定性、延長藥物療效的特點。
在常用的聚合物載體材料中，人工合成的聚肽共聚物和天然生物材 料殼聚糖以其作為藥物載體材料顯現(xiàn)出的優(yōu)良綜合性能為人們所關(guān)注。 對于上述兩種藥物傳輸和控釋載體，目前的研究主要是停留在單一的載 藥體系。然而對于單一的兩親性聚肽-聚乙二醇嵌段共聚物載體，最大的 缺點是穩(wěn)定性較差，易聚集。而單一殼聚糖載體的缺點是對包埋脂溶性 的藥物有限制。
現(xiàn)有用于制備納米載藥膠束的兩親性聚肽共聚物為聚-L-谷氨酸-Y-芐酯一聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段，其結(jié)構(gòu)如下-
4<formula>formula see original document page 5</formula>其中R為芐基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中藥物載體材料停留在單一的 載藥體系，且單一載藥體系穩(wěn)定性較差，易聚集等缺點提出一種負載輔
酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒及其制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)原理
一種以兩親性聚肽共聚物為聚-L-谷氨酸個芐酯一聚乙二醇 (PBLG-b-PEG)嵌段和殼聚糖復(fù)合體系為藥物載體，以疏水性輔酶QIO 為活性物質(zhì)的含有輔酶QIO的復(fù)合納米粒子，從而獲得具有更高穩(wěn)定性、 可緩釋、生物相容性好的輔酶QIO納米疏水藥物粒子。
本發(fā)明的技術(shù)方案
一種負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒制備方法，包括如下步
驟
(1)、室溫下將聚-L-谷氨酸-Y-芐酯一聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共 聚物和輔酶QIO混合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)與四氫呋哺CTHF) 的混合溶劑中；待完全溶解后放入透析袋，在去離子水流中透析 72h，除去有機溶劑，再離心分離，控制離心時的轉(zhuǎn)速為5000r/min， 時間為10min，除去未包埋藥物輔酶Q10，上層清液用直徑為 0.45pm的濾膜過濾，即得輔酶QlO-聚肽載藥膠束溶液；
其中聚-L-谷氨酸-，芐酯一聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共 聚物和輔酶Q10混合物按聚-L-谷氨酸個芐酯一聚乙二醇 (PBLG-b-PEG)嵌段共聚物與輔酶Q10的質(zhì)量比1~24: 1 30 混合；其中二甲基甲酰胺(DMF)與四氫呋哺(THF)的混合溶劑按二 甲基甲酰胺(DMF)溶液與四氫呋哺(THF)溶液的體積比為7: 3混 合.
其中聚-L-谷氨酸-"芐酯一聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共 聚物和輔酶Q10混合物占二甲基甲酰胺(DMF)/四氫呋哺(THF)混 合溶劑的重量體積百分比為1:25;
其中所用的聚-L-谷氨酸-y -芐酯一聚乙二醇(PBLG-b-PEG) 嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)式為
—N H~C H~C O AN H~K H 2C H 20 JsrC H 3 CH2
COOR
其中R為芐基；
(2)、將步驟(1)制備好的輔酶Q10-聚肽載藥膠束溶液，加入濃度為 4. 5mg/mL的醋酸調(diào)節(jié)pH值為5. 0，得含輔酶QlO-聚肽的醋酸溶 液；同時將殼聚糖溶于相同pH值的醋酸溶液中，殼聚糖與醋酸溶 液按重量體積比為3: 1 2混合，待殼聚糖完全溶解后，得殼聚 糖的醋酸溶液； 將上述輔酶QlO-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖的醋酸溶液按體積 比為2:1混合并攪拌，轉(zhuǎn)速600r/min，邊攪拌邊滴加濃度為0. 5 1.5mg/mL三聚磷酸鈉(TPP)溶液，即得負載輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子；
三聚磷酸鈉(TPP)溶液的滴加量控制在其與上述輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖的醋酸溶液的混合液的體積比為1: 1。 本發(fā)明所得的負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒中的粒子的 粒徑為80nm 900nm，符合正態(tài)分布，粒子的平均載藥率為2 20%之間，包封率為30 70%之間。 本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明在原有單一聚肽基礎(chǔ)上體系中引入了正負電荷，由于電荷在 聚肽膠束表面的吸附以及相同電荷間的排斥作用，使新生成的納米粒子 之間穩(wěn)定性更高，避免了粒子間的聚集現(xiàn)象。同時由于殼層載體的厚度 比單一聚肽有所增加，體系72小時的累積釋放量有所降低，說明該復(fù)合 體系的緩釋效果好于原有單一體系。該復(fù)合體系還改變了單一殼聚糖體 系不宜負載油溶性藥物的缺點。
綜上所述，本發(fā)明一種以兩親性聚肽嵌段共聚物和殼聚糖復(fù)合體系 為藥物載體，以疏水性輔酶Q10為活性物質(zhì)的含有輔酶Q10的復(fù)合納米 粒子，從而獲得具有更高穩(wěn)定性、可緩釋、生物相容性好的輔酶Q10納 米疏水藥物粒子。


圖l、是本發(fā)明所述含輔酶Q10復(fù)合納米粒子經(jīng)磷鉤酸染色后的電鏡
照片
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明進行說明，但并不限制本發(fā)明。 納米粒子的累積釋放率、粒子的載藥率、包封率采用紫外光譜來定 量分析。
即將輔酶Q10及包埋輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子分別按制 備用量超聲破碎并加DMF進行溶解，在190 500nm范圍內(nèi)進行掃描。結(jié) 果表明，輔酶Q10在275 nm處有最大吸收，壁材不干擾測定。以DMF為 空白，于275mn測定吸光值A(chǔ)，繪制輔酶Q10濃度-吸光值標(biāo)準曲線，得 線性回歸方程為A二15255.7367C—0.0915，其中R二0.9971; C:輔酶Q10
7的濃度，單位g/mL。
在環(huán)境溫度(37士1)-C, (80±5)次/分振蕩器中，量取經(jīng)洗滌分散 后的輔酶Q10復(fù)合納米粒子溶液5mL放入密封的透析袋中，在pH=7. 4的 5 mL模擬體液-磷酸鹽緩沖溶液中緩釋，定時更換介質(zhì)，然后將緩釋出 來的含有輔酶Q10的緩沖體液凍干后用DMF溶液溶解過濾并定容，用紫 外分光光度計測定275 nm處的吸光度值。更換介質(zhì)，測定不同時間緩沖 溶液中釋放的輔酶Q10的吸光值，根據(jù)吸光值按同等條件下測定的輔酶 Q10濃度代入回歸方程計算釋藥量及釋藥速率。
同樣方法將制備的納米載藥微粒經(jīng)離心分離后凍干并精確稱重，取 此稱重后的載藥納米粒子用DMF溶解并定容至10.0 mL，用紫外分光光 度計進行測試。將測得的數(shù)據(jù)代入回歸方程計算得載藥率和包封率。 實施例l
室溫下將2. 5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和3mg輔酶Q10混合物溶 于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氫呋哺(THF)混合溶劑中，完全溶解后 放入透析袋，在去離子水流中透析72h，并每3h替換一次新鮮去離子水， 除去有機溶劑。在去離子水中透析后，離心分離除去未包埋藥物，上層 清液用直徑為0. 45 u m的濾膜過濾，得到載藥膠束溶液。
量取20mL的已制備好的輔酶Q10-聚肽自組裝納米溶液，加入醋酸， 使其醋酸濃度為1. 5mg/mL，同時將15mg殼聚糖溶于相同濃度的lOmL醋 酸溶液中，待殼聚糖完全溶解后，將輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖 的醋酸溶液混合攪拌，邊攪拌邊滴加濃度為1.5mg/mL的三聚磷酸鈉 (TPP)溶液30mL，制得包埋輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子。所 得的含輔酶Q10復(fù)合納米載藥微粒呈球形，具有明顯的殼-核結(jié)構(gòu)，為 0/W型粒子。納米粒子粒徑大小在80nm到300nm之間，符合正態(tài)分布。 體系的ZETA (電動電位)電位為50.9mV，該復(fù)合體系穩(wěn)定性較好。在5h之內(nèi)存在突釋，然后呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢，72小時的累積釋放率為 75.0%，粒子的載藥率為3.46±0. 3%，包封率為59. 7±2. 1%。 實施例2
室溫下將2. 5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和8mg輔酶Q10混合物溶 于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氫呋哺(THF)混合溶劑中，完全溶解后 放入透析袋，在去離子水流中透析72h，并每3h替換一次新鮮去離子水， 除去有機溶劑。在去離子水中透析后，離心分離除去未包埋藥物，上層 清液用直徑為0.45um的濾膜過濾，得到載藥膠束溶液。
量取20mL的己制備好的輔酶Q10-聚肽自組裝納米溶液，加入醋酸， 使其醋酸濃度為1. 5mg/mL，同時將30mg殼聚糖溶于相同濃度的lOmL醋 酸溶液中，待殼聚糖完全溶解后，將輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖 的醋酸溶液混合攪拌，邊攪拌邊滴加濃度為1.5mg/mL的三聚磷酸鈉 (TPP)溶液30mL，制得包埋輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子。所 得的含輔酶Q10復(fù)合納米載藥微粒呈球形，具有明顯的殼-核結(jié)構(gòu)，為 0/W型粒子。納米粒子平均粒徑大小為8S7nm，符合正態(tài)分布。粒子的平 均載藥率為4. 52%，包封率為35. 14%。 實施例3
室溫下將2. 5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和2. 5mg輔酶Q10混合物 溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氫呋哺(THF)混合溶劑中，完全溶解 后放入透析袋，在去離子水流中透析72 h，并每3 h替換一次新鮮去離 子水，除去有機溶劑。在去離子水中透析后，離心分離除去未包埋藥物， 上層清液用直徑為0. 45 ii m的濾膜過濾，得到載藥膠束溶液。
量取20mL的已制備好的輔酶Q10-聚肽自組裝納米溶液，加入醋酸， 使其醋酸濃度為1. 5mg/mL，同時將30mg殼聚糖溶于相同濃度的10mL醋 酸溶液中，待殼聚糖完全溶解后，將輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖的醋酸溶液混合攪拌，邊攪拌邊滴加濃度為0.5mg/mL的三聚磷酸鈉 (TPP)溶液30mL，制得包埋輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子。所 得的含輔酶Q10復(fù)合納米載藥微粒呈球形，具有明顯的殼-核結(jié)構(gòu)，為 0/W型粒子。納米粒子平均粒徑大小為305nm之間，符合正態(tài)分布。粒 子的平均載藥率為2. 74%，包封率為67. 23%。
權(quán)利要求
1、一種負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)、室溫下將聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和輔酶Q10混合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)與四氫呋哺(THF)的混合溶劑中；待完全溶解后放入透析袋，在去離子水流中透析72h，除去有機溶劑，再離心分離，控制離心時的轉(zhuǎn)速為5000r/min，時間為10min，除去未包埋藥物輔酶Q10，上層清液用直徑為0.45μm的濾膜過濾，即得輔酶Q10-聚肽載藥膠束溶液；其中聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和輔酶Q10混合物按聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物與輔酶Q10的質(zhì)量比1～24∶1～30混合；其中二甲基甲酰胺(DMF)與四氫呋哺(THF)的混合溶劑按二甲基甲酰胺(DMF)溶液與四氫呋哺(THF)溶液的體積比為7∶3混合；其中PBLG-b-PEG(聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇)嵌段共聚物和輔酶Q10混合物占二甲基甲酰胺(DMF)/四氫呋哺(THF)混合溶劑的重量體積百分比為1∶25；其中所用的聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)式為其中R為芐基；(2)、將步驟(1)制備好的輔酶Q10-聚肽載藥膠束溶液，加入濃度為4.5mg/mL的醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.0，得含輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液；同時將殼聚糖溶于相同pH值的醋酸溶液中，殼聚糖與醋酸溶液按重量體積比為3∶1～2混合，待殼聚糖完全溶解后，得殼聚糖的醋酸溶液；將上述輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖的醋酸溶液按體積比為2∶1混合并攪拌，轉(zhuǎn)速600r/min，邊攪拌邊滴加濃度為0.5～1.5mg/mL三聚磷酸鈉(TPP)溶液，即得負載輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子；三聚磷酸鈉(TPP)溶液的滴加量控制在其與上述輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液和殼聚糖的醋酸溶液的混合液的體積比為1∶1。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的一種負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米 粒制備方法，其特征在于所得的負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納 米粒中的粒子的粒徑為80nm 900nm，符合正態(tài)分布，粒子的平均載 藥率為2~20%之間，包封率為30~70%之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種負載輔酶Q10的聚肽-殼聚糖復(fù)合納米粒其制備方法。即室溫下將聚-L-谷氨酸-γ-芐酯—聚乙二醇嵌段共聚物和輔酶Q10混合后溶于二甲基甲酰胺與四氫呋哺的混合溶劑中；后經(jīng)透析、離心分離等，上層清液過濾，得輔酶Q10-聚肽載藥膠束溶液，加入醋酸調(diào)節(jié)pH值；同時將殼聚糖溶于相同pH值的醋酸溶液中并與上述輔酶Q10-聚肽的醋酸溶液混合后滴加三聚磷酸鈉溶液，即得負載輔酶Q10的殼聚糖-聚肽復(fù)合納米粒子，粒子的粒徑為80～900nm，平均載藥率為2～20％之間，包封率為30～70％。本發(fā)明所得的納米粒子，具有更高穩(wěn)定性、可緩釋、生物相容性好的輔酶Q10納米疏水藥物粒子。
文檔編號A61K47/48GK101530394SQ20091004954
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者健 張, 章蘇寧, 賀振穎 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院