01 ;
[0196] 與ΜΑ-40組比較有統(tǒng)計學意義__P〈0. 01 ;與ΜΑ-80組比較有統(tǒng)計學意義^?〈0. 01
[0197] 2. 2 4-甲氧基芐醇對 ERKl/2、P-ERKl/2、JNK、P-JNK、p38、P-p38 蛋白表達的影響
[0198] 2. 2.1 方法
[0199] 當PC12細胞生長至對數(shù)生長期時，按第一部分2. 1. 2所述方法制成細胞濃度為 2父105個/1^的細胞懸液，接種于6孔板上，置于37°0、5%0) 2、95%空氣、飽和濕度的0)2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，實驗分組及給藥同上，造模2h后，提取蛋白樣品，進行Western-blot分 析，相關(guān)操作步驟同第二部分。
[0200] 抗體稀釋比例
[0201]
[0202] 2· 2· 1 結(jié)果
[0203] 與正常組比較，模型組P-ERKl/2、P-JNK、P-p38蛋白表達增加 （Ρ < 0. 01);與模型 組比較，依達拉奉160yg/mL組P-ERK1/2、Ρ-ρ38蛋白表達增加 （Ρ < 0. 01或P < 0. 05)， 并抑制P-JNK蛋白表達（Ρ < 0. 01)，4_甲氧基芐醇能增加 P-ERK1/2蛋白表達（Ρ < 0. 01 或 P < 0· 05)，抑制 P-JNK 蛋白表達（Ρ < 0· 01)，PD98059、SP600125、SB203580 預處理后， 細胞中P-ERK1/2、P-JNK、Ρ-ρ38蛋白的表達被明顯抑制（Ρ < 0. 01或P < 0. 05);各組間 ERK1/2、JNK、p38蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異。結(jié)果見圖3,表10。
[0204] 表10 4-甲氧基芐醇對H2O2致PC12細胞氧化損傷后ERK1/2、JNK、p38蛋白表達 的影響（X ±5·，η = 3)
[0205]
[0206] 注：與Control組比較有統(tǒng)計學意義#Ρ〈(λ 01，*Ρ〈(λ 05 ;與Model組比較有統(tǒng)計 學意義 ##Ρ〈〇· 〇1，#Ρ〈〇· 01
[0207] 與Eda-160組比較有統(tǒng)計學意義$ $ Ρ〈0. 01 ;與ΜΑ-20組比較有統(tǒng)計學意義 ▲▲Ρ〈0· Ol ;
[0208] 與ΜΑ-40組比較有統(tǒng)計學意義_·Ρ〈0. 01 ;與ΜΑ-80組比較有統(tǒng)計學意義^?〈0. 01
[0209] 表11 4-甲氧基芐醇對H2O2致PC12細胞氧化損傷后P-ERK1/2、P-JNK、Ρ-ρ38蛋 白表達的影響（?士s，η = 4)
[0211] 注：與Control組比較有統(tǒng)計學意義#Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05 ;與Model組比較有統(tǒng)計 學意義 ##Ρ〈〇· 〇1，#Ρ〈〇· 01
[0212] 與Eda-160組比較有統(tǒng)計學意義$ $ Ρ〈0. 01 ;與ΜΑ-20組比較有統(tǒng)計學意義 ▲▲Ρ〈0· 01 ;
[0213] 與ΜΑ-40組比較有統(tǒng)計學意義__P〈0. 01 ;與ΜΑ-80組比較有統(tǒng)計學意義^?〈0. 01
[0214] 討論
[0215] PC12細胞是一種具有分化潛能的神經(jīng)元前體細胞系，具有交感神經(jīng)元樣的特性， 并具有易于培養(yǎng)的優(yōu)點，被廣泛用作研宄神經(jīng)細胞的模型。因此，我們選擇PC12細胞作為 實驗對象，以H 2O2處理細胞，復制氧化應激損傷神經(jīng)細胞模型，用于揭示藥物作用的機制研 宄。
[0216] 本實驗用H2O2處理PC12細胞2h，MTT比色法測定細胞存活率，發(fā)現(xiàn)：細胞的生長 和增殖均表現(xiàn)為抑制效應。4~ 0. 145mmol/L-Q. 58mmol/L (20 μ g/mL-80 μ g/mL) 能有效降低氣化應激損傷對PC12細朐牛長和增葙的抑制作用，目呈濃度依賴件（表1)。
[0217] H2O2是一種膜易透性強氧化劑，它對細胞的氧化應激損傷主要是通過增加細胞內(nèi) R0S，嚴重地干擾抗氧化防御系統(tǒng)功能，因此測定細胞內(nèi)ROS水平可間接反映細胞氧化應激 的程度。SOD和GSH對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它們的主要生理作用 是能夠清除掉人體內(nèi)的自由基，是機體內(nèi)的抗氧化劑。實駘結(jié)果顯示：4_甲氣基芐醇可抑 制損傷后細朐內(nèi)ROS水平，并提高H A=損傷后細朐內(nèi)SOD活件和GSH含量，講一步證實 4-甲氣基芐醇對PC12細朐氣化應激損傷具有保護作用。
[0218] Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶，它的活化是凋亡進入不可逆階段的 標志。Caspase-3在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于包漿中，沒有活性；但在細胞發(fā)生凋亡 時，它被激活，激活的Caspase-3由兩個大亞基和小亞基組成，裂解相應的胞漿胞核底物， 最終導致細胞凋亡。而MMP的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。H 2O2處理PC12細 胞2h，細胞內(nèi)Caspase-3被活化，MMP下降，說明PC12細朐發(fā)牛凋亡，4_甲氣基芐醇能夠抑 制Caspase-3活化和MMP下降，證明4-甲氣基芐醇可能通討抗細朐凋亡保護PC12細朐。
[0219] 細胞凋亡主要有兩條途徑：線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Caspase-9和Caspase-12 是Caspase家族中調(diào)控細胞凋亡的重要組成成員，Caspase-9是線粒體途徑的凋亡啟 動因子之一，Caspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡所必需的。Caspase-9和 Caspase-12的激活最終都會進一步激活Caspase-3,而引發(fā)細胞凋亡。蛋白表達結(jié)果顯示： 4-甲氧基節(jié)醇能夠降低Caspase-9的表達，進而抑制Caspase-3活化，說明4-甲氧基節(jié)醇 的抗細胞凋亡作用主要集中在線粒體途徑。
[0220] MPK是將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)換成廣泛的細胞內(nèi)反應的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白 激酶，在許多生理過程中發(fā)揮著重要的細胞信號傳導的作用，包括ERK1/2、JNK和p38途徑， 它參與調(diào)控部分線粒體細胞凋亡。當CIR發(fā)生時，MAPK通路受到ROS的刺激而被激活，激 活的ERK1/2能夠磷酸化并滅活P27、P21等細胞周期抑制蛋白，刺激細胞的增殖，同時能夠 抑制凋亡酶（如Caspases)的激活，并可以誘導一些抗凋亡因子的表達，減少細胞凋亡，縮 小創(chuàng)傷范圍，減少再灌注損傷對機體帶來的影響；JNK在受到細胞外刺激信號后，轉(zhuǎn)移至線 粒體膜附近，磷酸化后抑制線粒體膜上的Bcl-2,使細胞色素 C釋放入胞漿，與caspase-9/ 凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合，最終上調(diào)Caspase凋亡通路，促發(fā)Caspase9_Caspase3級聯(lián) 反應，引起細胞凋亡。p38被激活后能刺激凋亡相關(guān)基因 Bax流入線粒體導致細胞死亡。本 文Western-blot結(jié)果顯示：正常細胞中，磷酸化ERK1/2、JNK和p38MAPK蛋白幾乎不表達， 受到H 2O2刺激后，呈高度表達；4-甲氣基芐醇具有增強ERKl/2磷酸化蛋白表汰的作用，并 能夠抑制磷酸化TNK蛋白表汰，說明4-甲氣基芐醇可通討ERK1/2和TNK信號通路發(fā)揮抗 H2O2誘導PC12細朐損傷作用〇
[0221] 結(jié)論
[0222] 1、4_甲氧基芐醇具有抗H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的作用，其作用機制可能是 通過抑制內(nèi)源性線粒體細胞凋亡途徑。
[0223] 2、4_甲氧基芐醇可通過ERK1/2和JNK信號通路調(diào)控細胞凋亡，以保護氧化損傷 PC12細胞。
[0224] 綜上，4-甲氧基芐醇可通過降低細胞內(nèi)ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和 /或抗細胞凋亡發(fā)揮抗氧化損傷的作用，從而提高細胞存活率，可以制備成為抗氧化劑，用 于預防抗氧化損傷，預防和/或治療氧化應激損傷，應用前景良好。
【主權(quán)項】
1. 4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗氧化劑類藥物是抗氧化損傷的藥 物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述抗氧化損傷的藥物是預防和/或治 療氧化應激損傷的藥物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任意一項所述的用途，其特征在于：所述藥物是降低ROS水平、 提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗細胞凋亡的藥物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述制劑為口服制劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。7. -種抗氧化損傷的藥物，其特征在于：它是以4-甲氧基芐醇為活性成分，加上藥學 上可接受的輔料制備而成的制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于：所述制劑為口服制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。4-甲氧基芐醇可通過降低細胞內(nèi)ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗細胞凋亡發(fā)揮抗氧化損傷的作用，從而提高細胞存活率，可以制備成為抗氧化劑，用于預防抗氧化損傷，應用前景良好。
【IPC分類】A61P39/06, A61K31/085
【公開號】CN104922096
【申請?zhí)枴緾N201510278051
【發(fā)明人】段小花, 林青, 韓春妮
【申請人】云南中醫(yī)學院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月27日