r)
[0127] 精確稱取溴酚藍(lán)0. 04g，SDS 0. 8g，加入4mL甘油混勾，再加入I. 0mol/L Tris · HCl(pH6.8)2mL，最后用雙蒸水定容至10mL，lmL分裝，4°C保存。使用時稀釋成IX。
[0128] 1.5. 6 封閉液
[0129] 精確稱取5g脫脂奶粉，溶于IX TBST緩沖液，完全溶解后用IX TBST緩沖液定容 至60mL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0130] L 5. 7 二硫蘇糖醇（DTT) (10X)
[0131] 精確稱取DTT3. 09g，用20mL 0.0 lmol/L乙酸鈉溶液（pH5. 2)溶解，分裝成ImL小 份儲存于_20°C，使用時稀釋成IX。
[0132] 1.5. 8 裂解液
[0133] 按RIPA裂解液：PMSF = 99 :1的比例，配制細(xì)胞裂解液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0134] 2實驗方法
[0135] 2.1蛋白樣本制備
[0136] 當(dāng)PC12細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，按第一部分2. 1. 2所述方法制成細(xì)胞濃度為 2父105個/1^的細(xì)胞懸液，接種于6孔板上，置于37°0、5%0) 2、95%空氣、飽和濕度的0)2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，分為正常對照組、H2O2損傷組、依達(dá)拉奉組（160 μ g/mL)和4-甲氧基 芐醇（20 μ g/mL、40 μ g/mL、80 μ g/mL)三個劑量組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別給藥24h后，除正 常對照組外，其余各組均加入100 μ mol/L的H2O2造模液，損傷2h，用PBS清洗1次，每孔加 入60 μ L裂解液，冰浴裂解5min，收集細(xì)胞裂解液，4°C離心（12000r/min，5min)，取上清液， 分出5 μ L用于蛋白定量，其余密封煮沸10min，每13 μ L蛋白樣品加入4X上樣緩沖液5 μ L 和DTT 2 μ L混勻，30 μ L分裝，-80 °C冰箱保存。
[0137] 2. 2SDS-PAGE 電泳
[0138] 2. 2. ISDS-PAGE 膠的配制
[0139] 按SDS-PAGE凝膠試劑盒的說明書配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，如下表：
[0140] 表6SDS-PAGE膠的配制
[0142] 2. 2. 2 灌膠
[0143] 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在制膠架上，固定穩(wěn)妥，灌注SDS-PAGE 分離膠，到合適高度時，用雙蒸水密封。待分離膠凝固后，棄去水層，灌注SDS-PAGE濃縮膠， 插入梳子。待濃縮膠凝固后，置入電泳槽中，加入IX電泳緩沖液，拔出梳子。
[0144] 2. 2. 3 上樣
[0145] Marker 5 μ L
[0146] 樣本 10 μ L左右
[0147] 每個上樣孔等質(zhì)量上樣，Marker電泳后出現(xiàn)10條帶：10，15,25,35,40,55,70， 100,130,170Kda。
[0148] 2. 2. 4 電泳
[0149] 按連接指示連接好正負(fù)極，開始電泳，電壓為150V，濃縮膠時電泳電流為35mA，至 樣品至濃縮膠與分離膠分界線時，電流調(diào)整為80mA，電泳至溴酚藍(lán)指示劑在最底端時停止。
[0150] 2. 2. 5 轉(zhuǎn)膜
[0151] 停止電泳后，根據(jù)Marker的預(yù)染條帶切割SDS-PAGE分離膠至合適大小，將與膠 大小相同的2張濾紙和1張 PVDF膜浸泡在轉(zhuǎn)膜液中約10分鐘，PVDF膜浸泡前置入無水甲 醇中激活lOmin，按照濾紙-PVDF膜-膠-濾紙的順序由下到上組裝好，置于轉(zhuǎn)膜裝置內(nèi)， 220mA 轉(zhuǎn)膜 40min。
[0152] 2. 2. 6 封閉
[0153] 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，封在封閉液中，室溫?fù)u床震動lh。
[0154] 2. 2. 7抗體孵育
[0155] 將一抗用封閉液粉稀釋至適當(dāng)濃度，將膜封好在一抗稀釋液中，使蛋白面朝上放 在搖床上，4°C孵育過夜，次日用IX TBST在室溫下?lián)u床上洗三次，每次5min。將膜封好在二 抗稀釋液中，使蛋白面朝上放在搖床上，室溫下孵育Ih后，用IX TBST在室溫下?lián)u床上洗三 次，每次5min。
[0156] 表7抗體稀釋比例
[0157]
[0158] 2. 2. 8 顯色
[0159] ECL顯色液A與B等量混合，加在膜上，用MultiSpectral Image system拍照記 錄，用Photoshop和Image處理條帶，得結(jié)果。
[0160] 2. 8. 9數(shù)據(jù)處理
[0161] 實驗所得的數(shù)據(jù)用SPSS19. 0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差土s)表 示，采用單因素方差分析（one-way AN0VE)，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane ' ！^檢 驗，以P < 0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0162] 3實驗結(jié)果
[0163] 與正常組比較，模型組Caspase-9、Caspase-12和Caspase-3表達(dá)增加 （P < 0· 05 或 P < 0· 01)，與模型組比較，依達(dá)拉奉 160 μ g/mL 對 Caspase-9、Caspase-12 和 Caspase-3的表達(dá)均有抑制作用（P <0· 05) ;4-甲氧基節(jié)醇各給藥組也能抑制Caspase-9、 Caspase-12 和 Caspase-3,其中，對 Caspase-9 和 Caspase-3 的抑制效果顯著（P < 0· 05 或 P < 0.01)，結(jié)果見圖2,表8。
[0164] 表84-甲氧基節(jié)醇對!1202致PC12細(xì)胞氧化損傷后Caspase-9、Caspase-12、 Caspase-3表達(dá)的影響（^:士心η = 6)
[0166] 注：與Control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義#Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05
[0167] 與Model組比較有統(tǒng)計學(xué)意義##Ρ〈0. 01，#Ρ〈0. 05
[0168] 第三部分4-甲氧基芐醇對氧化應(yīng)激損傷PC12細(xì)胞MAPK信號通路的影響
[0169] 1實驗材料
[0170] 1.1實驗細(xì)胞
[0171] 同第一部分。
[0172] 1.2實驗藥品
[0173] 同第一部分。
[0174] 1.3實驗試劑
[0176] 1.4實驗儀器
[0177] 同第二部分。
[0178] 1.5試劑配制
[0179] L 5. 1PD98059 (20mmol/L)
[0180] 稱取 5. 3456mg PD98059，用 ImLDMSO 溶解，過濾，0· ImL 分裝，-80 °C 保存?zhèn)溆谩?br>[0181] I. 5. 2SP600125(20mmol/L)
[0182] 稱取 4. 4046mg SP600125,用 ImLDMSO 溶解，過濾，0· ImL 分裝，-80°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0183] L 5. 3SB203580 (20mmol/L)
[0184] 稱取 7. 5476mg SP600125,用 ImLDMSO 溶解，過濾，0· ImL 分裝，-80°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0185] 其余同第二部分。
[0186] 2實驗方法
[0187] 2.1細(xì)胞存活率
[0188] 2. Ll 方法
[0189] 當(dāng)PC12細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，按第一部分2. 1. 2所述方法制成細(xì)胞濃度為 3X IO4個/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板上，置于37°C、5% CO 2、95%空氣、飽和濕度的CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，分為正常對照組、H2O2損傷組、依達(dá)拉奉組（160 μ g/mL)、4-甲氧基芐 醇（20 μ g/mL、40 μ g/mL、80 μ g/mL)三個劑量組和抑制劑組（正常+抑制劑、H2O2+抑制劑、 Eda-160+抑制劑、MA-20+抑制劑、MA-40+抑制劑、MA-80+抑制劑），每組設(shè)6個復(fù)孔，分別 給藥24h后，抑制劑組分別加入50 ymol/L PD98059、SP60012、SB203580孵育lh，除正常對 照組外，其余各組均加入50 μ mol/L的H2O2造模液，損傷2h，然后小心吸棄原培養(yǎng)液，沿孔 壁邊緣緩慢加入含血清RPMI-1640培養(yǎng)液，置于CO 2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)42h，以MTT法測定 細(xì)胞存活率。
[0190] 2. 1.2 結(jié)果
[0191] 結(jié)果顯示，加入ERK1/2抑制劑Η)98059、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑 SB203580后，與各給藥組比較，抑制劑組細(xì)胞存活率明顯降低（P < 0. 01)，結(jié)果見表9。
[0192] 表9細(xì)胞存活率（X±5·，η = 6)
[0194] 注：與Control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義#Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05 ;與Model組比較有統(tǒng)計 學(xué)意義 ##Ρ〈〇· 〇1，#Ρ〈〇· 05 ;
[0195] 與Eda-160組比較有統(tǒng)計學(xué)意義$ $ Ρ〈0. 01 ;與ΜΑ-20組比較有統(tǒng)計學(xué)意義 ▲▲Ρ〈0·