4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化應(yīng)激（Oxidative Stress)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo) 致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是破壞了強(qiáng)氧 化劑和抗氧化劑的平衡導(dǎo)致的潛在傷害，氧化劑、抗氧化劑平衡的破壞是細(xì)胞損傷的主要 原因。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一 個(gè)重要因素。另外，腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI) 是缺血性腦血管?。↖schemic cerebrovascular diseases，ICVD)的主要病理過程，而氧化 應(yīng)激（oxidative stress，OS)是造成CIRI的重要因素，因此，抗氧化應(yīng)激損傷對(duì)ICVD的治 療及預(yù)后也具有重要意義。
[0003] 4-甲氧基芐醇，無色或微黃色液體。熔點(diǎn)23-25.5°C，沸點(diǎn)159°C，相對(duì)密度 1. 113 (15/15°C )，折光率1. 5442。易溶于醇和醚，幾乎不溶于水，其化學(xué)式為：C8H1(l02,結(jié)構(gòu) 式為、。。目前4-甲氧基芐醇通常作為食用香料食用，未見其用于抗氧化的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑中的用途。
[0005] 抗氧化劑（AOA)也叫清除劑，是一類能夠抑制或阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的啟動(dòng)和增 生（蔓延）過程，降低自由基濃度，延緩哀老進(jìn)程，提高生命活力的化合物。
[0006] 本發(fā)明首先提供了 4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。
[0007] 進(jìn)一步地，所述抗氧化劑類藥物是抗氧化損傷的藥物。
[0008] 更進(jìn)一步地，所述抗氧化損傷的藥物是預(yù)防和/或治療氧化應(yīng)激損傷的藥物。
[0009] 再進(jìn)一步地，所述藥物是降低ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗細(xì) 胞凋亡的藥物。
[0010] ROS :活性氧；SOD :超氧化物歧化酶活力；GSH :谷胱甘肽。
[0011] 其中，所述制劑為口服制劑。
[0012] 其中，所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種抗氧化損傷的藥物，它是以4-甲氧基芐醇為活性成分，加上 藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0014] 所述制劑為口服制劑。
[0015] 4-甲氧基芐醇可通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗 細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗氧化損傷的作用，從而提高細(xì)胞存活率，可以制備成為抗氧化劑，用于預(yù)防 抗氧化損傷，應(yīng)用前景良好。
[0016] 下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【附圖說明】
[0017] 圖1 4-甲氧基芐醇對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞后MMP變化（40 X 10)。
[0018] 圖2 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)!1202致PC12細(xì)胞氧化損傷后。Caspase-9、Caspase-12、 Caspase-3 表達(dá)的影響（注：lControl、2Model、3Eda-160、4MA-20、5MA-40、6MA-80) 〇
[0019] 圖3 4-甲氧基芐醇對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化損傷后ERK1/2、P-ERK1/2、JNK、P-JNK、 p38、P-p38 蛋白表達(dá)的影響。（注：lControl、2Model、3Eda-160、4MA-20、5MA-40、6MA-80、 7Model+抑制劑、8Eda-160+抑制劑、9MA-20+抑制劑、10MA-40+抑制劑、11MA-80+抑制劑）。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)驗(yàn)例1 4-甲氧基芐醇的抗氧化作用
[0021] 第一部分、抗氧化損傷的作用
[0022] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0023] I. 1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
[0024] 高分化大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株（PC12細(xì)胞），購自中國科學(xué)院上海生命科 學(xué)研宄院。
[0025] 1.2實(shí)驗(yàn)藥品
[0027] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑
[0028]
[0032] I. 5· 1完全培養(yǎng)基
[0033] FBS與改良型RPMI-1640培養(yǎng)基以1:9的比例，配制為含10% FBS的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入l〇〇U/mL青霉素-鏈霉素溶液，密封4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] I. 5. 2PBS 緩沖液
[0035] 取9. 88g PBS液混合干粉溶解于IL雙蒸水，完全溶解后調(diào)PH至7. 4,過濾除菌， 4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] I. 5· 3MTT 溶液
[0037] MTT干粉0. 25g，加50mL PBS緩沖液，完全溶解后過濾除菌，2mL分裝，-20°C保存 備用，全程避光操作。
[0038] 1. 5· 4H202造模液
[0039] 取30% H2O2原液ImL加入9mL無菌雙蒸水，輕輕混勾，取混勾后的H2O 2液0· ImL加 入9. 9mL無菌雙蒸水，輕輕混勾，再取第二次混勾后H2O2液ImL加入9mL無菌雙蒸水，輕輕 混勻即得H 2O2造模液的高濃度儲(chǔ)備液（lmmol/L)，配制過程和配制后的各濃度H2O 2溶液皆 注意嚴(yán)格避光和無菌操作，并貼好標(biāo)簽4°C避光保存，臨用前取H2O2造模液的高濃度儲(chǔ)備液 按1 : 19的比例加入到37°C溫?zé)徇^的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中輕輕混勻多次，即得濃度 為50 μ mol/L的H2O2造模液，H 202造模液現(xiàn)配現(xiàn)用，需多少配多少。
[0040] 1. 6藥物配制
[0041] 1. 6. 1 4-甲氧基芐醇
[0042] 精密稱取適量4-甲氧基芐醇加入DMSO配制成8. 0 X IO4 μ g/mL的高濃度儲(chǔ)備液， 每管30 μ L定量分裝，-20°C避光保存，實(shí)驗(yàn)前取一管用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋配制 成所需給藥濃度組的最高濃度，過濾除菌，用此濃度依次稀釋成所需的其余給藥組濃度，務(wù) 必保證每個(gè)組的DMSO終濃度一致，并且終濃度小于0. 2 %。
[0043] 1. 6. 2 依達(dá)拉奉（Edaravone Injection)
[0044] 依達(dá)拉奉是一種腦保護(hù)劑（自由基清除劑），抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷.
[0045] 精密稱取依達(dá)拉奉32mg加入到20mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，在55°C的水浴 中輕輕攪拌至全部溶解，于無菌生物安全柜中過濾除菌，即得濃度為I. 6mg/mL的依達(dá)拉奉 儲(chǔ)備液，4°C避光保存，臨用前按所需濃度換算稀釋比例，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行 稀釋給藥。
[0046] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0047] 2. 1PC12細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)與凍存
[0048] 2. I. 1PC12細(xì)胞的復(fù)蘇
[0049] 從-80 °C冰箱中取出一支PCl2細(xì)胞凍存管立即放入37 °C水中快速振搖，直至完全 融化，噴淋75 %酒精消毒外壁，于生物安全柜中將細(xì)胞懸液移入裝有5mL完全RPMI-1640培 養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37°C、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的0)2培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)，4h后換液，過夜后再換液。
[0050] 2. I. 2PC12細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0051] 待復(fù)蘇培養(yǎng)的PC12細(xì)胞長(zhǎng)至70 %-80 %的貼壁率時(shí)，棄原培養(yǎng)基，取2mL PBS液清 洗一次，加入0. 25%胰酶2mL置于培養(yǎng)箱中消化3min，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫離瓶壁，顯微鏡 下觀察當(dāng)細(xì)胞收縮變圓，脫離瓶壁后，加入2mL完全RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，以1000 r/ min離心5min，棄上層液體，加入2mL完全RPMI-1640培養(yǎng)基，均勻吹打分散細(xì)胞制成細(xì)胞 懸液，分瓶傳代，傳代培養(yǎng)過程中，約2d更換一次新鮮培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí) 驗(yàn)。
[0052] 2. I. 3PC12細(xì)胞的凍存
[0053] 當(dāng)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按2. 1. 2所述方法制成細(xì)胞濃度為IO6級(jí)的細(xì) 胞懸液，在每個(gè)I. 5mL的凍存管中加入0. 9mL懸液和0.1 mL 100 %的DMS0,吹打均勻，將密 封好的凍存管放入程序降溫盒中直接放入-80 °C冰箱，過夜后移入-80°C冰箱里普通凍存 盒內(nèi)保存。
[0054] 2. 2 4-甲氧基芐醇對(duì)氧化損傷PC12細(xì)胞存活率的影響
[0055] 2. 2. 1 方法
[0056] 當(dāng)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按2. 1. 2所述方法制成細(xì)胞濃度為3 X IO4個(gè)/ mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板上，置于37 °C、5 % CO2、95 %空氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)24h后，分為正常對(duì)照組、H2O2損傷、依達(dá)拉奉組（160 μ g/m