專利名稱：白介素-4受體α(IL-4Rα)-173的結(jié)合成員的制作方法
白介素-4受體α (IL-4Ra )-173的結(jié)合成員本發(fā)明涉及白介素-4受體a (IL-4RQ，亦稱⑶124)的結(jié)合成員，特別是抗體分 子，及其在例如治療或預(yù)防IL-4Ra、IL-4和/或IL-13有關(guān)病癥，例如哮喘和COPD——中 的治療應(yīng)用。人IL_4Ra亞單位(Swiss 登錄號P24394)是一個以高親和力結(jié)合人IL-4的 140kDa I 型膜蛋白質(zhì)(Andrews 等，J. Biol. ChemQ002) 277 :46073-46078)。IL_4/IL_4Ra 復(fù)合體可以經(jīng)由IL-4上的結(jié)構(gòu)域與共同Y鏈(Yc，⑶132)或IL_13Ra l(IL_13Ra 1)亞 單位發(fā)生二聚作用，形成兩個不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，通常分別稱作I型和II型受體。或 者，IL-13可以結(jié)合IL-13Ra 1形成IL-13/IL-13R a 1復(fù)合物，這種復(fù)合物募集IL_4Ra亞 單位形成II型受體復(fù)合物。因而，IL-4Rci介導(dǎo)IL-4和IL-13的生物活性(有關(guān)綜述見 Gessner 等，Immunobiology，201 =285,2000) 體外研究表明，IL-4 和 IL-13 激活眾多細(xì)胞 類型中的效應(yīng)功能，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、氣道平滑 肌細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(有關(guān)綜述參IMeinke等，Resp Res, 2 :66，2001，和 ffillis-Karp, Immunol Rev, 202 :175,2004)。IL-4Ra在許多種細(xì)胞類型上的表達(dá)數(shù)量不高(100-5000分子/細(xì)胞) (Lowenthal等，J Immunol, 140 :456，1988)，例如外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、 B細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。造血細(xì)胞中I型受體占優(yōu)勢，而II型受體在造血細(xì)胞和非造血細(xì) 胞上都有表達(dá)。IL-4Ra在人群中的多態(tài)性已有人做過描述(有關(guān)綜述參見Gessner等， Immunobiology, 201 :285，2000)，據(jù)報道，在部分人群中與IgE水平或臨床特應(yīng)性有 關(guān)。例如，V75R576 IL-4R α與變應(yīng)性哮喘以及IL-4R α功能增強有關(guān)(Risma等， J. Immunol. 169(3) 1604-1610，2002)。許多證據(jù)表明，IL-4/IL-13途徑在哮喘病理學(xué)(有關(guān)綜述參見Chatila，Trends in Molecular Med, 10 =493,2004)以及大量羅列于本文它處的其它病癥中起著重要作用。 據(jù)信，IL-4和IL-13分泌的增加引發(fā)并維持這種疾病過程。IL-13被認(rèn)為是觸發(fā)氣道高反 應(yīng)性(AHR)、粘液分泌過多以及氣道重塑的支配性配偶體(partner)，而IL-4提示是Th2極 化和 IgE 產(chǎn)生的主要誘發(fā)因素(ffynn, AnnuRev Immunol, 21 =425,2003)。疾病動物模型的證據(jù)進(jìn)一步支持IL-4Rα在哮喘中的作用。在用卵清蛋白(0VA， 一種模型變應(yīng)原)進(jìn)行變應(yīng)原刺激的過程中給予功能性鼠IL-4R拮抗劑(IL-4突變體； C118缺失)抑制了原先用OVA敏化的小鼠中過敏性氣道嗜曙紅細(xì)胞增多以及AHR的發(fā)生 (Tomkinson 等，J. Immunol. 166(9) :5792-5800,2001) 此外，多項體內(nèi)研究證實 了在哮 喘動物模型中阻斷IL-13或IL-14的正面作用。例如，在OVA-誘導(dǎo)持續(xù)性氣道炎癥的慢 性模型中，治療性給予抗-IL-13單克隆抗體抑制了 AHR、中止了上皮下纖維化和炎癥的進(jìn) 展、并將粘液分泌過多恢復(fù)到了基礎(chǔ)水平(Yang等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 313(1) :8-15, 2005)。在小鼠OVA模型中，但在免疫期間給予時，用抗-IL-4抗體抑制-IL-4顯示出使嗜 酸性粒細(xì)胞浸潤的顯著降低(Coyle等，Am J Resp Cell Mol Biol，13 :54，1995)。在類似 模型中，OVA刺激后，IL-4-缺陷型小鼠在支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞明顯較少，支氣管周圍炎癥少得多(Brusselle 等，Clin Exp Allergy, 24 :73，1994)。對于人，IIa期研究顯示，IL-4RCI拮抗劑(所謂IL_4突變蛋白)降低變應(yīng)原誘 導(dǎo)的延遲哮喘反應(yīng)并減弱哮喘患者肺的靜息期炎癥狀態(tài)(Wenzel等，Lancet, 370 =1422, 2007)。這些人數(shù)據(jù)進(jìn)一步強化了 IL-4Ra拮抗劑在哮喘方面具有臨床實用性的主張。除了其在哮喘中的作用，IL-4RQ與許多其它病理學(xué)情形有關(guān)，例如慢性阻塞性肺疾患(COPD)包括患各種程度的慢性支氣管炎、小氣道疾病和肺氣 腫的患者群，以對目前哮喘的療法反應(yīng)差的漸進(jìn)性不可逆轉(zhuǎn)肺功能減退為特征。對COPD的 根本原因仍知之不詳。一種“荷蘭假說”認(rèn)為，對COPD和哮喘存在著共同的易感性，因此， 類似的機理可造成這兩種病癥發(fā)病(Sluiter等，Eur Respir J，4(4) :ρ· 479-89，1991)。 Zheng 等人(J Clin Invest, 106 (9) : 1081-93，2000)證實，IL-13 在小鼠肺中的過度表達(dá) 引起肺氣腫、提高粘膜產(chǎn)量及炎癥，反映了人COPD的諸多方面。此外，作為過敏性炎癥的 小鼠模型中的IL-13依賴性應(yīng)答，AHR顯示可預(yù)測吸煙者的肺功能減退(Tashkin等，Am J Respir CritCare Med, 153 (6Pt 1) :1802_11，1996)。另外還確立了 IL-13 啟動子多態(tài)性與 產(chǎn)生COPD 易感性之間的關(guān)聯(lián)(Van Der Pouw Kraan等人，Genes Immun, 3 (7) :436-9,2002) 因此，征兆是IL-4/IL-13途徑，尤其是IL-13，在COPD的發(fā)病機理中起著重要作用。IL-13在炎性腸病的發(fā)病機理可能有作用。Heller等人(Heller等，Immunity， 17(5) =629-38,2002)報道，給予可溶性IL_13Ra 2中和IL-13改善了人潰瘍性結(jié)腸炎的鼠 模型中的結(jié)腸炎癥。相應(yīng)地，與對照相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者的直腸活檢試樣中IL-13的表 達(dá)較高(Inoue 等，Am J Gastroenterol,94(9) JMl-6，I999)。除哮喘外，IL-4/IL-13途徑還與其它纖維化病癥相關(guān)，像全身性硬皮病 (Hasegawa 等，J Rheumatol, 24 (2) :328-32,1997)、肺纖維化(Hancock 等，Am JRespir Cell Mol Biol,18(1) :60_5，1998)、寄生蟲誘導(dǎo)的肝纖維化(Fallon等，JImmunol，164(5) 2585-91,2000 ；Chiaramonte φ, J Clin Invest,104(6) :777-85,1999 ；Chiaramonte, Hepatology 34(2) :273-82,2001),以及膀胱纖維化(Hauber 等，J. Cyst Fibr,2 189, 2003)。IL-4，在一定程度上還有IL-13，對于B細(xì)胞介導(dǎo)的活性是決定性的，比如B細(xì)胞增 生、免疫球蛋白分泌、以及Fc ε R的表達(dá)。IL-4Rci抑制劑的臨床應(yīng)用包括例如在變態(tài)反應(yīng) 治療中用于遏制IgE合成(例如包括特應(yīng)性皮炎和食物變態(tài)反應(yīng))、在移植治療中用于預(yù)防 移植排異、以及遏制延遲型過敏性或接觸過敏性反應(yīng)。IL-4R拮抗劑還可用作變態(tài)反應(yīng)免疫療法的佐劑以及用作疫苗佐劑。針對IL-4Rci的抗體已有描述。兩個例子是中和性鼠抗_IL_4Rα單克隆抗體 ΜΑΒ230(克隆25463)和16146 (克隆25463. 11)，分別由明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的R&D系 統(tǒng)公司(R&D Systems)和密蘇里州圣路易斯的西格馬公司提供。這些抗體屬于IgGh亞型， 是從純化重組人IL-4Ra (桿狀病毒源)免疫的小鼠產(chǎn)生的小鼠雜交瘤開發(fā)出的。另外兩 個中和性鼠抗-IL-4Ra抗體M57和X2/45-12分別由新澤西州富蘭克林湖市BD生物科學(xué) 公司(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)和加利福尼亞州圣迭哥市電子生物科學(xué)公司 (eBioscience, San Diego, CA)提供。這些是IgGl抗體，也是由用重組可溶性IL-4R α免 疫的小鼠的小鼠雜交瘤產(chǎn)生的。全人抗體似乎比鼠或嵌合抗體有更好的臨床實用性。這是因為，經(jīng)常生產(chǎn)的是針對鼠免疫球蛋白的FC部分的人抗鼠抗體(HAMA)，導(dǎo)致迅速的清除以及可能的過敏反應(yīng) (Brochier 等，Int. J. Immunopharm.，17 =41-48,1995)。雖然嵌合抗體(鼠可變區(qū)及人恒 定區(qū))比鼠單克隆抗體的免疫原性差，但已經(jīng)報道了人抗嵌合抗體(HACA)反應(yīng)(Bell和 Kamm, Aliment. Pharmacol. Ther.，14 :501-514, 2000)。WO 01/92340 (Immunex)描述針對IL-4受體的人單克隆抗體，是通過涉及用可溶 性IL-4R肽對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫以及形成分泌IL-4R的抗體的雜交瘤細(xì)胞系的步驟生成 的，公開的主要抗體12B5是一種IgGl抗體，而且是完全人抗體。WO 05/047331 (Immunex)進(jìn)一步披露了通過VH結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸誘變而衍生自 12B5(改名為H1L1)的抗體。每一個突變的VH鏈都與6個不同的VL鏈中的一個配對，產(chǎn)生 一個小型抗體分子庫。WO 07/082068 (Aerovance)披露了一種治療哮喘的方法，包括給予具有R121D和 Y124D取代的突變型人IL-4蛋白質(zhì)。該專利說明書指導(dǎo)，藥物組合物中給予的此類IL4突 變蛋白能拮抗野生型huIL-4和野生型huIL-13結(jié)合受體。WO 08/(^4606 (Regeneron)披露了針對人IL-4R的特定抗體，其在能產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)并開發(fā)對另一物種例如短尾猴的直向同源蛋白也顯示交叉反應(yīng)性的人 IL-4Ra抗體是有利和有益的。這樣的抗體有助于表征此類抗體的藥理學(xué)和體內(nèi)安全性。 效力或者對另一物種的親和力，例如與人活性的差異小于10倍，是一種適當(dāng)?shù)脑u價。然而， 人IL-4Ra蛋白與除猩猩之外的其它物種的直向同源IL-4Ra蛋白的相似性較低。因此， 發(fā)現(xiàn)親和力高、效力高、適合臨床應(yīng)用、對廣泛認(rèn)為適于臨床開發(fā)的安全及毒理學(xué)評價的物 種有交叉反應(yīng)性的抗體是非常具有挑戰(zhàn)性。通過恰當(dāng)設(shè)計的選擇技術(shù)和試驗，本發(fā)明人開發(fā)出了抑制人及短尾猴IL-4RCI生 物活性的IL-4Rci結(jié)合成員。如實施例所詳述的，本發(fā)明人從初始的先導(dǎo)鑒定項目中選擇了針對人IL-4RCI的 單個抗體分子，這個抗體分子同時對短尾猴IL-4Ra具有一定的-盡管弱-結(jié)合能力和功 能中和作用。遵循計劃并設(shè)計的靶向及隨機誘變，并進(jìn)一步從這個親代抗體分子選擇突變 體，開發(fā)出了大量性質(zhì)極大改善的抗體分子。VH和VL區(qū)，包括親代抗體(抗體1)、以及優(yōu) 化的抗體的互補決定區(qū)(⑶R)，示于

圖1、2、3和4。這些抗體分子、VH、VL、⑶R、以及包含一 個或多個CDR的結(jié)合成員，構(gòu)成本發(fā)明的諸方面。除野生型IL-4Rci，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的結(jié)合成員還結(jié)合一種普通的人變體 I75VIL-4Ra。這里描述的結(jié)合成員高效中和IL-4Rci的生物學(xué)效應(yīng)、高親和力結(jié)合IL-4Rα并 抑制IL-4和IL-13誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。需指出，結(jié)合成員抑制來自高親和力復(fù)合物，例如 IL-4:IL-4Ra y c,IL-4: IL-4Ra :IL_13Ra 1、IL_13: IL_13Ra l:IL_4Ra 的信號傳導(dǎo)。此 類動作阻止IL-4和IL-13的信號傳導(dǎo)。此外，數(shù)據(jù)顯示，結(jié)合成員抑制IL-4Ra 1型和2型 復(fù)合物的相互作用及信號傳導(dǎo)。下文進(jìn)一步詳述了結(jié)合成員的這些和其它特性與作用。這些結(jié)合成員可用于治療涉及IL_4Ra、IL_4或IL-13表達(dá)的病癥，例如在本文它 處提及的一種或多種IL-4R a -、IL-4-或IL_13_有關(guān)病癥，比如哮喘或C0PD。如本文它處所述，可采用表面等離振子共振，例如BIAcore測定結(jié)合成員與IL-Ra的結(jié)合。可將表面等離振子共振數(shù)據(jù)擬合至1 1朗格繆爾結(jié)合模型(同時ka kd)以及 從速度常數(shù)之比kdl/kal計算的親和力常數(shù)Kd。本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人IL-4Ra的單價 親和力小于20nM。在其它實施方式中，結(jié)合人IL-4Ra的單價親和力小于ΙΟηΜ，例如小于 8、小于5nM。在其它實施方式中，結(jié)合成員還結(jié)合短尾猴IL-4Ra。在一個實施方式中，本 發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人IL-4Ra的單價親和力在0.05至12nM的范圍內(nèi)。在一個實施方式 中，本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人IL-4Rci的單價親和力在0.1至5nM的范圍內(nèi)。在一個實施 方式中，本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人IL-4R α的單價親和力在0. 1至2nM的范圍內(nèi)。在一個實施方式中，本發(fā)明的結(jié)合成員可以與人IL-4Ra發(fā)生免疫特異性結(jié)合， 利用本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(如BIAcore試驗，ELISA)(瑞典烏普薩拉的 比亞科國際公司(Biacore International AB, Uppsala, Sweden))評估，其親和力(KD) 可能小于5000pM、小于4000pM、小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于11500pM、小 于ΙΟΟΟρΜ、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于ΙΟΟρΜ、小于 75pM0在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合成員可與人IL-4Ra發(fā)生免疫特異性結(jié) 合，利用本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(如BIAcore試驗，ELISA)評估，其親 和力(KD)可以是 25-5000pM、25-4000pM、25-3500pM、25-3000pM、25-2500pM、25-2000pM、 25-1500pM、25-1000pM、25-750pM、25-500pM、25-250pM、25-100pM、25-75pM、25-50pM。在另 一實施方式中，本發(fā)明的抗-IL-4Ra結(jié)合成員(包括抗體)可與IL-4Ra發(fā)生免疫特異性 結(jié)合，利用本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(如BIAcore試驗，ELISA)評估，其親和 力(KD)可以是 500pM、100pM、75pM 或 50pM。如實施例中更詳細(xì)地描述，本發(fā)明的結(jié)合成員能高效中和IL-4RCI?！爸泻汀笔侵?抑制IL-4Ra介導(dǎo)的生物學(xué)活性。本發(fā)明的結(jié)合成員可以中和IL-4Ra所介導(dǎo)的一種或多 種生物學(xué)活性。被抑制的生物學(xué)活性似乎是通過阻止IL-4Rα與Y鏈(或IL-13RCI)以 及有關(guān)的可溶性配體例如IL-4或IL-13形成信號傳導(dǎo)復(fù)合物來介導(dǎo)的?？梢酝ㄟ^抑制IL-4或IL-13刺激的TF-I細(xì)胞增殖來測定IL-4或IL-13信號傳 導(dǎo)受到其包含IL-4Rci的受體復(fù)合物的中和。本發(fā)明的抗體所結(jié)合的人IL4RCI的表位通過組合誘變與結(jié)構(gòu)域?qū)Q來定位。全 結(jié)構(gòu)域?qū)Q嵌合體將該表位定位在人IL4Rα的結(jié)構(gòu)域I(Dl)(殘基Μ1-Ε119)。人IL_4Ra 包含5個環(huán)區(qū)域，在晶體結(jié)構(gòu)中與IL4緊鄰(Hage等，Cell 97 =271-281,1999)。環(huán)對換嵌 合體還能夠進(jìn)一步地將本發(fā)明抗體所結(jié)合的人IL-4Ra表位定位在第3環(huán)中的主要組分 (殘基L89-N98)和第2環(huán)中的次要組分(殘基V65-H72)。沒有人第3環(huán)的嵌合體無法抑 制人IL-4Rci與抗體的結(jié)合，而沒有第2環(huán)的嵌合體的IC5tl比人IL-4Rα高100倍(表5)。 與結(jié)構(gòu)域?qū)Q數(shù)據(jù)相一致，第2環(huán)和第3環(huán)都在域I(Dl)中(Hage等，Cell 97 =271-281, 1999)。該抗體表位定位為人IL-4Ra的兩個環(huán)區(qū)域中的18氨基酸不連續(xù)表位V65_H72 和L89-N98。表位可進(jìn)一步定位至第2環(huán)的氨基酸殘基L67和L68以及第3環(huán)的D92和 V93(殘基67、68、92和93的位置見SEQ ID NO :妨4或460)。D92殘基是最重要的，其次是 V93,因為測試的抗體仍然能夠結(jié)合在第2環(huán)中缺少L67和/或L68殘基的嵌合體IL-4R a。當(dāng)然，本發(fā)明的抗體似乎還結(jié)合除L67、L68、D92和V93之外的人IL_4Ra蛋白質(zhì)的殘基。本發(fā)明一個方面提供一種分離的結(jié)合成員，根據(jù)SEQ ID NO :460的位置，其能夠在 至少一個選自位置67、68、92和93的氨基酸殘基處結(jié)合人白介素-4受體a (hIL_4Ra)。 本發(fā)明一個方面提供一種分離的結(jié)合成員，根據(jù)SEQ ID NO :460中的位置，其能夠結(jié)合天然 人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的氨基酸殘基67、68、92和93的至少一個。在一特定實施 方式中，根據(jù)SEQ ID NO :460中的位置，該分離的結(jié)合成員能夠結(jié)合hIL-4Ra中的位置92 處的氨基酸。在另一個實施方式中，該分離的結(jié)合成員能夠結(jié)合D92以及選自L67、L68或 V93的至少一個其它殘基。在另一個實施方式中，該分離的結(jié)合成員能夠結(jié)合D92和V93。 在另一個實施方式中，該分離的結(jié)合成員能夠結(jié)合D92、V93以及L67或L68中任意者。在 另一個實施方式中，抗體能夠結(jié)合L67、L68、D92和V93中的每一個。這些實施方式各自指 向hIL_4Ra中的氨基酸位置，其位置可以依據(jù)SEQ ID NO :460所示hIL_4Rα氨基酸序列 (從位置1到位置229)確定。在一個實施方式中，結(jié)合成員能夠結(jié)合全長hIL_4Ra中所 引述的表位殘基(即位置67、68、92和93中的至少一個位置)。在一個實施方式中，結(jié)合 成員能夠結(jié)合在細(xì)胞表面表達(dá)的天然hIL-4Ra中所引述的表位殘基(即位置67、68、92和 93中的至少一個位置)。在一個實施方式中，結(jié)合成員能夠結(jié)合重組表達(dá)的全長0 個氨 基酸)hIL-4Ra中所引述的表位殘基(即位置67、68、92和93中的至少一個位置)。本發(fā)明的另一方面提供一種分離的結(jié)合成員，其能夠結(jié)合人白介素-4受體 a (hIL-4Ra)0在一個特定實施方式在中，結(jié)合成員是人抗體。在另一個實施方式中，結(jié)合 成員能夠結(jié)合短尾猴白介素-4受體a (cyIL-4Ra)0本發(fā)明的另一個方面提供人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離結(jié)合成員，該結(jié) 合成員在用18pM可溶性人IL-4蛋白的TF-I增殖試驗中抑制人IL_4(hIL_4)誘導(dǎo)細(xì)胞增 殖的IC5tl幾何平均值小于50pM，且該結(jié)合成員還能夠結(jié)合cyIL-4Ra。在本發(fā)明這一方面的特定實施方式中，結(jié)合成員在用ISpM可溶性人IL-4的TF-I 增殖試驗中抑制人IL-4(hIL-4)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的IC5tl幾何平均值小于50pM、小于35pM、小 于25pM、或小于20pM。在本發(fā)明這一方面的一個特定實施方式中，結(jié)合成員在用ISpM可溶 性人IL-4的本文描述方法(例如，實施例3. 2. 1)或本領(lǐng)域已知方法中抑制人IL-4(hIL-4) 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的IC5tl幾何平均值在1_50ρΜ之間、在1-35ρΜ之間、在1_25ρΜ之間、或在 1-12ρΜ 之間。與CyIL-4Ra結(jié)合可以采用任何合適的手段測定。類似地，使用400pM可溶性人IL-13(hIL_13)，本發(fā)明范圍內(nèi)的結(jié)合成員抑制人 IL-13(hIL-13)_介導(dǎo)TF-I增殖(通過中和hIL_4Ra )的IC50幾何平均值小于200pM。在 一個特定實施方式中，使用400pM可溶性人IL-13 (hIL-13)，抑制人IL-13 (hIL_13)-介導(dǎo)的 TF-I增殖(通過中和hIL-4R a )的IC5tl幾何平均值在5_75pM之間或5_45pM之間。在一個特定實施方式中，本發(fā)明結(jié)合成員基本不能結(jié)合鼠IL-4Ra。我們的意思 是，本發(fā)明的結(jié)合成員對人白介素-4受體α的結(jié)合要比對鼠IL-4Ra的結(jié)合強至少500倍 (比如至少500倍、至少1000倍、至少1500倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍) (即，與鼠IL-4Rci的結(jié)合至少比與人IL-4Rci的結(jié)合弱500倍)。這可以例如通過實施例 5. 1. 2揭示的HTRF競爭試驗來測定。幾何平均值(亦稱幾何平均)在本發(fā)明中是指重新?lián)Q算成底10的數(shù)時數(shù)據(jù)集對數(shù)值的平均數(shù)。這要求至少有兩次測量，例如重復(fù)至少2次，優(yōu)選至少5次，更優(yōu)選至少10 次。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，重復(fù)次數(shù)越多，則幾何平均值就越可靠。重復(fù)次數(shù)的選擇可由 本領(lǐng)域技術(shù)人員慎重決定?？梢圆糠只蛲耆种粕飳W(xué)活性。在具體實施方式
中，與沒有結(jié)合成員存在下的 活性相比，提供的結(jié)合成員能將IL-4Ra生物學(xué)活性抑制至少95%、至少90%、至少85%、 至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。結(jié)合成員中和IL_4Ra的程度稱 為其中和效力?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文所述或述及的一種或多種試驗測定或檢 測效力。例如，可在以下試驗中檢驗效力-熒光(例如HTRF或DELFIA)或放射形式的受體-配體結(jié)合試驗-熒光(例如HTRF或DELFIA)表位競爭試驗-基于細(xì)胞的功能試驗，包括人或短尾猴PBMC的STAT6磷酸化、TF-I細(xì)胞增殖、人 或短尾猴成纖維細(xì)胞系的嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白釋放、VCAM-I上調(diào)人內(nèi)皮靜脈細(xì)胞或人T 細(xì)胞增殖。實施例中還描述了其中的一些試驗方法?？蓪⒃诶玫谝晃锓N(例如，人)的IL-4Ra的試驗中計算的結(jié)合成員的中和效 力與該結(jié)合成員在利用第二物種(例如，短尾猴)的IL-4Ra的相同試驗中的中和效力作 比較，從而評估該結(jié)合成員與兩種物種的IL-4Ra的交叉反應(yīng)程度。如果有一種結(jié)合成員， 例如抗體或抗體片段，能夠既結(jié)合人標(biāo)靶，又結(jié)合來自另一物種的直向同源標(biāo)靶，是會有巨 大優(yōu)勢的。當(dāng)結(jié)合成員發(fā)展成一種治療產(chǎn)品時會產(chǎn)生關(guān)鍵優(yōu)點，需要在另一個物種中進(jìn)行 安全研究(例如毒性)。對另一物種的效力或者親和力，例如與人活性的差異小于10倍，是 一種適當(dāng)?shù)脑u價。有各種方法確定本發(fā)明的結(jié)合成員與人及“其他物種”(例如短尾猴)IL_4Ra的 結(jié)合比率。一種方法即受體-配體結(jié)合試驗，如實施例4. 3中所用。依據(jù)本發(fā)明結(jié)合成員的一個特定實施方式，采用受體-配體結(jié)合試驗檢測的結(jié) 合成員作為scFv與hIL_4Ra和cyIL_4Ra的結(jié)合比率至少是6 1。在本發(fā)明中，“至 少” 6 1包括8 UlO 1等；但不是2 1、1 1。本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人IL-4Rci及短尾猴IL_4Ra，用受體-配體結(jié)合試驗確 定，中和人與短尾猴IL-4R α的效力之差小于250倍，例如小于150倍、100倍、75倍、50倍、 25倍、20倍、15倍、10倍，其中結(jié)合成員是scFv形式，如實施例4. 3。這里的數(shù)據(jù)標(biāo)明，例如當(dāng)抗體2、4-8、12、16、19、20、22、23、24、26、28、32、33、34、 37和37GL以scFv形式在本文所述受體-配體結(jié)合試驗中測定時，其分別中和人與短尾猴 IL-4Ra方面的效力之差小于或等于25倍。數(shù)據(jù)示于實施例4.3和表1。因而，在一些實 施方式中，受體-配體結(jié)合試驗測定的本發(fā)明結(jié)合成員對人與短尾猴IL-4Ra的中和效力 (scFv形式)是25倍以內(nèi)。對人與短尾猴IL-4Ra的中和效力顯示小于或等于10倍的本 發(fā)明抗體的具體例子包括抗體2、4、5、20和22。在一個實施方式中，本發(fā)明結(jié)合成員對人與 短尾猴IL-4Rci的中和效力是210倍以內(nèi)；即對人IL-4Rci的結(jié)合比對短尾猴IL-4Rα的 結(jié)合強不超過210倍。在另一個實施方式中，所述中和效力在5 1和210 1之間，比如 在5 1和100 1之間。
對于基于細(xì)胞的功能 試驗，效力通常表示為以nM計的IC5tl值，除非另有表述。在功 能試驗中，IC5tl是將生物學(xué)(或化學(xué))反應(yīng)從其最高值降低50%的結(jié)合成員摩爾濃度?？赏?過繪制最高生物學(xué)反應(yīng)％與1(^(結(jié)合成員濃度)的函數(shù)圖，利用諸如圖墊公司(GraphPad) 的Prism或起源實驗室(Origin Labs)的Origin等軟件程序來計算IC5tl，從而能根據(jù)數(shù)據(jù) 擬合S形函數(shù)以產(chǎn)生IC5tl值。對于受體_配體結(jié)合試驗，效力通常表示成Ki (抑制常數(shù))，在沒有標(biāo)記配體存在 的情況下占據(jù)50%的受體時的結(jié)合成員濃度。然而，取決于配體的濃度，每次試驗的IC5tl可 能有所變化，Ki是用Cheng Prusoff方程計算出的絕對值。在本文描述的人IL-4Rci HTRF 試驗中，本發(fā)明的結(jié)合成員的中和效力或Ki最 高為5nM?？刹捎迷撛囼灉y定scFV形式的結(jié)合成員的Ki。例如，Ki可以是最高5. 0、4. O、 3. 0、2. 0,1. 0,0. 5,0. 2,0. 1,0. 05、或0. 02nM。Ki數(shù)據(jù)的示例示于實施例4. 3 (參見表1)，其 中在HTRF 受體-配體結(jié)合試驗中使用的最終濃度是0. 125nM人IL_4Ra和2nM IL-4， 并提供了一種詳盡方法。此外，可測定IL-4Rci結(jié)合成員對IL_4Ra的結(jié)合動力學(xué)和親和力(表示為平衡 解離常數(shù)，KD)，例如采用表面等離振子共振，如BIAcore，或者可通過pA2分析估算Kd。表面等離振子共振是測定結(jié)合成員對標(biāo)靶的親和力的慣常技術(shù)。其包括使分析物 在液相中流過與支持物相連的配體，并測定分析物與配體之間的結(jié)合情況。例如，可使得重 組IL-Ra在液相中流過與支持物相連的結(jié)合成員來實施等離振子共振?？筛鶕?jù)二價分析 物數(shù)據(jù)模型或單價分析物數(shù)據(jù)模型擬合表面等離振子共振數(shù)據(jù)。如本文的實施例章節(jié)所 述，發(fā)現(xiàn)單價分析物數(shù)據(jù)模型尤其適于測定結(jié)合成員與IL-4Rα的親和力?？刹捎? 1 朗格繆爾結(jié)合模型通過表面等離振子共振測定速度常數(shù)之比kdl/kal，由該速度常數(shù)之比 計算親和力常數(shù)Kd。采用表面等離振子共振計算的示例性IL-4R α結(jié)合KD估算值見實施例4. 7 (參見 表4)。這些數(shù)據(jù)證實抗體37GL對重組產(chǎn)生的人及短尾猴IL-4Ra有良好的結(jié)合性質(zhì)。能 與HEK-EBNA細(xì)胞的IL-4R α結(jié)合證明該抗體能與天然糖基化的人IL-4R α結(jié)合。因為抗體 37GL結(jié)合天然糖基化IL-4Ra形式使人們可以預(yù)言，本發(fā)明的所有抗體(例如抗體1_42) 均能結(jié)合天然糖基化的人IL-4R α，假定這些抗體均衍生自一種親代抗體(抗體1)，因此， 相信它們均與IL-4Ra的相同或高度相似的表位結(jié)合。因而，依據(jù)一個特定實施方式，本發(fā)明結(jié)合成員能夠結(jié)合糖基化的hIL_4Ra。如實施例4. 7和表4所述，衍生自抗體1的一部分代表性抗體的表面等離振子共 振確定了結(jié)合人及短尾猴IL-4Rci的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的結(jié)合成員可任選對IL-4Ra的特異性勝過其它結(jié)構(gòu)相關(guān)性分子(例如其 他白介素受體)，因此選擇性結(jié)合IL-4Rci。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員不會與IL-13Rci 1或 IL_13Ra 2中的任何一個以及共同的Y鏈(Y c)普通的交叉反應(yīng)。這可以例如以例示于實 施例4. 6中的DELFIA 表位競爭試驗確定或證實。本發(fā)明結(jié)合成員可包含抗體分子，例如人抗體分子。結(jié)合成員包含抗體VH和/或 VL結(jié)構(gòu)域。結(jié)合成員的VH結(jié)構(gòu)域也作為本發(fā)明的部分提供。各VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)是互補 決定區(qū)(“⑶R”)和構(gòu)架區(qū)(“FR”)。VH結(jié)構(gòu)域包含一組HCDR，VL結(jié)構(gòu)域包含一組IXDR?？贵w分子可包含含有VH⑶R1、⑶R2和⑶R3的抗體VH結(jié)構(gòu)域及構(gòu)架區(qū)?；蛘咂溥€可包含 含有VL⑶R1、⑶R2和⑶R3的抗體VL結(jié)構(gòu)域及構(gòu)架區(qū)。VH或VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)包含散布 有⑶R的四個構(gòu)架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4，結(jié)構(gòu)如下FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。本發(fā)明的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)R和CDR的例子見隨附的構(gòu)成本文一部分的序列 表。本文披露的所有VH和VL序列、⑶R序列、多組⑶R和多組HCDR及多組IXDR代表著本 發(fā)明的諸方面和實施方式。本文所述的“⑶R組”包括⑶R1、⑶R2和⑶R3。因此，一組HCDR 指 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3，一組 LCDR 指 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。除非另有表述，“整組 CDR” 包括HCDR和IXDR。本發(fā)明的結(jié)合成員通常是單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面是包含VH結(jié)構(gòu)域和/或包含VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，所述VH 結(jié)構(gòu)域與隨附序列表所示抗體1-42中任一種的VH結(jié)構(gòu)域有至少75、80、85、90、95、98或 99%氨基酸序列相同性，所述VL結(jié)構(gòu)域與隨附序列表所示抗體1-42中任一種的VL結(jié)構(gòu)域 有至少75、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列相同性。阿克賽勒里公司(Accelerys)的 MacVector 程序可以用來計算兩個氨基酸序列的％相同性。本發(fā)明的結(jié)合成員可包含非抗體分子內(nèi)的抗原結(jié)合位點，通常由非抗體蛋白支架 中的一個或多個⑶R提供，例如HCDR3和/或IXDR3，或一組⑶R，下文將進(jìn)一步討論。如實驗部分更詳細(xì)描述的，本發(fā)明人分離了具有如圖1(VH結(jié)構(gòu)域)和2(VL結(jié)構(gòu) 域)所示一組CDR序列的親代抗體分子(抗體1)。通過一個優(yōu)化過程，發(fā)明人產(chǎn)生了包括 2-20號在內(nèi)的一組抗體克隆，其⑶R3序列衍生自親代⑶R3序列并在圖1(VH結(jié)構(gòu)域)和 2(VL結(jié)構(gòu)域)所示的位置具有取代。因而，從圖l(a和b)可以看出，抗體2具有親代HCDR1、 HCDR2、IXDRl和IXDR2序列，具有親代IXDR3序列，其中Kabat殘基95被Q置換，Kabat殘基 95A、95B和96各自被P置換、Kabat殘基97被L置換；并具有親代HCDR3序列，其中Kabat 殘基101被Y置換、Kabat殘基102被N置換。本文所述的親代抗體分子和抗體分子2-20分別指含親代抗體分子的CDR的抗體 分子和含抗體2-20的⑶R的抗體分子。經(jīng)進(jìn)一步的優(yōu)化過程，發(fā)明人生成了一組編號21-42 的抗體克隆，在整個VH和VL結(jié)構(gòu)域中有其它取代。因此，例如，抗體21具有與抗體20相同 的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRUP HCDR3 ；抗體 21 具有抗體 20 的親代 HCDR2 序列，但 Kabat 殘基57被A置換了 ；其Kabat殘基85和87 (在LFW3)分別被V和F置換。這里描述了包含圖3 (VH結(jié)構(gòu)域)和4 (VL結(jié)構(gòu)域)所示抗體20的一組⑶R的參比 結(jié)合成員，其中 HCDRl 是SEQ ID NO 193 (Kabat 殘基31-35)、HCDR2 是SEQ ID NO 194 (Kabat 殘基 50-65)、HCDR3 是 SEQ ID NO 195 (Kabat 殘基 95-102)、LCDR1 是 SEQ ID NO 198 (Kabat 殘基 24-34)、LCDR2 是 SEQ IDNO 199 (Kabat 殘基 50-56)，而 LCDR3 是 SEQ ID NO 200 (Kabat 殘基89-97)。其它結(jié)合成員可以參照參比結(jié)合成員的序列來描述。 本發(fā)明的結(jié)合成員可包含本文描述的一個或多個⑶R(即至少一個、至少兩個、至 少三個、至少四個、至少五個和至少六個)，例如一個⑶R3、以及任選的⑶Rl和⑶R2以構(gòu)成 一組⑶R。⑶R或⑶R組可以是親代⑶R或親代⑶R組，或者可以是抗體2-42中任一種的 ⑶R或⑶R組，或者可以是其變體，如本文所述。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域包含參比IXDR3，其中Kabat殘基92_97中的 一個或多個取代成另一種氨基酸。示例性取代包括
Kabat 殘基 92 被 Phe (F)、Val (V)或 Ala (A)置換；殘基93被Gly (G)或Ser⑶置換；Kabat殘基94被Thr⑴置換；Kabat 殘基 95 被 Leu (L)、GLn (Q)、Pro (P)或 Ser (S)置換；Kabat 殘基 95a 被 Ser (S)、Prol (P)、Ala (A)、Thr (T)、His (H)或 Gly (G)置換；Kabat 殘基 95b 被 Ala (A)、Pro (P)、Ser (S)、Tyr (Y)、Met (M)、Leu (L)、Thr (T)、 Arg(R)或 Asp (D)置換；Kabat 殘基 95c 被 Asn (N)、Gln (Q)、His (H)、Tyr (Y)、Thr (T)、lie (I)、Lys (K)、 Arg(R)或 Met (M)置換；Kabat 殘基 96 被 Tyr (Y)或 Pro (P)置換；Kabat 殘基 97 被 Val (V)、Leu (L)或 Ile(I)置換。結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域包含參比HCDR3，其中Kabat殘基97-102中的一個或多個取 代成另一種氨基酸。示例性取代包括Kabat 殘基 97 被 Trp (W)或 Leu (L)置換；Kabat 殘基 98 被 Leu (L)置換；Kabat 殘基 99 被 Leu (L)、Lys (K)、Phe (F)或 Trp (W)置換；Kabat 殘基 101 被 Asp (D)、Asn (N)或 Gln (Q)置換；Kabat 殘基 102 被 Tyr (Y)、Asn (N)、Pro (P)或 His (H)置換。本發(fā)明結(jié)合成員可包含抗體1-42中任一個的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或 抗體1-42中任一個的IXDR1、IXDR2和/或IXDR3，例如圖1或2所示的抗體1_42中任一 個的一組⑶R。結(jié)合成員可包含這些抗體之一的一組VH⑶R。其還可任選包含這些抗體之 一的一組VL⑶R，所述VL⑶R可以來自與VH⑶R相同或不同的抗體。包含抗體1_42中任 一個的一組HCDR的VL結(jié)構(gòu)域和/或包含抗體1-42中任一個的一組IXDR的VL結(jié)構(gòu)域也 是本發(fā)明的各種實施方式。VH結(jié)構(gòu)域通常與VL結(jié)構(gòu)域配對以提供抗體抗原_結(jié)合位點，雖然如下文進(jìn)一步 討論的，VH或VL結(jié)構(gòu)域可單獨用于結(jié)合抗原。在一個實施方式中，抗體IVH結(jié)構(gòu)域與抗體 1 VL結(jié)構(gòu)域配對，從而形成同時包含抗體1 VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體抗原-結(jié)合位點。提供 了本文所述其它VH和VL結(jié)構(gòu)域的類似實施方式。在其它實施方式中，抗體1 VH與抗體1 VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對。本領(lǐng)域 熟知輕鏈混雜。本發(fā)明還提供了本文所述其它VH和VL 結(jié)構(gòu)域的類似實施方式。因此，親代(抗體1)或抗體2-42中任意抗體的VH可以與親代或 抗體2-42中任意抗體的VL配對。本發(fā)明的一個方面是包含VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體，其中的VH結(jié)構(gòu)域包含圖1或3 中揭示的序列。本發(fā)明的一個方面是包含VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體，其中的VH結(jié)構(gòu)域包含圖2或4 中揭示的序列。本發(fā)明的另一方面是包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的分離抗體分子，其中的VH結(jié)構(gòu) 域氨基酸序列如SEQ ID NO :362、442、232、422或432所示，VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列如SEQ ID NO :367、237、447、437 或 427 所示。結(jié)合成員可以包含親代抗體或抗體2-42中任一種的一組H和/或L⑶R，其中在所披露的H和/或L⑶R組內(nèi) 含有12或10個或9個或更少的，例如1、2、3、4或5個取代。 例如，本發(fā)明結(jié)合成員可包含抗體16或抗體20的H和/或L CDR組，其中可包含12個或 更少的取代，例如7或更少的取代，例如0、1、2、3、4、565個取代。有可能對⑶R組內(nèi)的任何 殘基進(jìn)行取代，可以在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3內(nèi)。因此，本發(fā)明一個面提供一種人白介素_4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員， 其包含一組CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3，其中該組CDR含有相對于參 比組⑶R的12個或更少的氨基酸改變，其中HCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 153 ；HCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 154 ；HCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO 155 ；LCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 158 ；LCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 159 ；而LCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO :160。本實例中的參比抗體是抗體16。分離的結(jié)合成員相對于參比組CDR可以有10個或更少的、8個或更少的、7個或更 少的，例如6、5、4、3、2、1或0個氨基酸改變。具體的改變是氨基酸取代。本發(fā)明另一方面提供一種人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含一組 CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中該組 CDR 相對于參比組 CDR 有12個或更少的的氨基酸改變，其中HCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 193 ；HCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 194 ；HCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO 195 ；LCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 198 ；LCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO :199 ；而LCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO :200。本實例中的參比抗體是抗體20。分離的結(jié)合成員相對于參比組CDR可以有10或更少的、8個或更少的、7個或更少 的，例如6、5、4、3、2、1或0個氨基酸改變。具體的改變是氨基酸取代。在一特定實施方式 中，分離的結(jié)合成員相對于上述的參比組CDR有4個或更少的的氨基酸改變。本發(fā)明另一方面提供一種人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含一組 CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中該組 CDR 相對于參比組 CDR 有6個或更少的的氨基酸改變，其中HCDRl 有氨基酸序歹Ij SEQ ID NO 363 ；HCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 364 ；HCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO 365 ；LCDRl 有氨基酸序歹Ij SEQ ID NO 368 ；LCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO :369 ；而LCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO :370。本實例中的參比抗體是抗體37。
取代可以是在⑶R3之內(nèi)，例如在抗體2-42中任意抗體的取代位置處，如圖1或 3(VH結(jié)構(gòu)域)和2或4(VL結(jié)構(gòu)域)所示。因此，所述一個或多個取代可包含以下殘基處的 一個或多個取代 HCDR3 中的 Kabat 殘基 97、98、99、101 或 102 ；或LCDR3 中的 Kabat 殘基 92、93、94、95、95A、95B、95C、96 或 97。因此，CDR3 可以例如是參比 LCDR3，在 Kabat 殘基 92、93、94、95、95A、95B、95C、96 或97處具有一個或多個取代。本文它處描述了親代/參比⑶R中取代的例子。所述的取代可以包含圖1-4所示 的一個或多個取代。本發(fā)明的結(jié)合成員包含參比抗體20的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，或者具有以下 取代中的一個或多個HCDR2，其中 Kabat 殘基 53 是 Arg (R)；HCDR2，其中 Kabat 殘基 57 是 Ala (A)；HCDR3,其中 Kabat 殘基 97 是 Trp (W)或 Leu (L) ；Kabat 殘基 98 是 Leu ；Kabat 殘 基 99 是 Leu (L)、Lys (K)或 Trp (W) ；Kabat 殘基 101 是 Asn (N)或 Gln (Q)；和 / 或 Kabat 殘 基 102 是 Tyr (Y)、Asn (N)、Pro (P)或 His (H)。本發(fā)明的結(jié)合成員包含參比抗體20的IXDR1、IXDR2和/或IXDR3，或者具有以下 取代中的一個或多個LCDRl，其中 Kabat 殘基 27 是 Gly(G)；Kabat 殘基 27A 是 Thr (T)；Kabat 殘基 27B 是 Ser (S)；Kabat 殘基 31 是 Asn(N)；LCDR2，其中 Kabat 殘基 56 是 Pro (P)；LCDR3，其中 Kabat 殘基 92 是 Phe(F)、Val (V)或 Ala (A)；Kabat 殘基 93 是 Gly (G)或 Ser (S)；Kabat 殘基 94 是 Thr (T)；Kabat 殘基 95 是 Leu (L)、Gln (Q)、Pro (P)或 Ser (S)；Kabat 殘基 95A 是 Ser (S)、Pro (P)、Ala (A)、Thr (T)、His (H)或 Gly (G)；Kabat 殘基 95B 是 Ala (A)、Pro (P)、Ser (S)、Tyr (Y)、Met (M)、Leu (L)、Thr (T)、 Asp(D)或 Arg (R)；Kabat 殘基 95C 是 Asn(N)、Gln(Q)、His(H)、Tyr (Y)、Ile(I)、Lys (K)、Arg (R)、 Thr (T)或 Met (M)；Kabat 殘基 96 是 Tyr (Y)或 Pro (P)；和/ 或 Kabat 殘基 97 是 Val (V)、Leu (L)或 Ile(I)。在一特定實施方式中，參比抗體20序列，HCDR2的Kabat殘基53被Arg(R)置換；和/ 或 HCDR2 的 Kabat 殘基 57Ala (A)被置換；和/ 或 LCDRl 的 Kabat 殘基 27 被 Gly (G)置換；和 / 或 LCDRl 的 Kabat 殘基 27B 被Ser (S)置換；和/或LCDR3的Kabat殘基95被Pro (P)置換。依據(jù)本發(fā)明的一個特定方面，提供
人白介素_4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其中HCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 363 ；HCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 364 ；HCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO 365 ；LCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 368 ；LCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO :369 ；而LCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO :370。依據(jù)本發(fā)明的另一個特定方面，提供人白介素_4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié) 合成員，其中HCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 233 ；HCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO 364 ；234 ；HCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO 235 ；LCDRl 有氨基酸序列 SEQ ID NO 238 ；LCDR2 有氨基酸序列 SEQ ID NO :239 ；而LCDR3 有氨基酸序列 SEQ ID NO :240。在本發(fā)明的結(jié)合成員中HCDRl的長度可以是5個氨基酸，由Kabat殘基31_35構(gòu)成；HCDR2的長度可以是17個氨基酸，由Kabat殘基50-65構(gòu)成；HCDR3的長度可以是9個氨基酸，由Kabat殘基95-102構(gòu)成；IXDRl的長度可以是11個氨基酸，由Kabat殘基24_34構(gòu)成。IXDR2的長度可以是7個氨基酸，由Kabat殘基50_56構(gòu)成；和/或IXDR3的長度 可以是9個氨基酸，由Kabat殘基89-97構(gòu)成。圖1和3示出一組HCDR和LCDR的Kabat編號，其中HCDRl是Kabat殘基31-35， HCDR2 是 Kabat 殘基 50-65，HCDR3 是 Kabat 殘基 95-102 ；在圖 2 和 4 中，LCDRl 是 Kabat 殘 基 24-34，LCDR2 是 Kabat 殘基 50-56，而 LCDR3 是 Kabat 殘基 89-97。本發(fā)明的另一個特定方面提供人白介素_4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成 員，其包含一組 CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中該組 CDR 相對于 2008 年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏號是NCIMB 41600)存在的參比組⑶R有6個 或更少的的氨基酸改變.本發(fā)明的另一個方面提供人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含一個VH序列，該序列見于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏號是NCIMB 41600.本發(fā)明的另一個方面提供人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含一個VL序列，該序列見于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏號是NCIMB 41600.本發(fā)明的另一個方面提供人白介素_4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含VH和VL序列，該二序列見于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆，保藏號是NCIMB 41600. 本發(fā)明的另一個方面提供分離的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段免疫特異性結(jié)合人白介素-4受體α (hIL-4Ra)并包含 (a) VH CDRl，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VH CDRl，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代；(b)VH CDR2，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VH CDR2，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代；(C)VH CDR3，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VH CDR3，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代；(d)VL CDRl，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VL CDR1，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代；(e)VL CDR2，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VL CDR2，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代；而(f)VL CDR3，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保 藏號是NCIMB 41600)的VL CDR3，或包含1、2、或3個氨基酸殘基取代。本發(fā)明的另一個方面提供分離的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段免疫特 異性結(jié)合人白介素_4受體α (hIL-4Ra)并包含(a) VH序列，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏 號是:NCIMB 41600)的VH序列，或包含1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基取代；(b) VL序列，其氨基酸序列等同于2008年12月9日由NCIMB保藏的克隆中(保藏 號是:NCIMB 41600)的VL序列，或包含1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基取代。結(jié)合成員可以包含在抗體構(gòu)架中具有一個或多個⑶R，例如一組⑶R的抗體分子。 例如，可以將抗體的一個或多個CDR或一組CDR嫁接入構(gòu)架(例如，人構(gòu)架)以提供抗體分 子。構(gòu)架區(qū)可包含人種系基因區(qū)段序列。因此，可以將構(gòu)架種系化(germlined)，從而將構(gòu)架 內(nèi)的一個或多個殘基更換以與大多數(shù)相似的人種系構(gòu)架中等價位置處的殘基相匹配。技術(shù) 人員可以選擇序列最接近種系化之前的抗體構(gòu)架序列的種系區(qū)段，并在本文所述試驗中測 試該抗體的親和力或活性以證實種系化未明顯降低抗原結(jié)合或效力。人種系基因區(qū)段序列 是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可以通過例如Vbase編譯(軟件)存取(參見Tomlinson， Journal of Molecular Biology，224，487-499，1997)。在一個實施方式中，本發(fā)明結(jié)合成員是具有包含人種系構(gòu)架中一組HCDR的VH結(jié) 構(gòu)域，例如Vhl_DP-7_(l-46)的分離人抗體分子。因此，VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)FRl、FR2和/或 FR3可包含人種系基因區(qū)段Vhl_DP-7_(l-46)的構(gòu)架區(qū)。FR4可包含人種系j區(qū)段JH1、 JH4或JH5 (這些j區(qū)段具有相同的氨基酸序列)的構(gòu)架區(qū)，或者可包含人種系j區(qū)段JH3 的構(gòu)架區(qū)。VH FRl的氨基酸序列可以是SEQ ID NO :442(殘基1_30)。VH FR2的氨基酸序 列可以是SEQ IDNO 442 (殘基36-49)。VH FR3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO 442 (殘 基66-94)。VH FR4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO :442 (殘基103-113)。結(jié)合成員通常 還具有VL結(jié)構(gòu)域，其包含例如人種系構(gòu)架，如νλ 1_DPL5中的一組IXDR。因此，VL結(jié)構(gòu)域 構(gòu)架區(qū)FR1、FR2和/或FR3可包含人種系基因區(qū)段νλ 1_DPL5的構(gòu)架區(qū)。FR4可包含人種 系j區(qū)段幾2或幾3(這些j區(qū)段具有相同的氨基酸序列)的構(gòu)架區(qū)。VL FRl的氨基酸序 列可以是SEQ ID N0:447(殘基1-23)。VL FR2的氨基酸序列可以是SEQ ID N0:447(殘 基35-49)。VL FR3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO :447(殘基57-88)。VL FR4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO :447(殘基98-107)。種系化的VH或VL結(jié)構(gòu)域可以在或不在一個 或多個微調(diào)殘基(Vernier residue)處種系化，但通常不在。本發(fā)明的抗體分子或VH結(jié)構(gòu)域可包 含下組重鏈構(gòu)架區(qū)FRl，SEQ ID NO :442(殘基 1-30)；FR2, SEQ ID NO :442(殘基 36-49)；FR3, SEQ ID NO :442(殘基 66-94)；FR4，SEQ ID NO :442 (殘基103-113)；或者，包含的所述一組重鏈構(gòu)架區(qū)含有1、2、 3、4、5或6個氨基酸改變，例如取代。本發(fā)明的抗體分子或VL結(jié)構(gòu)域可包含下組輕鏈構(gòu)架區(qū)FRl，SEQ ID NO :447 (殘基 1-23)；FR2, SEQ ID NO :447(殘基 35-49)；FR3, SEQ ID NO :447(殘基 57-88)；FR4，SEQ ID NO :447 (殘基98-107)；或者，包含的所述一組重鏈構(gòu)架區(qū)含有1、2、 3、4、5或6個氨基酸改變，例如取代。氨基酸改變可以是取代、插入(添加)或缺失。最常見的改變可能是取代。例如，本發(fā)明抗體分子可包含一組重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)，其中重鏈FRl 是 SEQ ID NO 192 (殘基 1-30)；重鏈FR2 是 SEQ ID NO 192 (殘基 36-49)；重鏈FR3 是 SEQ ID NO 192 (殘基 66-94)；重鏈FR4 是 SEQ ID NO 192 (殘基 103-113)；
輕鏈 FRl 是 SEQ ID NO 197 (殘基 1-23)；輕鏈FR2 是 SEQ ID NO 197 (殘基 35-49)；輕鏈FR3 是 SEQ ID NO 197 (殘基 57-88)；輕鏈FR4是SEQ ID NO 197 (殘基98-107)；或者，包含的所述一組重鏈及輕鏈構(gòu) 架區(qū)含有7個或更少的，例如6個或更少的的氨基酸改變，例如取代。例如，在所述一組重 鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)中可以有1或2個氨基酸取代。如實施例4. 2所示，抗體21-42是以抗體20為基礎(chǔ)的，但在⑶R及構(gòu)架區(qū)中有特 定的其它改變。像抗體20，抗體21-42結(jié)合hIL_4R α和cyIL_4R α。此類⑶R和/或構(gòu)架 取代因此可以視作任選的或額外的取代，從而產(chǎn)生結(jié)合力可能更大的結(jié)合成員。因而，除了在VH和VL結(jié)構(gòu)域的6個⑶R中任一之內(nèi)的取代外，結(jié)合成員還在構(gòu)架 區(qū)內(nèi)的以下殘基處包括一個或多個氨基酸取代，使用的是標(biāo)準(zhǔn)Kabat編號HFWl 中的 11、12;HFW2 中的 37、48;HFW3 中的 68、84、85 ；HFW4 中的 105、108、113 ；LFWl 中的 1、2、3、9 ；LFW2 中的 38、42 ；或LFW3 中的 58、65、66、70、74、85、87。合適的構(gòu)架取代示于圖1-4。本發(fā)明的結(jié)合成員可包含圖1-4中的一個或多個具體 取代。本發(fā)明的抗體分子或VH結(jié)構(gòu)域可以包含VH FR1，其中Kabat殘基11是Val或 Glu和/或Kabat殘基12是Lys或Arg ；本發(fā)明的抗體分子或VH結(jié)構(gòu)域可以包含VH FR2， 其中Kabat殘基37是Ala或Val和/或Kabat殘基48是Met或Val ；本發(fā)明的抗體分子 或VH結(jié)構(gòu)域可以包含VH FR3，其中Kabat殘基68是Ser、Ala或Thr和/或Kabat殘基84 是Ser或Pro和/或Kabat殘基85是Glu或Gly ；本發(fā)明的抗體分子或VH結(jié)構(gòu)域可以包 含VH FR4，其中Kabat殘基105是Lys或Asn和/或Kabat殘基108是GlruArg或Leu和 / 或 Kabat 殘基 113 是 Ser 或 Gly。本發(fā)明的抗體分子或VL結(jié)構(gòu)域可以包含VL FRl，其中Kabat殘基1是Gln或Leu 和/或Kabat殘基2是Ser或Pro或Ala和/或Kabat殘基3是Val或Ala和/或Kabat 殘基9是Ser或Leu ；本發(fā)明的抗體分子或VL結(jié)構(gòu)域可以包含VL FR2，其中Kabat殘基38 是Gln或Arg和/或Kabat殘基42是Thr或Ala ；本發(fā)明的抗體分子或VL結(jié)構(gòu)域可以包含 VL FR3，其中Kabat殘基58是Ile或Val和/或Kabat殘基65是Ser或Phe和/或Kabat 殘基66是Lys或Arg和/或Kabat殘基70是Ser或Thr和/或Kabat殘基74是Ala或 Gly和/或Kabat殘基87是Tyr或Phe。與種系化抗體相比，未種系化的抗體具有相同的CDR，但構(gòu)框架不同。這里的抗體 序列中，24PGL和37GL的VH和VL結(jié)構(gòu)域抗體是種系化的。圖5、6和7顯示了抗體1-42彼此之間的復(fù)合序列相同性。復(fù)合序列是關(guān)鍵⑶R 區(qū)的比對。因此,對于圖 5，這 6 個 CDR 結(jié)構(gòu)域(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2、HCDR3 ； 6x⑶R)已作比對，從而IXDRl的最后一個密碼子緊鄰IXDR2的第一個密碼子，IXDR2的最 后一個密碼子緊鄰LCDR3的第一個密碼子，等等。這就形成了一個缺少間插構(gòu)架區(qū)的序列。 復(fù)合序列可以是全部的CDR區(qū)，如圖5所示，或者只是重鏈或輕鏈CDR序列(分別如圖6和 圖7)。隨后可生成每一個抗體復(fù)合序列與另一抗體復(fù)合序列的序列比對，相同性得分在圖 5、6、7的圖表中表示。從圖5可以看到，關(guān)于全部的6個⑶R區(qū)，抗體1-42中的任一個與另 一個抗體的最低序列相同性是73% (這是抗體3與抗體23、25、37、37GL和41相比)；如果 排除抗體3，序列相同性是78%。僅比較三個重鏈⑶R(3xHCDR)區(qū)時，最低序列相同性在排 除抗體3時分別是75%和79%。僅比較三個輕鏈⑶R(3xIXDR)區(qū)時，最低序列相同性在排 除抗體3時分別是65%和75%。在一特定實施方式中，分離的結(jié)合成員與抗體1-42中任一個的6xCDR復(fù)合序列有 至少73%的氨基酸序列相同性。本發(fā)明另一個方面提供人白介素_4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其包 含一組 CDR =HCDRU HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，該結(jié)合成員與抗體 1-42 任一個 中直線、無任何間插構(gòu)架序列的HCDRl、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3的復(fù)合序列有 至少73%的氨基酸序列相同性。在一個特定實施方式中，分離的結(jié)合成員與抗體1-42中任 一個的復(fù)合序列有至少78%的氨基酸序列相同性。本發(fā)明的另一個方面提供人白介素_4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其 包含一組CDR =HCDRU HCDR2、HCDR3、LCDRU LCDR2和LCDR3，該結(jié)合成員與抗體1_42中任 一個的HCDR1、HCDR2、HCDR3的復(fù)合序列有至少75%的氨基酸序列相同性。本發(fā)明的另一個方面提供人白介素_4受體a (hIL_4Ra)的分離的結(jié)合成員，其包含一組 CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRU LCDR2 和 LCDR3，該結(jié)合成員與抗體 1_42 中任 一個的IXDR1、IXDR2、IXDR3的復(fù)合序列有至少65%的氨基酸序列相同性。 本發(fā)明的結(jié)合成員可以與任何結(jié)合成員競爭結(jié)合IL-4RCI (均結(jié)合IL_4Ra)的， 并包括本文披露的結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、⑶R(例如HCDR3)和/或⑶R組。不難 在體外檢驗結(jié)合成員之間的競爭，例如采用ELISA和/或用特定的報道分子給一種結(jié)合成 員作標(biāo)記(可在一種或多種其它未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下檢測)，從而能鑒定結(jié)合相同表 位或重疊表位的結(jié)合成員。例如，可采用ELISA測定競爭，其中IL-4Rα固定于平板，將標(biāo) 記的第一結(jié)合成員連同一種或多種未標(biāo)記的其它結(jié)合成員一起加入該平板。通過標(biāo)記的結(jié) 合成員發(fā)出的信號降低觀察到有能與標(biāo)記的結(jié)合成員競爭的未標(biāo)記結(jié)合成員存在。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員不難知曉這些方法，本文詳細(xì)描述了這些方法。在一個實施方式中，采用本文 所述的表位競爭試驗檢驗競爭結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合成員可包含與抗體分子競爭的抗體抗原 結(jié)合位點，例如特別是包含親代抗體或結(jié)合IL-4R α的抗體2-42中任一個的VH和/或VL 結(jié)構(gòu)域、CDR(例如HCDR3)或CDR組的抗體分子。本發(fā)明的諸方面提供與本文所述任何結(jié)合 成員競爭，例如與親代抗體或抗體2-42中任一種競爭結(jié)合IL-4Rci的結(jié)合成員，例如scFv 或IgGl或IgG2形式。與本文所述任何結(jié)合成員競爭結(jié)合IL-4Rα的結(jié)合成員可以具有本 文披露的本發(fā)明結(jié)合成員的任一種或多種結(jié)構(gòu)和/或功能特性。在其它方面，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明結(jié)合成員，如VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域 的分離核酸，以及制備本發(fā)明結(jié)合成員，如VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的方法，包括在所述 結(jié)合成員如VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域能產(chǎn)生的條件下表達(dá)所述核酸，以及回收。本發(fā)明另一方面提供編碼本文披露的VH⑶R或VL⑶R序列的核酸，通常是分離 的。另一方面提供含有本發(fā)明核酸或用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明其它方面提供含有本發(fā)明結(jié)合成員的組合物，和它們在抑制和/或中和 IL-4R α的方法中的應(yīng)用，包括治療人或動物體的方法。本發(fā)明的結(jié)合成員可用于治療或診斷人或動物體的方法，例如治療(可包括預(yù)防 性治療)人患者的疾病或病癥的方法，該方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明結(jié)合成 員?？砂凑毡景l(fā)明治療的病癥包括IL-4Rci、IL-4和/或IL-13在其中起作用的任何病癥， 如本文它處詳述的。下文進(jìn)一步詳述了本發(fā)明的這些和其它方面。術(shù)語本文中應(yīng)指出，本文使用“和/或”之處應(yīng)理解成具體公開了兩種所述特征或組分 的每一種，包括或不包括另一種。例如，“A和/或B”應(yīng)該理解成具體公開了(i)A、(ii)B 及(iii)A和B中每一種，就如同各自在本文中專門列出一樣。IL-4RaIL-4Ra是白介素_4受體a。除非另有表述，述及IL_4R α通常是指人IL_4Ra。 野生型成熟人IL-4Rci的序列以登錄號P24394保藏(Swiss-Prot)，其顯示包含信號肽的全 長 IL_4Ra。還對短尾猴IL-4R α作了內(nèi)部測序，短尾猴IL-4R α的cDNA序列如SEQID NO 455 所示。
如本文它處所述，IL-4RQ可以是重組體和/或可以是糖基化或非糖基化的。 IL-4Ra在體內(nèi)表達(dá)為N-連接的糖基化形式天然。糖基化IL-4Rci還可在重組系統(tǒng)，例如 在HEK EBNA細(xì)胞中表達(dá)。IL-4Rci還可在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)為非糖基化形式。結(jié)合 成員該術(shù)語描述了彼此結(jié)合的一對分子中的一個成員。結(jié)合對的成員可以天然產(chǎn)生 或完全或部分合成產(chǎn)生。分子對的一個成員在其表面具有一定區(qū)域或空腔，從而能結(jié)合該 分子對的另一成員，因此與之在特定空間和極性結(jié)構(gòu)上互補。各類型的結(jié)合對的例子是抗 原_抗體、生物素_親和素、激素_激素受體、受體_配體、酶-底物。本發(fā)明涉及抗原_抗 體型反應(yīng)。結(jié)合成員通常包括具有抗原結(jié)合位點的分子。例如，結(jié)合成員可以是抗體分子或 含有抗原結(jié)合位點的非抗體蛋白?？赏ㄟ^在例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等非抗體蛋白支架上排列⑶ROfaan和 Maggos, BioCentury,12(5) :A1_A6,2004 ;Koide, Journal of MolecularBiology, 284 1141-1151,1998 ；Nygren 等，Current Opinion in Structural Biology,7 :463_469, 1997)，或通過使蛋白支架內(nèi)環(huán)的氨基酸殘基隨機化或突變來提供抗原結(jié)合位點，從而能賦 予對所需靶標(biāo)的結(jié)合特異性。Nygren等(同上)詳細(xì)回顧了用于工程改造蛋白質(zhì)中新型 結(jié)合位點的支架。抗體模擬物的蛋白支架披露于通過引用全文納入本文的W0/0034784，其 中發(fā)明人描述了包含具有至少一個隨機化環(huán)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(抗體模擬 物)?？赏ㄟ^免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員提供要嫁接入一個或多個CDR，例如 一組HCDR或一個HCDR和/或IXDR3的合適支架。所述支架可以是人或非人蛋白。非抗體 蛋白支架的優(yōu)點之一是其可在至少比一些抗體分子更小和/或更易于制備的支架分子中 提供抗原結(jié)合位點。結(jié)合成員的體積小可賦予有用的生理學(xué)特性，例如能進(jìn)入細(xì)胞、更深地 穿透入組織或到達(dá)其它結(jié)構(gòu)內(nèi)的靶標(biāo)，或結(jié)合靶抗原的蛋白質(zhì)空腔內(nèi)。Wess在2004年回顧 了抗原結(jié)合位點在非抗體蛋白支架中的應(yīng)用。蛋白質(zhì)通常具有穩(wěn)定的骨架和一個或多個可 變環(huán)，其中所述一個或多個環(huán)的氨基酸序列經(jīng)專門或隨機突變從而產(chǎn)生與靶抗原結(jié)合的抗 原結(jié)合位點。這些蛋白質(zhì)包含金黃色葡萄球菌A蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連接素、纖連蛋白(例 如，第10個III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)和脂籠蛋白的IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其它方法包括西萊 科股份有限公司(Selecore GmbH)的合成“微體”，以環(huán)肽(cyclotide)為基礎(chǔ)的——含有 分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì)。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點，本發(fā)明的結(jié)合成員可包含其它氨基酸，例如 形成肽或多肽，如折疊域，或賦予該分子除結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明 結(jié)合成員可攜帶可檢測標(biāo)記物，或者可與毒素或靶向部分或酶偶聯(lián)(例如，通過肽鍵或接 頭)。例如，結(jié)合成員可包含催化位點(例如，在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點，其中所述 抗原結(jié)合位點與抗原結(jié)合，因此將催化位點靶向抗原。催化位點可以，例如通過切割來抑制 抗原的生物學(xué)功能。雖然知道非抗體支架可攜帶⑶R，但攜帶⑶R，例如⑶R3或本發(fā)明的一組⑶R 的結(jié)構(gòu)通常是抗體重鏈或輕鏈序列或其實質(zhì)部分，其中CDR或CDR組位于重排的免疫球 蛋白基因編碼的天然產(chǎn)生VH和VL抗體可變域的CDR或CDR組的相應(yīng)位置?？梢詤⒄?Kabat ((Sequences of Proteins of Immunologicallnterest列)，第 4 版。US Department of Health andHuman Devices (美國健康的人類服務(wù)部)， 1987)，及其更新，比如第5版(免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列，第5版。美國健康的人類服 務(wù)部，公益服務(wù)，NIH,華盛頓，1991年)確定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。除非有相反指示，本發(fā)明中的特定殘基以及CDR和構(gòu)架區(qū)的位置使用Kabat編號 體系。依Kabat等的定義(同上)，⑶R區(qū)域或⑶R是指示免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的 超變區(qū)?？贵w通常含有3個重鏈⑶R和3個輕鏈⑶R。本文利用術(shù)語⑶R表示(視情形而 定)這些區(qū)域中的一個或幾個或甚至全部，這些區(qū)域含有負(fù)責(zé)通過抗體與其識別的抗原或 表位的親和力來結(jié)合的大多數(shù)氨基酸殘基。在6個短⑶R序列中，重鏈的第三⑶R (HCDR3)的體積可變性較大(主要是因為產(chǎn) 生它的基因重排機制而導(dǎo)致差異較大)。其可短至2個氨基酸，雖然已知的最大長度是26。 從功能看，HCDR3在決定抗體特異性方面有部分作用(Segal等，PNAS，71 =4298-4302,1974 ； Amit 等，Science, 233 :747_753，1986 ；Chothia 等，J. Mol. Biol.，196 :901_917，1987 ； Chothia 等，Nature，342 :877_883，1989 ；等，J. Immunol.，144 1965-1968，1990 ；Sharon 等，PNAS，87 :4814-4817，1990(a) ；Sharon 等，J. Immunol.，144 :4863_4869，1990 ；Kabat 等，J. Immunol.，147 :1709_1719，1991b)。HCDRl的長度可以是5個氨基酸，由Kabat殘基31-35構(gòu)成。HCDR2的長度可以是17個氨基酸，由Kabat殘基50-65構(gòu)成。HCDR3可以是7個氨基酸長，由Kabat殘基95-102構(gòu)成。LCDRl的長度可以是13個氨基酸，由Kabat殘基24_34構(gòu)成。LCDR2可以是7個氨基酸長，由Kabat殘基50-56構(gòu)成。LCDR3可以是12個氨基酸長，由Kabat殘基89-97?？贵w分子該術(shù)語描述了無論天然或部分或完全合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語還涵蓋包 含抗體抗原-結(jié)合位點的任何多肽或蛋白質(zhì)。在本文中必須知道，本發(fā)明不涉及天然形式 的抗體，即它們不處于其天然環(huán)境中，但它們能經(jīng)純化從天然來源分離或獲得，或者可通過 遺傳重組或化學(xué)合成獲得，它們隨后可含有非天然氨基酸，下文將進(jìn)一步描述。含有抗體抗 原_結(jié)合位點的抗體片段包括但不限于諸如Fab、Fab\ Fab，_SH、scFv、Fv、dAb、Fd等分 子；和雙抗體(diabody)。本發(fā)明的抗體分子可以是IgG，例如IgGl、IgG4、IgG2或無糖基(aglycosyl) IgG2.可能利用單克隆抗體或其它抗體并采用重組DNA技術(shù)等技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合靶抗原 的其它抗體或嵌合型分子。這些技術(shù)可包括將編碼某抗體的免疫球蛋白可變區(qū)，或CDR 的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)。參見，例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，和大量的后續(xù)文獻(xiàn)?？蓪Ξa(chǎn)生抗體的雜交瘤或其它細(xì)胞作出遺 傳突變或其它改變，從而可改變或不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。 由于可以多種方式修飾抗體，術(shù)語“抗體分子”應(yīng)理解成涵蓋具有所需特異性，具 有抗體抗原_結(jié)合位點和/或能與抗原結(jié)合的任何結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語涵蓋抗 體片段和衍生物，包括含有抗體抗原_結(jié)合位點的任何多肽，而無論其是天然或完全或部 分合成的。因此包括包含抗體抗原-結(jié)合位點并與另一多肽(例如，衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類)融合的嵌合型分子，或其等價物。EP-A-0120694和EP-A-0125023 以及大量的后續(xù)文獻(xiàn)描述了嵌合型抗體的克隆和表達(dá)?？贵w工程改造領(lǐng)域中可用的其它技術(shù)能分離人和人源化抗體。例如，人雜交瘤的 制作方法可以參見Kontermann和Dubel (Antibody Engineering (抗體工程改造)，S-V公 司(Springer-Verlag)紐約，LLC 出版；2001 年，ISBN =3540413545)。例如以下許多出版 物詳細(xì)描述了產(chǎn)生結(jié)合成員的另一種現(xiàn)有技術(shù)-噬菌體展示W(wǎng)092/01047(下文進(jìn)一步討 論)和美國專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、 US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、 US6521404，Kontermarm和Dubel (同上)?？衫眯∈罂贵w基因被滅活并功能性替換為人抗 體基因、但小鼠免疫系統(tǒng)的其它組分維持完好的轉(zhuǎn)基因小鼠分離人抗體(Mendez等，Nature Genet,15(2) 146-156，1997)。 可借助寡核苷酸合成并在合適的表達(dá)載體中裝配產(chǎn)生基因，通過表達(dá)基因產(chǎn)生 合成的抗體分子，如 Knappik 等，(J. Mol. Biol. 296，57—86，2000)或 Krebs 等，(Journal oflmmunological Methods，254 :67_84，2001)所述?，F(xiàn)已證明完整抗體的片段可執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子是(i)由VL、 VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iii)由單 一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv)由VH或VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward等， Nature 341 544-546,1989 ；McCafferty 等，Nature,348 :552_554，1990 ；Holt 等，Trends in Biotechnology 21，484-490，2003) ； (ν)分離的 CDR 區(qū)域；(vi) F (ab ‘ )2 片段，其是包 含兩個連接的Fab片段的一種二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL 結(jié)構(gòu)域通過肽接頭相連，從而能連接兩個結(jié)構(gòu)域以形成抗原結(jié)合位點(Bird等，Science, 242,423-426,1988 ；Huston, PNAS USA，85，5879-5883，1988) ； (viii)雙特異性單鏈 Fv 二 聚體(PCT/US92/09965)和(ix)通過基因融合構(gòu)建的“雙抗體”，其是多價或多特異性片段 (W094/13804 ；Holliger 等，PNAS USA90 =6444-6448,1993a)?？赏ㄟ^包含連接 VH 和 VL 結(jié) 構(gòu)域的二硫鍵來穩(wěn)定Fv、scFv或雙抗體分子(Reiter等，Nature Biotech, 14 1239-1245， 1996)。還可制備包含與CH3結(jié)構(gòu)域相連的scFv的小體(minibody) (Hu等，Cancer Res.， 56，3055-3061，1996)。結(jié)合片段的其它例子是Fab，，其與Fab片段的區(qū)別在于在重鏈CHl 結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入少許殘基，包含抗體絞鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸，以及Fab’ -SH, 其是恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶游離巰基的Fab’片段?？赏ㄟ^例如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或化學(xué)還原以切割二硫鍵 等方法，從本文所述的任何抗體分子，例如包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或抗體1-42中任一 個的CDR的抗體分子開始獲得本發(fā)明的抗體片段。在另一種方式中，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的遺傳重組等技術(shù)，或者借助，例如自動肽合成儀，如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)等公司提供的那些儀器通過肽合成或通過核酸合成和表達(dá)來獲得本發(fā)明的抗 體片段。本發(fā)明的功能性抗體片段包括通過化學(xué)修飾，特別是通過PEG化，或通過摻入脂 質(zhì)體而增加半衰期的任何功能性片段。dAb (結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體性抗原結(jié)合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū) (Holt 等，Trends in Biotechnology 21，484-490，2003)。VH dAb 在駝科動物(例如，駱駝、美洲駝)中天然 產(chǎn)生，并可通過用靶抗原免疫駝類動物，分離抗原特異性B細(xì)胞和直接克隆 各B細(xì)胞的dAb基因來產(chǎn)生。還可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生dAb。體積小、溶解性良好和溫度穩(wěn) 定性使得它們在生理學(xué)上特別有用，從而適于選擇和親和力成熟。本發(fā)明的結(jié)合成員可以 是包含基本上如本文所述的VH或VL結(jié)構(gòu)域或包含基本上如本文所述一組CDR的VH或VL 結(jié)構(gòu)域的dAb。本文所用的短語“基本上所述”表示本文所述結(jié)合成員的VH或VL結(jié)構(gòu)域的相關(guān) CDR的特征與本文所述序列的特定區(qū)域相同或高度相似。如本文所述，對于一個或多個可變 區(qū)的指定區(qū)域，短語“高度相似”包括在VH或VL結(jié)構(gòu)域的CDR中可進(jìn)行1-約12個，例如 1-8，包括1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1_3個、1_2個氨基酸取代。本發(fā)明的抗體包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體構(gòu)成將兩個不同的可 變區(qū)組合在同一分子中的第二代單克隆抗體(Holliger，P.和Winter，G. 1999Cancer and metastasis rev. 18 =411-419,1999) 0現(xiàn)已證明它們因能募集新的效應(yīng)功能或靶向腫瘤 細(xì)胞表面的幾種分子而可用于診斷領(lǐng)域和治療領(lǐng)域。如果要利用雙特異性抗體，這些抗 體可以是用各種方法(Holliger等，PNAS USA90 :6444_6448，1993b)，例如化學(xué)方法制備 或從雜交瘤制備的常規(guī)雙特異性抗體，或者可以是上述雙特異性抗體片段的任一種。這 些抗體可以通過化學(xué)方法獲得(Glennie等，1987 J. Immunol. 139,2367-2375 ；Repp等， J. Hemat. 377-382，1995)或通過體細(xì)胞法(Staerz U. D.和 Bevan M. J. PNAS 83，1986 ；等， MethodEnzymol. 121 =210-228,1986)，但也可類似地采用遺傳工程技術(shù)，其強制進(jìn)行異源二 聚化，因而便于所需抗體的純化過程(Merchand等，Nature Biotech, 16 :677_681，1998)。 雙特異性抗體的例子包括BiTE 技術(shù)獲得的那些抗體，其中可以利用特異性不同的兩種抗 體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域并通過短的柔韌性肽直接相連。該抗體在短的單一多肽鏈上組合兩種抗 體?？芍焕每勺儏^(qū)構(gòu)建不含F(xiàn)c區(qū)的雙抗體和scFv，從而可能降低抗獨特型反應(yīng)的效應(yīng)?？蓪㈦p特異性抗體構(gòu)建成完整的IgG、雙特異性Fab' 2,Fab' PEG、雙抗體或者雙 特異性scFv。此外，可采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法連接兩個雙特異性抗體以形成四價抗體。與完整的雙特異性抗體相比，雙特異性雙抗體可能還特別有用，因為它們不難在 大腸桿菌中構(gòu)建并表達(dá)。采用噬菌體展示(W094/13804)不難從文庫中選擇結(jié)合特異性 合適的雙抗體(和許多其它多肽，例如抗體片段)。如果要將雙抗體的一根臂維持恒定， 例如對IL-4Ra的特異性，則可制備另一臂不同的文庫并選擇特異性合適的抗體?？扇?Ridgeway等(Protein Eng.，9 =616-621,1996)所述通過交替工程改造方法制備完整的雙 特異性抗體。本領(lǐng)域可采用各種方法獲得針對IL-4R α的抗體。這些抗體可以是單克隆抗體， 特別是人、鼠科、嵌合型或人源化來源的，這些抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。就制備單克隆抗體或它們的功能片段，特別是鼠源的而言，通?？赡苤甘謨?"Antibodies (抗體)” (Harlow 禾口 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室 手冊)，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(ColdSpring Harbor)紐 約，第 726 頁，1988)特別描述的技術(shù)或如 Kohler 和 Milstein (Nature，256 :495_497，1975) 所述從雜交瘤制備的技術(shù)。單克隆抗體可以從，例如用IL-4RCI或含有所述單克隆抗體識別的表位的它們片段之一免疫的動物細(xì)胞獲得。尤其可按照常規(guī)方法，通過自含有編碼IL-4Rα或其片段的 cDNA序列的核酸序列開始的遺傳重組，通過自包含在IL-4Ra和/或其片段的肽序列中的 氨基酸序列開始的肽合成來制備所述IL-4Rα或其片段之一。單克隆抗體可以利用，例如 親和柱純化，所述親和柱上已經(jīng)固定了含有所述單克隆抗體識別的表位的IL-4RCI或其片 段 之一。更具體地說，可通過A蛋白和/或G蛋白層析，然后進(jìn)行或不進(jìn)行離子交換層析以 除去自身中殘留蛋白污染物以及DNA和LPS，再進(jìn)行或不進(jìn)行瓊脂糖凝膠排阻層析以除去 因存在二聚體或其它多聚體而導(dǎo)致的潛在凝聚體來純化單克隆抗體。在一個實施方式中， 可以同時或連續(xù)采用所有這些技術(shù)?？乖Y(jié)合位點該術(shù)語描述了分子中結(jié)合靶抗原的全部或部分并與之互補的部分。在抗體分子 中，該術(shù)語表示抗體抗原-結(jié)合位點，包括抗體中結(jié)合靶抗原的全部或部分并與之互補的 部分。如果抗原較大，抗體可以只結(jié)合該抗原的特定部分，該部分稱為表位?？梢杂梢粋€ 或多個抗體可變區(qū)提供抗體抗原_結(jié)合位點?？贵w抗原_結(jié)合位點可包含抗體輕鏈可變區(qū) (VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。分離的該術(shù)語表示本發(fā)明的結(jié)合成員，或編碼這種結(jié)合成員的核酸通常合乎本發(fā)明的狀 態(tài)。因此，提供的本發(fā)明結(jié)合成員，包括VH和/或VL結(jié)構(gòu)域和編碼核酸分子及載體，可以是 例如從其天然環(huán)境分離的和/或純化的、基本上純的或均質(zhì)的形式，或者在核酸的情形中， 為不含或基本上不含編碼具有所需功能的多肽的序列以外來源的核酸或基因。分離的成員 和分離的核酸不含或基本上不含天然與其相連的物質(zhì)，例如在其天然環(huán)境或在體外或體內(nèi) 實施重組DNA技術(shù)之時在其制備環(huán)境(例如細(xì)胞培養(yǎng)液)中發(fā)現(xiàn)的其它多肽或核酸。可用 稀釋劑或佐劑配制諸成員和核酸，但為實際目的仍是分離的_例如，如果用于包被免疫測 定所用的微量滴定板，通常將這些成員與明膠或其它載體混合，或者用于診斷或治療中時， 將其與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以天然地或通過異源真核細(xì)胞(例 如，CHO或NS0(ECACC 85110503))的系統(tǒng)而糖基化，或者它們可以是(例如，如果在原核細(xì) 胞中表達(dá))非糖基化的。包含抗IL-4RCI抗體分子的異質(zhì)制品也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。例如，這些制品可 以是抗體混合物，所述抗體具有全長重鏈、缺乏C-末端賴氨酸的重鏈、糖基化程度不同和/ 或具有衍生化的氨基酸，例如N-末端谷氨酸環(huán)化以形成吡咯型谷氨酸殘基。如上所述，本發(fā)明結(jié)合成員能調(diào)節(jié)并可能中和IL-4RCI的生物學(xué)活性。如本文所 述，可以優(yōu)化本發(fā)明的IL-4RCI結(jié)合成員的中和效力。效力優(yōu)化通常包括使選擇的結(jié)合成 員的序列(通常是抗體的可變區(qū)序列)突變以產(chǎn)生結(jié)合成員文庫，然后檢驗效力并選擇更 強效的結(jié)合成員。因此，選擇的“效力優(yōu)化的”結(jié)合成員的效力可能高于產(chǎn)生文庫的結(jié)合成 員。然而，還可不經(jīng)優(yōu)化獲得高效力結(jié)合成員，例如可從最初的篩選，例如生物化學(xué)中和試 驗直接獲得高效力結(jié)合成員?！靶Я?yōu)化的”結(jié)合成員指結(jié)合或中和IL-4Rα的特定活性或 下游功能的效力得到優(yōu)化的結(jié)合成員。本文它處更詳細(xì)描述了試驗和效力。本發(fā)明提供效 力優(yōu)化的和未優(yōu)化的結(jié)合成員，以及優(yōu)化所選結(jié)合成員效力的方法。因此，本發(fā)明使得技術(shù) 人員能產(chǎn)生高效結(jié)合成員。雖然可采用效力優(yōu)化從給定的結(jié)合成員中產(chǎn)生效力較高的結(jié)合成員，但應(yīng)該注意甚至可以不用效力優(yōu)化而獲得高效結(jié)合成員。 在另一方面，本發(fā)明提供獲得能結(jié)合抗原的一種或多種結(jié)合成員的方法，該方法 包括使本發(fā)明的結(jié)合成員文庫與所述抗原接觸，選擇該文庫中能結(jié)合所述抗原的一種或多 種結(jié)合成員。該文庫可展示在顆粒或分子復(fù)合物上，例如可復(fù)制的遺傳包裝體applicable genetic package)，如酵母菌、細(xì)菌或細(xì)菌噬菌體(例如，T7)顆粒、病毒、細(xì)胞或共價、核糖 體或其它體外展示系統(tǒng)，各顆粒或分子復(fù)合物含有編碼展示于其上的抗體VH可變區(qū)和任 選展示的VL結(jié)構(gòu)域(如果存在的話)的核酸。以下文獻(xiàn)描述了噬菌體展示W(wǎng)092/01047 和例如，美國專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、 US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160 和 US6521404，各篇文獻(xiàn)通過引用的方式全文納入本文。選擇能結(jié)合抗原并展示在細(xì)菌噬菌體或其它文庫顆?；蚍肿訌?fù)合物上的結(jié)合成 員后，可從展示所述選擇的結(jié)合成員的細(xì)菌噬菌體或其它顆粒或分子復(fù)合物上獲得核酸。 這種核酸隨后可用于通過表達(dá)含有從展示所述選擇的結(jié)合成員的細(xì)菌噬菌體或其它顆粒 或分子復(fù)合物獲得核酸序列的核酸來產(chǎn)生結(jié)合成員或抗體VH或VL可變區(qū)。含所述選擇的結(jié)合成員的抗體VH區(qū)的氨基酸序列的抗體VH區(qū)可以是分離形式， 例如可以是包含這種VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員。還可以進(jìn)一步測試結(jié)合IL-4Rci的能力和/或與例如親代抗體分子(例如抗體1) 或優(yōu)化抗體分子，抗體分子2-42 (例如，scFv形式和/或IgG形式，如IgGl、IgG2或IgG4) 競爭結(jié)合IL-4Rci的能力。中和IL-4Rci的能力可如本文它處所述測試。本發(fā)明結(jié)合成員結(jié)合IL-4Ra的親和力與抗體1_42之一(例如，scFv或IgGl或 IgG2或IgG4形式)相同或更好。本發(fā)明結(jié)合成員中和IL-4Rci的生物學(xué)活性的效力與抗體1_42之一(例如，scFv 或IgGl或IgG2或IgG4形式)相同或更好?？梢栽诤线m條件下比較不同結(jié)合成員的結(jié)合親和力與中和效力?？梢灾苽浔疚墓_的抗體分子的變體并用于本發(fā)明。遵循計算化學(xué)中將多變量數(shù) 據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用到結(jié)構(gòu)/性質(zhì)_活性關(guān)系中去的最新潮流(Wold等，Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statisticsin Chemistry (化 學(xué)中的多變量數(shù)據(jù)分析.化學(xué)計量學(xué)-化學(xué)中的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué))(B. Kowalski著)，DR出 版公司(D. Reidel Publishing Company)，荷蘭多德雷赫特市(Dordrecht)，1984 (ISBN 90-277-1846-6))，抗體的定量活性-性質(zhì)關(guān)系可以用眾所周知的數(shù)學(xué)技術(shù)來推導(dǎo)，比如統(tǒng) 計回歸、模式識別和分類(Norman等，Applied Regression Analysis (應(yīng)用回歸分析).W-I 公司(Wiley-Interscience)；第 3 版(1998 年 4 月)ISBN 0471170828 ；Kandel,Abraham禾口 Backer, Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis (族分析中計算機輔助的推 理)· PHP 公司(Prentice Hall PTR)，(1995 年 5 月 11 日)，ISBN :0133418847 ；Principles of Multivariate Analysis :A User’ s Perspective ( ^^M^HfmM) ( 41 津統(tǒng)計學(xué)叢書(Oxford Statistical Science Series, No 22(紙件)).牛津大學(xué)出版社； (2000 年 12 月)，ISBN 0198507089 ；Witten 和 Frank, Data Mining =Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. ( —IS Java的實際機器學(xué)習(xí)工具和技術(shù))MK公司(Morgan Kaufmann) ； (1999年10月11日)，ISBN: 1558605525 ；Denison DGT.()， Holmes, CC.等，Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (非線性分類和回歸的貝葉斯方法)(威利出版社概 率論與統(tǒng)計學(xué)叢書(Wiley Series inProbability and Statistics))，約翰威利父子公 司(John ffiley&Sons) ； (2002 年 7 月)，ISBN 0471490369 ；Ghose, AK.和 Viswanadhan， VN. CombinatorialLibrary Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications inDrug Discovery(藥物發(fā)現(xiàn)中組合文庫設(shè)計和評估原理、軟件、工具和應(yīng) 用).ISBN 0-8247-0487-8)?？蓮目贵w序列、功能和三維結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗和理論模型(例如，分 析可能接觸的殘基或計算的理化特性)獲得抗體的特性，這些特性可單獨考慮，也可組合考慮ο由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的抗體抗原_結(jié)合位點通常由6個多肽環(huán)形成3 個來自輕鏈可變區(qū)(VL)，3個來自重鏈可變區(qū)(VH)。對原子結(jié)構(gòu)已知的抗體的分析闡明了 序列和抗體結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系(Chothia等，Journal Molecular Biology, 1992227,799-817 ;A1-Lazikani 等，Journal MolecularBiology 273(4) :927_948，1997)。 這些關(guān)系暗示，除了 VH結(jié)構(gòu)域中的第三區(qū)(環(huán))外，結(jié)合位點環(huán)具有少量主鏈構(gòu)象經(jīng)典結(jié) 構(gòu)之一。在特定環(huán)中形成經(jīng)典結(jié)構(gòu)顯示由其大小和在環(huán)及框架區(qū)的關(guān)鍵位點中存在某些殘 基決定(Chothia 等，Journal Molecular Biology 1992227, 799-817,1992 ；Al-Lazikani 同上)?？刹捎眠@種序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系研究預(yù)測序列已知但三維結(jié)構(gòu)未知的抗體中，對于 維持其⑶R環(huán)的三維結(jié)構(gòu)從而維持結(jié)合特異性至關(guān)重要的那些殘基。通過比較預(yù)測與前 導(dǎo)優(yōu)化實驗的結(jié)果可支持這些預(yù)測。在結(jié)構(gòu)方法中，使用任何可以免費獲取或購得的軟件 包，例如 WAM(Whitelegg 和 Rees，Prot. Eng. , 12 :815_824，2000 年)可產(chǎn)生抗體分子的模 型(Chothia等，Science，223 :755-758，1986年)。然后可采用蛋白質(zhì)目測和分析軟件包， 例如阿克賽勒里公司(Accelerys, Inc.)的 Insight II 或 De印 View(Guex 和 Peitsch， Electrophoresis, (1997) 18,2714-2723)評估CDR中各位置處可能的取代。然后可利用該 信息進(jìn)行可能對活性的影響最小或有利的取代。在CDR、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行取代所需的技術(shù)是本 領(lǐng)域廣為普及的。可以制備含有取代的變體序列，測試其結(jié)合和/或中和IL-4Ra的能力 和/或任何其它所需特性，其中的取代可以預(yù)計或無法預(yù)計對活性的影響是最小的或有利 的。本發(fā)明可利用序列由本文特別公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)氨基酸序列變 體，如本文所述。具體變體可以包含一個或多個氨基酸序列改變(一個氨基酸殘基的添加、 缺失、取代和/或插入)，可以小于約20個改變，小于約15個改變、小于約12個改變、小于 約10個改變、或小于約6個改變，可以是5、4、3、2或1個?？梢栽谝粋€或多個構(gòu)架區(qū)和/ 或一個或多個CDR中作出改變。改變通常不導(dǎo)致功能喪失，因此包含如此改變的氨基酸序 列的結(jié)合成員可保留結(jié)合和/或中和IL-4Ra的能力。例如，其可保留與未作改變的結(jié)合 成員同樣的定量結(jié)合和/或中和能力，例如在本文所述試驗中測得。包含如此改變的氨基 酸序列的結(jié)合成員結(jié)合和/或中和IL-4Ra的能力可能提高。的確，從抗體20的隨機誘變 生成的抗體21-42相對于抗體20顯示有取代發(fā)生，主要是在各框架區(qū)域內(nèi)，而且其中的每一個仍然結(jié)合和/或中和IL-4Rci，事實上有一些還表現(xiàn)出改善的結(jié)合和/或中和IL-4Rci 的能力。改變可包括用非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸替代一個或多個氨基酸殘基，將一個或 多個氨基酸殘基修飾成非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn)形式，或者將一個或多個非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn) 氨基酸插入序列。本文它處描述了本發(fā)明序列中改變的示例性數(shù)目和位置。天然產(chǎn)生的氨 基酸包括20種“標(biāo)準(zhǔn)” L-氨基酸，根據(jù)它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母密碼鑒別為G、A、V、L、I、M、P、F、 W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸包括可摻入多肽主鏈中的任何其它殘基或由 現(xiàn)有氨基酸殘基修飾產(chǎn)生。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以是天然產(chǎn)生的 或非天然產(chǎn)生的。本領(lǐng)域已知 幾種天然的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙?；z氨 酸等(Voet和Voet，Biochemistry(生物化學(xué))，第2版，1995，威利公司(Wiley))。在其 N-α位置衍生的那些氨基酸殘基只位于氨基酸序列的N-末端。在本發(fā)明中，氨基酸通常 是L-氨基酸，但在一些實施方式中，也可以是D-氨基酸。因此，改變包括將L-氨基酸修飾 成D-氨基酸，或用D-氨基酸替代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙?；?或磷酸化形式 也是已知的，在本發(fā)明中，氨基酸可進(jìn)行這種修飾。本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的氨基酸序列可包含上述非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸。在一些實施方式中，可以在合成期間將非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如，D-氨基酸)摻入氨基酸 序列，雖然在其它實施方式中，可以在合成氨基酸序列后通過修飾或替代“原始的”標(biāo)準(zhǔn)氨 基酸的方式引入非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。利用非標(biāo)準(zhǔn)和/或非天然產(chǎn)生的氨基酸能增加結(jié)構(gòu)和功能差異，因此能增加本發(fā) 明結(jié)合成員獲得所需IL-4Ra結(jié)合與中和特性的可能性。此外，與標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸相比，D-氨 基酸和類似物已顯示更好的藥代動力學(xué)分布概況，因為具有L-氨基酸的多肽在給予動物， 例如人后會體內(nèi)降解?？刹捎秒S機誘變一個或多個選擇的VH和/或VL基因以在整個可變區(qū)中產(chǎn)生突 變，從而產(chǎn)生本發(fā)明的攜帶CDR衍生序列的新型VH或VL結(jié)構(gòu)域。Gram等(Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA,89 =3576-3580,1992)描述了這種技術(shù)，他采用易錯PCR。在一些實施方式中，在 整個可變區(qū)或CDR組中作出一個或兩個氨基酸取代。可采用的另一種方法是直接誘變VH 或 VL 基因的 CDR 區(qū)域。Barbas 等(Proc. Natl. Acad. Sci. ,91 :3809_3813，1994)和 Schier 等(J. Mol. Biol. 263 :551-567，1996)公開了這些技術(shù)。本領(lǐng)域已知所有上述技術(shù)，技術(shù)人員能采用這些技術(shù)，從而能利用本領(lǐng)域常規(guī)方 法提供本發(fā)明結(jié)合成員。本發(fā)明另一方面提供獲得IL-4RCI的抗體抗原結(jié)合位點的方法，該方法包括通過 將一個或多個氨基酸添加、刪除、取代或插入本文所示VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列來提供VH結(jié) 構(gòu)域，其是本文所示VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體，任選組合如此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個或 多個VL結(jié)構(gòu)域，并測試該VH結(jié)構(gòu)域或一種或多種VH/VL組合以鑒定IL-4R α的結(jié)合成員 或抗體抗原結(jié)合位點，和任選一種或多種功能特性，例如中和IL-4Ra活性的能力。所述VL 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列基本上如本文所示?？刹捎妙愃品椒ǎ渲斜疚墓_的VL結(jié)構(gòu)域的一 個或多個序列變體與一個或多個VH結(jié)構(gòu)域組合。如上所述，所攜帶的基本上如本文所示的CDR氨基酸序列可以是人抗體可變區(qū)中 的CDR或其實質(zhì)性部分?；旧先绫疚乃镜腍CDR3序列代表著本發(fā)明的諸多實施方式，例如攜帶的各這些序列可以是人重鏈可變域中的HCDR3或其實質(zhì)性部分。本發(fā)明所用的可變域可以從任何種系或重排人可變域獲得或衍生，或者可以是基 于已知人可變域的共有或?qū)嶋H序列的合成可變域?？勺儏^(qū)可以衍生自非人抗體。可以采 用重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的⑶R序列(例如，⑶R3)引入缺乏⑶R (例如，⑶R3)的可變區(qū) 庫(repertoire) 例如，Marks 等(Bio/Technology, 10 779-783,1992)描述了產(chǎn)生抗體 可變區(qū)庫的方法，其中可變區(qū)5’端處或與之毗鄰的共有引物與人VH基因的第三構(gòu)架區(qū)的 共有引物連用以提供缺乏⑶R3的VH可變區(qū)庫。Marks等還描述了如何將該庫與特定抗體 的⑶R3組合。采用類似的技術(shù)，本發(fā)明的⑶R3衍生序列可以與缺乏⑶R3的VH或VL結(jié)構(gòu) 域庫改組，改組的完整VH和VL結(jié)構(gòu)域與同源VL或VH結(jié)構(gòu)域組合以提供本發(fā)明的結(jié)合成 員。然后可以在合適的宿主系統(tǒng)中展示該庫，因而可以選擇合適的結(jié)合成員，其中的宿主系 統(tǒng)可以是通過引用方式全文納入本文的W092/01047或包括Kay、Winter和McCafferty的 文獻(xiàn)(Phage Display ofPeptides and Proteins :A Laboratory Manual (月太禾口蛋白質(zhì)的唾 菌體展示實驗室手冊)，圣迭戈學(xué)術(shù)出版社，1996)在內(nèi)的大量后續(xù)文獻(xiàn)中的噬菌體展示 系統(tǒng)。一個庫可由IO4以上單個成員的構(gòu)成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至 少IO9或至少IOki個成員。其它合適的宿主系統(tǒng)包括但不限于酵母菌展示、細(xì)菌展示、T4 展示、病毒展示、細(xì)胞展示、核糖體展示和共價展示。Stemmer (Nature，370 :389_391，1994)還公開了類似改組或重組技術(shù)，他描述的 是涉及內(nèi)酰胺酶基因的技術(shù)，但指出該方法可以用于生成抗體。提供了制備IL-4RCI抗原的結(jié)合成員的方法，該方法包括(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫，所述核酸包含待替代的⑶R3或缺乏⑶R編 碼區(qū)；(b)將所述核酸庫與編碼基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供體核酸組 合，從而將所述供體核酸插入核酸庫的CDR3區(qū)域，進(jìn)而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸產(chǎn)物庫；(c)表達(dá)所述產(chǎn)物庫的核酸；(d)選擇IL-4Rci的結(jié)合成員；和(e)回收所述結(jié)合成員或其編碼核酸。還可采用類似方法，其中本發(fā)明的VL⑶R3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸庫組合，所述 核酸包含待替代的⑶R3或缺乏⑶R3編碼區(qū)。類似地，可以利用本文公開的其它VH和VL結(jié)構(gòu)域，多組⑶R和多組HCDR和/或 多組IXDR。類似地，可以將一個或多個或所有3個⑶R嫁接入VH或VL結(jié)構(gòu)域庫，然后篩選該 庫中IL-4Rci的一種或多種結(jié)合成員?；蛘?，編碼本發(fā)明任一結(jié)合成員例如抗體1-42中的VH和/或VL域的核酸可經(jīng)誘 變(例如靶向的或隨機的)生成一種或多種突變型核酸。隨后可以生成由這些序列編碼的 結(jié)合成員。在一個實施方式中，可以采用抗體1-42HCDR1、HCDR2和HCDR3、或抗體1_42組 HCDR中的一種或多種，和/或可以采用抗體1-42IXDR1、IXDR2和IXDR3或抗體1_42組IXDR 中的一種或多種。 本發(fā)明一個方面提供一種生產(chǎn)結(jié)合IL-4RCI的結(jié)合成員的方法，該方法包括
提供編碼VH結(jié) 構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的起始核酸，或各自編碼VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的 核酸起始庫，其中的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或者包含即將被置換的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3 或者缺乏⑶R1、⑶R2和/或⑶R3編碼區(qū)；將所述起始核酸或起始核酸庫與編碼抗體1-42中任一抗體的⑶R1、⑶R2、和/或 CDR3的氨基酸序列或由其突變所產(chǎn)生的一種或多種供體核酸組合，從而使一個或多個所述 供體核酸插入起始核酸或起始核酸庫中的CDRl、CDR2和/或CDR3區(qū)，以便提供編碼VH或 VL域的產(chǎn)物核酸庫；表達(dá)所述產(chǎn)物庫中的核酸，產(chǎn)生產(chǎn)物VH或VL結(jié)構(gòu)域；可任選地，將所述產(chǎn)物VH或VL結(jié)構(gòu)域與一個或多個陪伴VL或VH結(jié)構(gòu)域 (companion VL or VH domain)合并；選擇一個IL-4Rci結(jié)合成員，該結(jié)合成員包括產(chǎn)物VH或VL結(jié)構(gòu)域以及任選的陪 伴VL或VH結(jié)構(gòu)域；以及回收所述結(jié)合成員或其編碼核酸。在特定實施方式中，供體核酸通過VH或VL結(jié)構(gòu)域或其中的任意CDR區(qū)的靶向或 隨機誘變產(chǎn)生。在另一個實施方式中，產(chǎn)物VH或VL結(jié)構(gòu)域連接于抗體恒定區(qū)。在另一個實施方式中，產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域以及陪伴VL結(jié)構(gòu)域或VH結(jié)構(gòu) 域分別包含在IgG、scFV或Fab抗體分子中。在另一個實施方式中，測試回收的結(jié)合成員或抗體分子中和IL-4RCI的能力。在另一個實施方式中，抗體分子配制成包含至少一種附加組分的組合物。例如，這 樣的組分可以是惰性藥物賦形劑或載體。在一個實施方式中，免疫球蛋白可變域的實質(zhì)性部分包含至少所述三個⑶R區(qū)， 以及它們的間插框架區(qū)。該部分還可包含至少約50%的第一或第四構(gòu)架區(qū)或二者，所述 50%是第一構(gòu)架區(qū)的C-末端50%和第四構(gòu)架區(qū)的N-末端50%?？勺儏^(qū)的實質(zhì)性部分的 N-末端或C-末端處其它殘基可以是通常不與天然產(chǎn)生的可變區(qū)相連的那些殘基。例如，通 過重組DNA技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合成員可導(dǎo)致將引入以促進(jìn)克隆或其它操作步驟的接頭 所編碼的N-或C-末端殘基引入。其它操作步驟包括引入接頭以連接本發(fā)明的可變區(qū)與包 含抗體恒定區(qū)、其它可變區(qū)(例如，在雙抗體的產(chǎn)生中)或可檢測/功能標(biāo)記物的其它蛋白 質(zhì)序列，如本文它處詳述的。雖然在本發(fā)明的一些方面，結(jié)合成員包含一對VH和VL結(jié)構(gòu)域，但基于VH或VL結(jié) 構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成本發(fā)明的其它方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，特別是 VH結(jié)構(gòu)域能以特定方式結(jié)合靶抗原。例如，參見以上dAb的討論。在每一種單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情形中，可用這些結(jié)構(gòu)域篩選能形成與IL-4RCI能結(jié) 合的兩維結(jié)合成員的互補結(jié)構(gòu)域?？刹捎靡砸梅绞饺募{入的W092/01047公開的所謂 分級雙重組合方案，通過噬菌體展示篩選方法實施，其中含有H或L鏈克隆的各集落用于感 染編碼另一鏈(L或H)的克隆的完整文庫，按照噬菌體展示技術(shù)，例如該參考文獻(xiàn)中描述的 那些技術(shù)選擇得到的雙鏈結(jié)合成員。Marks等(Bio/TechnologyaO :779-783，1992)也披 露了該技術(shù)。本發(fā)明的結(jié)合成員還可包含抗體恒定區(qū)或其諸部分，例如人抗體恒定區(qū)或其諸部分。例如，可將VL結(jié)構(gòu)域在其C-末端與包括人Ck或CX鏈，例如CX鏈在內(nèi)的抗體輕鏈 恒定區(qū)相連。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可以在其C-末端與衍生自任何抗體同種 型，例如 IgG、IgA、IgD、IgE、IgY 和 IgM 和任何同種型亞類(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAljP IgA2 ；特別是IgGl和IgG4)的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如，CHl結(jié)構(gòu)域) 相連。IgGl因其效應(yīng)功能和便于操作而優(yōu)選。具有這些特性并穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成或其 它恒定區(qū)變體也可用于本發(fā)明實施方式中。術(shù)語“同種型”指 抗體的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的分類。抗體的恒定區(qū)不參與抗原結(jié) 合，但具有各種效應(yīng)功能。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將給定的人抗體或免疫球蛋 白指定為物種主要免疫球蛋白類型之一 IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類型中的若干類 型可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgGl ( Y 1)、IgG2 (γ 2), IgG3 ( γ 3)、和IgG4 ( γ 4)以及 IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y和μ。 不同類型的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。在各種人免疫球蛋白分子類型 中，已知只有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM能激活補體。已知人IgGl和IgG3在人體中介 導(dǎo)ADCC。人輕鏈恒定區(qū)可分成兩個主要類型，即κ和入?？贵w形式本發(fā)明還包括具有修飾的IgG恒定結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明結(jié)合成員，特別是本發(fā)明的抗 體。在本發(fā)明的某些實施方式中，使用了具有諸如血清半衰期長且能夠介導(dǎo)各種效應(yīng) 功能的功能特征的人IgG類型的抗體(單克隆抗體原理和應(yīng)用(Monoclonal Antibodies Principles and Applications)，威利斯公司(Wiley-Liss，Inc.)，第 1 章(1995))。人 IgG 類抗體還可分為以下四種子類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。迄今為止，進(jìn)行了有關(guān)IgG類抗 體效應(yīng)物功能ADCC和CDC的大量研究，曾報道在IgG類抗體中，IgGl子類在人體中的ADCC 活性和 CDC 活性最高(Chemical Immunology, 65，88 (1997))?？贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用摂和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中非特異性 細(xì)胞毒性細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)能識別靶細(xì)胞上結(jié)合 的抗體，隨后引起靶細(xì)胞裂解。在一個實施方式中，這類細(xì)胞是人細(xì)胞。雖然不希望受任 何特定作用機理的限制，但介導(dǎo)ADCC的這些細(xì)胞毒性細(xì)胞通常表達(dá)Fc受體(FcR)。介導(dǎo) ADCC的原始細(xì)胞NK細(xì)胞表達(dá)Fc ^1 111，而單核細(xì)胞表達(dá)？(；￥1 1、FcyRII, FcyRIII和/ 或 Fc γ RIV0 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9 :457_92 (1991)小結(jié)了造血細(xì)胞上的 FcR表達(dá)情況。為了評估分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC實驗，如美國專利5，500，362 或5，821，337所述。可用于這類測定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷 (NK)細(xì)胞。或者或此外，可在體內(nèi)評價感興趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等的Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)所述的動物模型中進(jìn)行評價?！把a體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”指某分子啟動補體活化和在補體存在下裂解 靶點的能力。通過補體系統(tǒng)第一組分(Clq)與復(fù)合關(guān)聯(lián)抗原的分子(如抗體)結(jié)合，啟動 補體激活途徑。為了評估補體激活，可進(jìn)行⑶C測定，如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods, 202 163 (1996)所述。人IgGl亞類抗體的ADCC活性和⑶C活性的表現(xiàn)通常包括抗體Fc區(qū)與效應(yīng)細(xì)胞 如殺傷細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞表面上的該抗體受體(下文中稱為“Fe γ R”)結(jié)合?？山Y(jié)合各種補體組分。關(guān)于結(jié)合，有文獻(xiàn)提示抗體的絞鏈區(qū)和C區(qū)第二結(jié)構(gòu)域(下文 中稱為“C γ 2結(jié)構(gòu)域”)中的若干氨基酸殘基至關(guān)重要(Eur. J. Immunol.，23，1098 (1993)， Immunology, 86，319 (1995)，Chemical Immunology, 65，88 (1997)), Cy2 結(jié)構(gòu)域中的糖鏈也 很重要(ChemicalImmunology，65，88(1997))?！靶?yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多 種FcR并執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。該細(xì)胞至少表達(dá) Fc γ RI、FC γ RII、Fc γ RIII和/或Fc γ RIV并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞 的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中 性粒細(xì)胞。使用術(shù)語“Fe受體”或“FcR”描述結(jié)合于抗體Fc區(qū)的受體。在一個實施方式中，F(xiàn)cR 是天然序列人FcR。而且，在某些實施方式中，F(xiàn)cR結(jié)合于IgG抗體(γ受體)，包括Fc YRI、 Fc γ RII、Fc γ RIII和Fc γ RIV亞型的受體，包括這些受體的等位基因變體和另路剪接形 式。Fc γ RII受體包括Fc γ RIIA ( “活化受體”)^P Fc y RIIB ( “抑制受體”)，它們具有相似 的氨基酸序列，主要是其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同?；罨荏wFc γ RIIA的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免 疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體酪氨酸 抑制基序(ITIM)。(參見，Daeron, Annu. Rev. Immunol.，15 203-234 (1997))。Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol.，9 :457_92(1991) ；Capel 等，Immunomethods，4 :25_34(1994)； 和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. , 126 330-41 (1995)對 FcR 進(jìn)行了綜述。本文所用術(shù)語 “FcR”還涵蓋其他FcR，包括那些將來鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，該受體 負(fù)責(zé)將母體 IgG 轉(zhuǎn)移到胎兒(Guyer 等，Immunol.，117 587(1976)和 Kim 等，J. Immunol.， 24 :249(1994))。可修飾抗-IL-4R α抗體的效應(yīng)功能，以提高該抗體的ADCC和/或補體依賴性細(xì) 胞毒性(⑶C)?？赏ㄟ^在抗體Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸取代實現(xiàn)這一目的。也可將 半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣，可產(chǎn)生內(nèi)化能力提高 和/或補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷能力和ADCC增強的同源二聚體抗體(Caron等，J. Exp. Med.， 176 1191-1195(1992)和 Shopes, J. Immunol.，148 :2918_2922 (1992))。也可利用異源 雙功能交聯(lián)劑產(chǎn)生抗腫瘤活性提高的同源二聚體抗體(Wolff等，Cancer Research, 53 2560-2565 (1993))。也可對抗體進(jìn)行工程改造，使其具有兩個或更多個Fc區(qū)，從而增強補 體裂解和 ADCC 能力(Stevenson 等，Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230(1989))。本領(lǐng)域已知工程改造抗體Fc區(qū)以改變效應(yīng)功能的其它方法(例如，Koenig等的 美國專利公開號20040185045和PCT公開號WO 2004/016750，它們描述了改變Fc區(qū)以便 與FC γ RIIA結(jié)合親和力相比，提高與Fc γ RIIB的結(jié)合親和力；另參見Armour等的PCT公 開號WO 99/58572、Idusogie等的WO 99/51642和Deo等的美國6，395，272 ；通過引用將其 全文納入本文)。本領(lǐng)域也了解修飾Fc區(qū)以降低與FcyRIIB的結(jié)合親和力的方法(例如， Ravetch等的美國專利公開號20010036459和PCT公開號WO 01/79299，通過引用將其全文 納入本文)。也記載過具有與野生型Fc區(qū)相比，與Fc γ RIIIA和/或Fc γ RIIA結(jié)合親和力 提高的變異Fc區(qū)的修飾抗體(如，Stavenhagen等的PCT公開號WO 2004/063351，通過引 用將其全文納入本文)。已發(fā)現(xiàn)至少四種不同類型的Fc γ R，它們分別稱為Fc γ RI (CD64)、Fc y RII (CD32)、 FcyRIII(CD16)禾口 Fc yRIV。在人中，F(xiàn)c γ RII 禾口 Fc γ RIII 還分另Ij 分為 Fc y RIIa 禾口FcyRIIb,以及Fc γ RIIIa和FcyRIIIb。Fc γ R是屬于免疫球蛋白超家族的膜蛋白， Fc γ RII、Fc γ RIII和Fc γ RIV具有胞外區(qū)含有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的α鏈作為結(jié)構(gòu) 組分，F(xiàn)c γ RI具有胞外區(qū)含有三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的α鏈作為結(jié)構(gòu)組分，α鏈與IgG 結(jié)合活性有關(guān)。此外，F(xiàn)c γ RI和Fc γ RIII具有、鏈或ζ鏈結(jié)構(gòu)組分，其是具有α鏈相 關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的組成型組分(Annu. Rev. Immunol.，18,709(2000)，Annu. Rev. Immunol.， 19，275 (2001))。Bruhns 等，Clin. Invest. Med.(加拿大)27 :3D (2004)記載了 Fc y RIV。為了評估感興趣抗-IL-4RCI抗體的ADCC活性，可采用體外ADCC實驗，如美國專 利號US5500362或US5821337所述。也可采用市售試劑盒，如CytoTox 96 (普洛麥格 公司(Promega))進(jìn)行該實驗。可用于這類測得的效應(yīng)物細(xì)胞包括但不限于外周血單核 細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞和NK細(xì)胞系。表達(dá)轉(zhuǎn)基因Fc受體(如CD16)和相關(guān)信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽(如FC ε RI-Y)的NK細(xì)胞系也可用作效應(yīng)細(xì)胞(參見例如Campbell的WO 2006/023148A2)。例如，可測定特定抗體通過補體活化和/或ADCC介導(dǎo)靶細(xì)胞裂解的能力。 在體外培養(yǎng)和標(biāo)記感興趣的細(xì)胞；將抗體與免疫細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述免疫細(xì)胞可 以是由抗原抗體復(fù)合物激活的免疫細(xì)胞，即參與ADCC應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞。也可檢測抗體的補 體激活。在任一種情況下，通過裂解細(xì)胞釋放的標(biāo)記來檢測靶細(xì)胞的細(xì)胞裂解?？赏ㄟ^檢 測釋放到上清液中的胞質(zhì)蛋白(如LDH)來確定靶細(xì)胞裂解程度。實際上，可利用患者自身 的血清作為補體和/或免疫細(xì)胞來源來篩選抗體。然后，將能夠在體外實驗中介導(dǎo)人ADCC 的抗體用于治療該特定患者。也可在體內(nèi)評價感興趣分子的ADCC活性，例如在Clynes等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 =652-656(1998)所述的動物模型中進(jìn)行評價。而且，調(diào)節(jié)(即 提高或降低)抗體的ADCC水平和任選的CDC活性的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見例如，美國 專利US6194551。本發(fā)明抗體可能能夠或可能經(jīng)修飾而能夠誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C。可利用 人效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行測定ADCC功能的實驗，以評估人ADCC功能。這類實驗也可包括用于篩選 通過壞死和/或凋亡機制誘導(dǎo)、介導(dǎo)、增強、阻斷細(xì)胞死亡的抗體的實驗。這類方法包括利 用活細(xì)胞染料的實驗、檢測和分析胱冬酶的方法以及測定DNA斷裂的實驗，它們可用于評 估與感興趣抗-IL-4Ra抗體一起體外培養(yǎng)的細(xì)胞的凋亡活性。例如，可以如Decker 等，Blood (USA) 103 =2718-2725 (2004)所述進(jìn)行膜聯(lián)蛋白 V 或TdT-介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)實驗來檢測凋亡活性。TUNEL實驗包括將培養(yǎng) 感興趣細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的dUTP —起培養(yǎng)，使熒光素標(biāo)記的dUTP摻入DNA鏈斷裂處。然 后加工處理細(xì)胞，以便用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。膜聯(lián)蛋白V實驗利用偶聯(lián)熒光素的膜聯(lián)蛋 白V檢測凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜外側(cè)出現(xiàn)的磷脂酰絲氨酸(PS)，所述偶聯(lián)熒光素的膜聯(lián)蛋白V能 特異性識別暴露的PS分子?？刹⑿惺褂没罴?xì)胞染料如碘化丙錠，以排除晚期凋亡細(xì)胞。用 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V對細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。因此，本發(fā)明的又一方面提供結(jié)合成員，具體是抗體，其經(jīng)修飾從而改變，例如提 高、降低或去除結(jié)合成員的生物效應(yīng)功能，例如Fc區(qū)經(jīng)修飾的抗體。在一些實施方式中，在 此揭示的結(jié)合成員或抗體可以經(jīng)修飾以提升其固定補體和參與補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng) (CDC)的能力。在其它實施方式中，結(jié)合成員或抗體可以經(jīng)過修飾以提升其活化效應(yīng)細(xì)胞和 參與補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(CDC)的能力。在另一些實施方式中，在此揭示的結(jié)合成員 或抗體可以經(jīng)過修飾同時提升其活化效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(ADCC)的 能力以及提升其固定補體并參與補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(CDC)的能力。
在一些實施方式中，在此揭示的結(jié)合成員或抗體可經(jīng)修飾以降低其固定補體和參 與補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(CDC)的能力。在其它實施方式中，結(jié)合成員或抗體可以經(jīng)修 飾以降低其活化效應(yīng)細(xì)胞并參和抗體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(ADCC)的能力。在另一些實施 方式中，在此揭示的結(jié)合成員或抗體可經(jīng)修飾同時降低其活化效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體依賴性 細(xì)胞毒性反應(yīng)(ADCC)的能力以及降低其固定補體和參與補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(CDC) 的能力。在一個實施方式中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員ADCC活性增強。在 一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員ADCC活性比可比分子高至少2倍、或至少3 倍、或至少5倍、或至少10倍 、或至少50倍或至少100倍。在另一具體實施方式
中，與可比 分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體Fc YRIIIA的結(jié)合增強且ADCC活性增強。在 其它實施方式中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員ADCC活性提高、血清半衰期延 長。在一個實施方式中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員的ADCC活性下降。 在一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員的ADCC活性比可比分子低至少2倍、或至 少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在另一具體實施方式
中，與 可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體Fc YRIIIA的結(jié)合水平降低且ADCC活性 下降。在其它實施方式中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員ADCC活性下降但血清 半衰期延長。在一個實施方式中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員CDC活性增強。在 一個具體實施方式
中，有Fc變異且的結(jié)合成員CDC活性比可比分子高至少2倍、或至少3 倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍或至少100倍。在其它實施方式中，與可比分子 相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員ADCC活性提高且血清半衰期延長。在一個實施方式中，相對于可比分子，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員對一種或多種Fc配 體的結(jié)合水平降低。在另一實施方式中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc配體的親和力比可比 分子低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少 30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、 或至少100倍或至少200倍。在一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體 的結(jié)合水平降低。在另一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體Fc γ RIIIA 的結(jié)合水平降低。在一個具體實施方式
中，本文所述的有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體 Fc YRIIIA的親和力比可比分子的低至少5倍，其中所述Fc變體與Fc受體Fc y RIIB的親 和力是可比分子親和力的約2倍以內(nèi)。在又一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員 與Fc受體FcRn的結(jié)合水平降低。在再一具體實施方式
中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū) 的結(jié)合成員與Clq的結(jié)合水平降低。在一個實施方式中，相對于可比分子，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員對一種或多種Fc配 體的結(jié)合水平增高。在另一實施方式中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc配體的親和力比可 比分子的高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或 至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90 倍、或至少100倍或至少200倍。在一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體 的結(jié)合水平增高。在另一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體Fc YRIIIA的結(jié)合水平增高。在又一具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體Fc y RIIB的 結(jié)合增強。在再一個具體實施方式
中，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Fc受體FcRn的結(jié)合水平 增高。在又一個具體實施方式
中，與可比分子相比，有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員與Clq的結(jié)合 水平增高。在一個實施方式中，本發(fā)明抗-IL-4R α抗體包含變異Fc結(jié)構(gòu)域，其中與可比的非 變異Fc結(jié)構(gòu)域相比，所述變異Fc結(jié)構(gòu)域與Fc γ受體IIB的結(jié)合親和力增強。在另一實施 方式中，本發(fā)明抗-IL-4Ra抗體包含變異Fc結(jié)構(gòu)域，其中與可比的非變異Fc結(jié)構(gòu)域相比， 所述變異Fc結(jié)構(gòu)域與Fc γ受體IIB的親和力高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至 少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、 或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。在一個實施方式中，本發(fā)明提供有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員或包含這些物質(zhì)的制劑， 其中Fc區(qū)在一個或多個選自下組的位置上包含非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基228、234、235、 236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、 266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、 329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440 和 443，它 們是按照Kabat沉述的EU索引編號的。任選地，F(xiàn)c區(qū)可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它和 /或另選的位置上包含非天然氨基酸殘基(參見例如，美國專利US5624821、US6277375、 US6737056 ;PCT 專利公開 WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752,WO 04/074455,WO 04/099249,WO 04/06335UW0 05/070963,WO 05/040217,WO 05/092925 和 WO 06/020114)。我們用“非天然氨基酸殘基”表示在天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中引述位置上不存在的氨 基酸殘基。通常，這就意味著該或某天然/自然的氨基酸殘基被一個或多個其它殘基取代 了，這可能包含其它20個天然產(chǎn)生的(普通)氨基酸或非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸同系 物。非經(jīng)典氨基酸一般包括但不限于普通氨基酸的D-異構(gòu)體、α _氨基異丁酸、4-氨基丁 酸、Abu、2-氨基丁酸、y-Abu, ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨 酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基 丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代_氨基酸、設(shè)計氨基酸如β-甲基氨 基酸、C α -甲基氨基酸、N α -甲基氨基酸和氨基酸類似物。 在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員或包含這種有Fc 變體區(qū)的結(jié)合成員的制劑，其中該Fc區(qū)包含至少一個選自下組的非天然的氨基酸殘基 234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、 235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、 239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R 243W、243L 243Y、 243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、 262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、 265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、 267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、 296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、 299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、 328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、 330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、 331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、 332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y 和 434W,它們 是按照Kabat陳述的EU索引編號的。任選地，F(xiàn)c區(qū)可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它 和/或替換的非天然氨基酸殘基(參見例如，美國專利5624821、6277375、6737056 ；PCT 專利公開 WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752 和 WO 05/040217)。應(yīng)理解，本文所用的Fc區(qū)包括含有除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之外的抗體 恒定區(qū)的多肽。因此，F(xiàn)c指IgA、IgD和IgG的后兩個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，IgE和IgM 的后三個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及這些結(jié)構(gòu)域的N末端柔性絞鏈區(qū)。對IgA和IgM，F(xiàn)c 可包括J鏈。就IgG而言，F(xiàn)c包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域C γ 2和C γ 3以及C γ 1和C γ 2之間的 絞 鏈區(qū)。雖然Fc區(qū)的邊界可變，但人IgG重鏈Fc區(qū)通常被定義為羧基末端包括殘基C226或 P230，其中編號是按照Kabat等所述的EU索引進(jìn)行的。(1991，NIH出版物91-3242，弗吉尼 亞州斯普林菲爾德的國家技術(shù)信息服務(wù)中心(Naional TechnicalInformation Service, Springfield, VA)) ο “Kabat所述的EU索引”指Kabat等(同上)所述的人IgGlEU抗體的 殘基編號。Fc可單獨指該區(qū)域，或抗體、抗體片段或Fc融合蛋白中的這個區(qū)域。變體Fc蛋 白可以是抗體、Fc融合物或包含F(xiàn)c區(qū)的任 何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括但不限于包含 變體Fc區(qū)即Fc的非天然變體的蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括有Fc變體區(qū)的結(jié)合成員，其相對于可比分子(如除了含有野生型Fc 區(qū)之外其它的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì))對Fc配體(如Fc受體，Clq)的結(jié)合特性發(fā)生 了改變。結(jié)合特性的例子包括但不限于結(jié)合特異性、平衡解離常數(shù)(Kd)、解離和結(jié)合速率 (分別是Kiiw和Kgg)、結(jié)合親和力和/或親合力。通常應(yīng)理解，具有低Kd的結(jié)合分子(例 如變異Fc蛋白，如抗體)可能更優(yōu)于具有高Kd的結(jié)合分子。然而，在一些情況下，Kiiw和K gg值可能比Kd值更相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定對給定抗體應(yīng)用而言哪一個動力學(xué)參數(shù) 最重要?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知用于測定Fc-Fc γ R相互作用，即Fc區(qū)與Fc YR的特異性結(jié)合 的各種體外測定法(生化或免疫測定法)確定Fc區(qū)與其配體的親和力和結(jié)合特性，這些 方法包括但不限于平衡法(如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)；或放射性免疫實驗(RIA))或 動力學(xué)方法(如BIACORE 分析)，以及其它方法，如直接結(jié)合實驗、競爭性抑制實驗、熒 光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、凝膠電泳和色譜法(如凝膠過濾)。這些和其它方法可利用所檢 測的一種或多種組分上的標(biāo)記和/或利用各種檢測方法，包括但不限于顯色、熒光、發(fā)光 或同位素標(biāo)記。有關(guān)結(jié)合親和力和動力學(xué)的詳細(xì)描述可參見Paul，W. E.編，F(xiàn)undamental Immunology (基礎(chǔ)免疫學(xué))，第4版，Lippincott-Raven,費城(1999)，其關(guān)注于抗體-免疫 原相互作用?？赏ㄟ^提高Fc區(qū)與FcRn的結(jié)合親和力來延長含有Fc區(qū)的蛋白質(zhì)的血清半 衰期。在一個實施方式中，與可比分子相比，F(xiàn)c變體蛋白的血清半衰期延長。本文所述術(shù)語“抗體半衰期”指抗體的一個藥代動力學(xué)特性，是給藥后抗體分子平 均殘留時間的衡量。抗體的半衰期可表示為從病人體內(nèi)或其特定部位將已知量的免疫球蛋白清除50%所需時間，例如在血清或血漿中測量，即循環(huán)半衰期，或在其它組織中測量。一 種免疫球蛋白或一類免疫球蛋白的半衰期與另一種不同。通常，增加抗體半衰期引起所給 抗體在循環(huán)中的平均滯留時間(MRT)增加。在某些實施方式中，本發(fā)明組合物和方法的抗IL-4RCI抗體的半衰期為至少約 4-7天。在某些實施方式中，本發(fā)明組合物和方法的抗IL-4Ra抗體的平均半衰期為至少 約 2-5 天、3-6 天、4-7 天、5-8 天、6-9 天、7-10 天、8-11 天、8_12、9_13、10-14、11-15、12-16、 13-17、14-18、15-19或16-20天。在其它實施方式中，本發(fā)明組合物和方法的抗IL-4R α抗 體的平均半衰期為至少約17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26天、23-27 天、24-28天、25-29天或26-30天。在其它實施方式中，本發(fā)明組合物和方法的抗IL_4Ra 抗體的半衰期可以是至多約50天。在某些實施方式中，可通過本領(lǐng)域已知方法延長本發(fā)明 組合物和方法的抗體的半衰期。這種延長可進(jìn)而降低抗體組合物的給予量和/或頻率。體 內(nèi)半衰期改善的抗體及其制備方法參見美國專利號US6277375、US7083784和國際公開號 WO 98/23289 和 WO 97/3461。也可利用或不用多功能接頭，通過PEG與抗體N末端或C末端的位點特異性偶聯(lián) 或通過賴氨酰殘基上的ε_氨基，將惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)連接于抗 體，從而延長抗-IL-4Ra抗體的體內(nèi)血清循環(huán)時間。可利用導(dǎo)致生物活性損失最小的線型 或分支聚合物衍生化。通過SDS-PAGE和質(zhì)譜密切監(jiān)測偶聯(lián)程度，以確保PEG分子適當(dāng)?shù)嘏?聯(lián)于所述抗體?？赏ㄟ^大小排阻或離子交換層析將未反應(yīng)的PEG與抗體-PEG偶聯(lián)物分開。 可利用本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的方法，例如本文所述的免疫實驗檢測PEG-衍生抗體的結(jié)合 活性及體內(nèi)功效。另外，可將本發(fā)明組合物和方法的抗體與白蛋白偶聯(lián)，以制備在體內(nèi)更穩(wěn)定或 體內(nèi)半衰期更長的抗體。本領(lǐng)域熟知這些技術(shù)，參見例如國際公開號W093/15199、WO 93/15200和WO 01/77137 ；以及歐洲專利號EP 413，622，通過引用將所有這些文獻(xiàn)納入本文。在某些實施方式中，本文所述結(jié)合成員或抗體以及本發(fā)明組合物的半衰期為至少 約4-7天。在某些實施方式中，本文所述結(jié)合成員或抗體和本發(fā)明組合物的平均半衰期為 至少約 2-5 天、3-6 天、4-7 天、5-8 天、6-9 天、7-10 天、8-11 天、8_12、9_13、10-14、11-15、 12-16、13-17、14-18、15-19或16-20天。在其它實施方式中，本文所述結(jié)合成員或抗體和本 發(fā)明組合物的平均半衰期為至少約17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26 天、23-27天、24-28天、25-29天或26-30天。在另一些實施方式中，本文所述結(jié)合成員或抗 體以及本發(fā)明組合物的半衰期為至多約50天。在某些實施方式中，可通過本領(lǐng)域已知方法 延長本發(fā)明抗體以及組合物的半衰期。這種延長可進(jìn)而降低抗體組合物的給予量和/或頻 率。體內(nèi)半衰期改善的抗體及其制備方法參見美國專利號US6277375、US7083784和國際公 開號 WO 1998/23289 和 WO 1997/3461。在另一實施方式中，本發(fā)明提供結(jié)合成員，特別是有Fc變體區(qū)的抗體，或包含這 些物質(zhì)的組合物，其中所述Fc區(qū)在選自按照Kabat所述EU索引編號的239、330或332的 一個或多個位置上包含至少一個非天然修飾。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供Fc變 體，其中Fc區(qū)包含至少一個選自239D、330L或332E的非天然氨基酸，它們是按照Kabat陳 述的EU索引編號的。任選地，所述Fc區(qū)在選自按照Kabat所述EU索引編號的252、254或256的一個或多個位置上還可包含其它非天然氨基酸。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提 供Fc變體，其中Fc區(qū)包含至少一個選自239D、330L或332E (按照Kabat陳述的EU索引編 號)的非天然氨基酸，并且在選自252Y、254T或256E (按照Kabat陳述的EU索引編號)的 一個或多個位置上包含至少一個非天然氨基酸。在另一實施方式中，本發(fā)明提供結(jié)合成員，特別是有Fc變體區(qū)的抗體，或包含這 些物質(zhì)的組合物，其中所述Fc區(qū)在選自按照Kabat所述EU索引編號的234、235或331的 一個或多個位置上包含 至少一個非天然氨基酸。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供Fc變 體，其中Fc區(qū)包含至少一個選自234F、235F、235Y或331S的非天然的氨基酸，它們是按照 Kabat陳述的EU索引編號的。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明Fc變體包含234F、235F 和331S氨基酸殘基，它們是按照Kabat陳述的EU索引編號的。在另一個具體實施方式
中， 本發(fā)明Fc變體包含234F、235Y和331S氨基酸殘基，它們是按照Kabat陳述的EU索引編號 的。任選地，所述Fc區(qū)還可在選自按照Kabat所述EU索引編號的252、254或256的一個 或多個位置上包含其它非天然氨基酸殘基。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供Fc變體， 其中Fc區(qū)包含至少一個選自234F、235F、235Y或331S (按照Kabat所述EU索引編號)的 非天然氨基酸，并且在選自252Y、254T或256E (按照Kabat所述EU索引編號)的一個或多 個位置上包含至少一個非天然氨基酸。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供有變體Fc區(qū)的結(jié)合成員，其中該變體在位置 252包含酪氨酸(Y)、在位置254包含蘇氨酸(T)、在位置256包含谷氨酸(E)，按照Kabat 所述的EU索引編號。據(jù)報道，下稱為YTE突變的M252Y、S254T和T256E突變(按照Kabat所述的EU索 引編號)會提高特定IgGl抗體分子的血清半衰期(DalTAcqua等，J.Biol. Chem. 281 (33) 23514-23524，2006)。在又一實施方式中，本發(fā)明提供有變體Fc區(qū)的結(jié)合成員，其中該變體在位置252 包含酪氨酸(Y)、在位置254包含蘇氨酸(T)、在位置256包含谷氨酸(E)、在位置241包含 脯氨酸(P)，按照Kabat所述的EU索引編號。據(jù)報道，下文稱為P突變的絲氨酸228脯氨酸突變(S228P)(按照Kabat所述的 EU索引編號)會提高特定IgG4分子的穩(wěn)定性(Lu等，J PharmaceuticalSciences 97(2) 960-969,2008)。注在Lu等人的文章中，其指位置241，因為他們使用的是Kabat編號體 系，而不是Kabat所述的“EU索引”。該P突變可以與L235E組合，進(jìn)一步敲除ADCC。下文將這種突變組合稱為雙突變 (DM) ο在一具體實施方式
中，本發(fā)明提供有變體Fc區(qū)的結(jié)合成員，其中該變體在位置 234包含苯丙氨酸(F)殘基、在位置235包含苯丙氨酸(F)或谷氨酸(E)殘基、在位置331 包含絲氨酸(S)殘基，按照Kabat所述的EU索引編號。下文將這樣一種突變組合稱為三突 變(TM)。依據(jù)又一實施方式，本發(fā)明提供在Fc區(qū)有YTE突變的IgGl形式的抗體。依據(jù)又一實施方式，本發(fā)明提供在Fc區(qū)有TM突變的IgGl形式的抗體。依據(jù)又一實施方式，本發(fā)明提供在Fc區(qū)有YTE突變及TM突變的IgGl形式的抗體。依據(jù)一實施方式，本發(fā)明提供在Fc區(qū)有YTE突變及P突變的IgG4形式的抗體。
依據(jù)一實施方式，本發(fā)明提供在Fc區(qū)有YTE突變及DM突變的IgG4形式的抗體。依據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，提供選自下組形式的抗體IgGl YTE、IgGlTM, IgGl TM+YTE、IgG4P、IgG4 DM、IgG4 YTE、IgG4P+YTE 和 IgG4DM+YTE。按照所用命名法，應(yīng)當(dāng)明白，DM+YTE意味著恒定區(qū)Fc區(qū)同時擁有雙突變(S228P和 L235E)以及 YTE 突變(M252Y、S254T 和 T256E)。產(chǎn)生非天然產(chǎn)生的Fc區(qū)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可通過誘變法產(chǎn)生氨 基酸取代和/或缺失，誘變法包括但不限于定位誘變(Kunkel，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488-492，1985)、PCR 誘變(Higuchi，刊于〃 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications" ( ((PCR實驗方案方法和應(yīng)用指南》)，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，圣 迭戈，第 177-183 頁(1990))和盒式誘變(Wells 等，Gene 34 :315_323 (1985 年))。優(yōu)選地， 通過重疊延伸PCR方法進(jìn)行定位誘變(Higuchi，刊于〃 PCR Technology principles and Applications for DNAAmplification" (((PCR技術(shù)用于DNA擴增的原理和應(yīng)用》)，紐約 斯托克頓出版社(Stockton Press, New York)，第61-70頁(1989年))。可利用重疊衍生 PCR的技術(shù)(Higuchi，同上)，將任何所需突變引入靶序列(初始DNA)?；蛘撸丿B延伸法中 的第一輪PCR包括用外部引物(引物1)和內(nèi)部誘變引物(引物3)擴增靶序列，分別用第二 種外部引物(引物4)和內(nèi)部引物(引物2)擴增，產(chǎn)生兩種PCR節(jié)段(節(jié)段A和B)。設(shè)計 內(nèi)部誘變引物(引物3)，以使靶序列含有指向所需突變的錯配。在第二輪PCR中，用兩種外 部引物(引物1和4)借助PCR擴增第一輪PCR的產(chǎn)物(節(jié)段A和B)。用限制性酶消化得到 的全長PCR節(jié)段(節(jié)段C)，將得到的限制性片段克隆入合適載體中。誘變的第一個步驟是， 將初始DNA(如編碼Fc融合蛋白、抗體或Fc區(qū)的DNA)操作性克隆到誘變載體中。設(shè)計引 物，以反應(yīng)所需的氨基酸取代。本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生變異Fc區(qū)的其它方法(參見例如，美國 專利 5624821、5885573、5677425、6165745、6277375、5869046、6121022、5624821、5648260、 6528624、6194551、6737056、6821505、6277375、美國專利公開號 2004/0002587 和 PCT 公開 WO 94/29351、WO 99/58572、W000/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351、W006/23403)。在本發(fā)明的一些實施方式中，修飾本文提供的結(jié)合成員的糖基化模式以增強ADCC 和 CDC 效應(yīng)功能。(參見 Shields RL 等，JBC，277 :26733_26740，2002 ;Shinkawa T 等， JBC. 278 :3466-3473，2003 ；以及 Okazaki A 等，J. Mol. Biol.，336 1239，2004)。在一些實 施方式中，F(xiàn)c變體蛋白包含一種或多種工程改造的糖形式(glycoform)，即共價連接于含 有Fc區(qū)的分子的碳水化合物組分。工程改造的糖形式可用于各種目的，包括但不限于提高 或降低效應(yīng)功能。工程改造的糖形式可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，例如，采 用工程改造或變異的表達(dá)株，與一種或多種酶如DI N-胰腺葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIll) 共同表達(dá)，在各種生物體或來自各種生物體的細(xì)胞系中表達(dá)含有Fc區(qū)的分子，或者在含有 Fc區(qū)的分子表達(dá)后修飾碳水化合物。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生工程改造的糖形式的方法，包括但 不限于 Umana 等，Nat. Biotechnol 17 176-180，1999 年；Davies 等，Biotechnol Bioeng 74 288-294,2007 年；Shields 等，J Biol Chem277 :26733_26740，2002 年；Shinkawa 等，J Biol Chem 278 :3466_3473，2003年；美國專利6602684 ；美國專利申請序列號 10/277370 ；美國專利申請序列號 10/113929 ;PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/292246A1 ； PCT W002/311140A1 ；PCT WO 02/30954A1 所述的方法；Potillegent 技術(shù)(新澤西州普林斯頓的波娃公司(Biowa，Inc. Princeton, N.J.)) ；GlycoMAb 糖基化工程技術(shù)(瑞士蘇黎 世的 GLYCART 生物技術(shù)公司(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland))。參見 例如 TO 00/061739、EA01229125、US 20030115614、Okazaki 等的 JMB，336 1239-49，2004。可用可檢測或功能標(biāo)記物標(biāo)記本發(fā)明的結(jié)合成員。標(biāo)記物可以是能產(chǎn)生或經(jīng)誘導(dǎo) 產(chǎn)生信號的任何分子，包括但不限于熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此， 可以通過檢測熒光或發(fā)光、放射性、酶活性或吸光度來檢測和/或測量結(jié)合情況。合適的標(biāo)記物包括(示例性而非限制性)酶，例如堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶(“G6PDH”)和辣根過氧化物酶；染料；熒光劑，例如熒光素、羅丹明化合物、藻紅蛋白、 藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛、熒光胺、熒光團(tuán)，例如穴合鑭系化合物和螯合劑(帕金 埃爾默公司和CIS生物國際公司(PerkinElmer and Cis Biointernational))；化學(xué)發(fā)光 齊IJ，例如異氨基苯二酰胼 ；致敏劑；輔酶；酶底物；放射性標(biāo)記，包括但不限于125i、131I、35S、 32P、14C、3H、57Co、99TC和75Se,和本文所述的其它放射性標(biāo)記；顆粒，例如乳膠或碳顆粒；金屬 溶膠；微晶；脂質(zhì)體；細(xì)胞，等等，還可用染料、催化劑或其它可檢測基團(tuán)進(jìn)一步標(biāo)記。合適 的酶和輔酶公開于美國專利4275149和美國專利4318980，其各自以引用的方式全文納入 本文。合適的熒光劑和化學(xué)發(fā)光劑公開于以引用的方式全文納入本文的美國專利4275149。 標(biāo)記物還包括化學(xué)部分，例如可通過與特定的相關(guān)可檢測部分，如標(biāo)記的親和素或鏈霉親 和素結(jié)合來檢測的生物素。可檢測標(biāo)記物可以采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)方法連接于本發(fā) 明抗體。可以通過許多方法使標(biāo)記物產(chǎn)生可通過外部方法檢測的信號，例如通過目測、電 磁輻射、加熱和化學(xué)試劑。所述標(biāo)記物還可與結(jié)合本發(fā)明抗體的另一結(jié)合成員結(jié)合，或與支 持物結(jié)合。標(biāo)記物可直接產(chǎn)生信號，因此，無需其它組分來產(chǎn)生信號。許多有機分子，例如熒 光劑能吸收紫外線和可見光，吸收的光將能量轉(zhuǎn)移給這些分子并將它們提高到激發(fā)能級。 然后該吸收的能量通過發(fā)射第二波長的光而消散。該第二波長的射線也能將能量轉(zhuǎn)移給 標(biāo)記的接受分子，得到的能量通過發(fā)射光，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而從接受分子消 散。直接產(chǎn)生信號的其它標(biāo)記物包括放射性同位素和染料。或者，標(biāo)記物可能需要其它組分來產(chǎn)生信號，那么信號產(chǎn)生系統(tǒng)將包括產(chǎn)生可檢 測信號所需的所有組分，包括底物、輔酶、增強劑、其它酶、與酶產(chǎn)物反應(yīng)的物質(zhì)、催化劑、激 活劑、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離子和結(jié)合信號產(chǎn)生物質(zhì)所需的特定結(jié)合物質(zhì)。合適的 信號產(chǎn)生系統(tǒng)的詳述見以引用方式全文納入本文的美國專利5185243。存在的結(jié)合成員、抗體或其功能片段之一可以是免疫偶聯(lián)物的形式，從而能獲得 可檢測和/或可定量的信號。免疫偶聯(lián)物可以與酶偶聯(lián)，例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、 α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸 脫氫酶或葡萄糖6-磷酸脫氫酶，或通過例如生物素、洋地黃毒苷或5-溴脫氧尿苷等分子偶 聯(lián)。熒光標(biāo)記物可同樣與本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物或它們的功能片段偶聯(lián)，尤其包括熒光素及 其衍生物、熒光染料、羅丹明及其衍生物、GFP(GFP即“綠色熒光蛋白”)、丹酰、傘形酮、鑭系 金屬鰲合物或穴合物，例如銪等。免疫偶聯(lián)物或它們的功能片段可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。它們可以 直接或通過間隔基團(tuán)或連接基團(tuán)，例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)的中介作用，或在偶聯(lián)劑，例如以上治療性偶聯(lián)物所述那些偶聯(lián)劑存在下偶聯(lián) 于酶或熒光標(biāo)記物。含有熒光素型標(biāo)記物的偶聯(lián)物可以通過與異硫氰酸酯反應(yīng)來制備。同 樣地，其它免疫偶聯(lián)物可包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物如魯米諾和二氧雜環(huán)丁烷，生物發(fā)光標(biāo)記物 如螢光素酶和螢光素，或其它放射性標(biāo)記物如碘123、碘125、碘126、碘131、碘133、溴77、 锝99m、銦111、銦113m、鎵67、鎵68、硫35、磷32、碳14、氚(氫3)、鈷57、硒75、釕95、釕 97、釕 103、釕 105、汞 107、汞 203、錸 99m、錸 101、錸 105、鈧 47、碲 121m、碲 122m、碲 125m、銩 165、銩167、銩168、氟8、釔199。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知將治療性放射性同位素直接或通過 螯合劑，例如 上述EDTA、DATA偶聯(lián)于抗體的現(xiàn)有方法可利用診斷所用的放射性元素。還可 能通過氯胺 T 方法(Hunter 和 Greenwood, Nature, 194 :495，1962 年)用 Na[I 125]標(biāo)記， 或通過Crockford等的技術(shù)(以引用方式全文納入本文的美國專利號4424200)用锝99m 標(biāo)記或通過Hnatowich (以引用方式全文納入本文的美國專利號4479930)所述經(jīng)DPTA相 連。其它免疫偶聯(lián)物可包含毒素部分，例如選自下組的毒素部分假單胞菌外毒素(PE或其 細(xì)胞毒素片段或突變體)、白喉毒素或其細(xì)胞毒素片段或突變體、肉毒桿菌毒素A-F、蓖麻 毒蛋白或其細(xì)胞毒素片段或突變體、相思豆毒素或其細(xì)胞毒素片段、皂草毒蛋白或其細(xì)胞 毒素片段、商陸抗病毒毒素或其細(xì)胞毒素片段和異株瀉根毒蛋白1或其細(xì)胞毒素片段。本發(fā)明提供的方法包括使得本文提供的結(jié)合成員與IL-4RCI結(jié)合。應(yīng)注意，這種 結(jié)合可在體內(nèi)發(fā)生，例如在給予結(jié)合成員或編碼結(jié)合成員的核酸后，或者可在體外發(fā)生，例 如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、親和層析和生物化學(xué)或細(xì)胞試驗，例如 本文所述的。本發(fā)明還能利用本發(fā)明結(jié)合成員，例如在生物傳感器系統(tǒng)中直接檢測抗原水 平。例如，本發(fā)明包括檢測和/或測量與IL-4RCI的結(jié)合情況的方法，包括⑴使所述 結(jié)合成員與IL-4Ra接觸和(ii)檢測所述結(jié)合成員與IL-4Ra的結(jié)合情況，其中采用本文 所述任何方法或可檢測標(biāo)記物檢測結(jié)合情況。該方法和本文所述的任何其它結(jié)合檢測方法 可直接由實施該方法的人員解讀，例如目測觀察可檢測標(biāo)記物?；蛘撸摲椒ɑ虮疚乃龅?任何其它結(jié)合檢測方法可產(chǎn)生放射自顯影照片、照片、計算機打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報道、 圖片、圖表、含有結(jié)果的試管或容器或孔、或該方法結(jié)果的任何其它可見或物理表現(xiàn)形式的 報道?？梢詼y定結(jié)合成員與IL-4RCI的結(jié)合量。定量測定可與測試樣品中診斷感興趣的 抗原量有關(guān)。篩選IL-4RCI結(jié)合情況和/或其定量測定可用于，例如篩選IL-4Rα相關(guān)疾 病或病癥的患者，例如本文它處所述。在一個實施方式中，本發(fā)明診斷方法包括(i)獲得對 象的組織或液體樣品；(ii)使所述組織或液體樣品與一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員接觸；和 (iii)與對照樣品相比，檢測結(jié)合的IL-4Ra等步驟，其中與對照相比，IL-4Ra結(jié)合量增加 可表明IL-4RCI表達(dá)或活性水平異常。待測試的組織或液體樣品包括懷疑含有IL-4Rα水 平異常的血液、血清、尿、生物活檢材料、腫瘤或任何組織。經(jīng)測試IL-4RCI水平或活性異常 的陽性對象還可受益于本文隨后公開的治療方法。借鑒本文公開的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)他們的偏好和普通知識選擇測定結(jié) 合成員與抗原結(jié)合的合適方式?？赏ㄟ^任何合適的方式測定樣品中結(jié)合成員的反應(yīng)性。放射免疫測定(RIA)是可 能的一種。放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(測試樣品)混合，使之與結(jié)合成員結(jié)合。將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原物理分離，測定與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原量。測試樣品中 的抗原越多，與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原越少。還可采用含非放射性抗原的競爭性結(jié)合 試驗，利用與報道分子相連的抗原或類似物。報道分子可以是具有光譜學(xué)上分開的吸收或 發(fā)射特征的熒光染料、磷或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、德克 薩斯紅和鑭系螯合劑或穴合物。合適的生色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其它報道分子包括大分子膠態(tài)顆?；蝾w粒材料，例如有色的、磁性或順磁性的乳 膠珠和能直接或間接產(chǎn)生可通過目測觀察、電子檢測或其它方式記錄的可檢測信號的生物 學(xué)或化學(xué)活性劑。例如，這些分子可以是酶，其催化反應(yīng)以產(chǎn)生或改變顏色或?qū)е码娮犹匦?改變。它們可以是可激發(fā)的分子，因而能級之間的電子轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致特征性吸收光譜或發(fā)射 光譜。它們可包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實體?？梢圆捎蒙锼?親和素或生物素/鏈 霉親和素和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。 可利用各結(jié)合成員_報道分子偶聯(lián)物產(chǎn)生的信號獲得樣品(普通和測試)中與結(jié) 合成員結(jié)合情況有關(guān)的可定量絕對或相對數(shù)據(jù)。本發(fā)明一方面還提供包含本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓绞降慕Y(jié)合成員的試劑盒。在試 劑盒中，可標(biāo)記結(jié)合成員，從而能測定其在樣品中的反應(yīng)性，例如下文所述。結(jié)合成員還可 與或不與固體支持物相連。試劑盒的諸組分通常是無菌的，放置在密封小瓶或其它容器中。 試劑盒可用于利用結(jié)合成員的診斷分析或其它方法。試劑盒可裝有在某方法，例如本發(fā)明 方法中使用這些組分的使用說明書。本發(fā)明試劑盒中可裝有輔助物質(zhì)從而能協(xié)助或?qū)嵤┻@ 種方法。輔助物質(zhì)包括第二種不同的結(jié)合成員，其能結(jié)合第一結(jié)合成員并偶聯(lián)于可檢測標(biāo) 記物(例如，熒光標(biāo)記物、放射性同位素或酶)?？贵w試劑盒還可裝有用于實施免疫沉淀的 珠。試劑盒的各組分通常裝在自身的合適容器中。因此，這些試劑盒通常包含適合于各結(jié) 合成員的不同容器。此外，這些試劑盒可裝有實施試驗及解讀和分析實施試驗所得數(shù)據(jù)的 方法的使用說明書。本發(fā)明還提供以上結(jié)合成員在競爭試驗中檢測抗原水平的應(yīng)用，即在競爭試驗中 利用本發(fā)明提供的結(jié)合成員檢測樣品中抗原水平的方法。這可能無需物理分離結(jié)合的與未 結(jié)合的抗原。將報道分子連接于結(jié)合成員，從而結(jié)合時可能發(fā)生物理或光學(xué)改變。報道分 子可以直接或間接產(chǎn)生可定量的可檢測信號?？梢灾苯踊蜷g接，共價，例如通過肽鍵或非共 價連接報道分子。經(jīng)由肽鍵連接可能是重組表達(dá)編碼抗體或報道分子的基因融合所致。例如，本發(fā)明包括鑒定IL-4Rci結(jié)合化合物的方法，包括(i)將IL_4Ra固定于支 持物，( )使所述固定的IL-4Ra同時或分步接觸至少一種標(biāo)記的本發(fā)明結(jié)合成員和一種 或多種未標(biāo)記的測試結(jié)合化合物，和(iii)通過觀察標(biāo)記的結(jié)合成員的結(jié)合標(biāo)簽量的降低 來鑒定新IL-4Rci結(jié)合化合物。鑒定IL-4RCI結(jié)合化合物的另一種方法可包括(i)將結(jié)合成員固定于支持物， ( )使所述固定的結(jié)合成員同時或分步接觸標(biāo)記的IL-4RCI和一種或多種未標(biāo)記的測試 結(jié)合成員或結(jié)合化合物，和(iii)通過觀察標(biāo)記的IL-4Ra的結(jié)合標(biāo)簽量降低來鑒定新 IL-4Ra結(jié)合化合物?？刹捎枚嗫谆蜿嚵行问?，以高通量方式實施這些方法。還可在溶液中進(jìn)行這 些試驗，例如實施例4. 3描述的HTRF 試驗。例如，參見以引用方式全文納入本文的 US5814468。如上所述，結(jié)合的檢測可以直接由實施該方法的人員解讀，例如通過目測觀察可檢測標(biāo)記物，或其存在量降低?；蛘?，本發(fā)明的結(jié)合成員可產(chǎn)生放射自顯影照片、照片、計 算機打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報道、圖片、圖表、含有結(jié)果的試管或容器或孔、或該方法結(jié)果的 任何其它可見或物理表現(xiàn)形式的報道。競爭試驗還可用于表位作圖。在一個例子中，表位作圖可用于鑒定IL-4Rci結(jié)合 成員所結(jié)合的表位，所述結(jié)合成員可任選具有優(yōu)化的中和和/或調(diào)節(jié)特征。這種表位可以 是線形表位或構(gòu)象表位。構(gòu)象表 位可包含至少兩個不同的IL-4Rci片段，其中當(dāng)IL-4Rci 折疊成其三級或四級結(jié)構(gòu)以形成IL-4Rα抑制劑，例如IL-4Ra結(jié)合成員識別的構(gòu)象表位 時所述片段的位置彼此毗鄰。在測試競爭時，可利用抗原的肽片段，特別是包含感興趣表位 或基本上由其構(gòu)成的肽。可利用具有表位序列并在各端加有一個或多個氨基酸的肽。本發(fā) 明結(jié)合成員可以如下所示，即它們與抗原的結(jié)合被具有或包含所給定序列的肽抑制。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明結(jié)合成員的分離核酸。核酸可包含DNA和/或RNA。在一 方面，本發(fā)明提供編碼上述本發(fā)明的CDR或CDR組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原_結(jié) 合位點或抗體分子，例如scFv或IgGjn IgGl、IgG2或IgG4的核酸。本發(fā)明還提供質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建物，其包含至少一種上述多核 苷酸。本發(fā)明還提供包含以上一種或多種構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞。編碼提供的任何⑶R 或CDR組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原-結(jié)合位點或抗體分子，例如scFv或IgGl、 IgG2或IgG4的核酸本身構(gòu)成本發(fā)明的一個方面，這與產(chǎn)生所編碼產(chǎn)物的方法一樣，該方法 包括表達(dá)其編碼核酸。在合適的條件下培養(yǎng)含有該核酸的重組宿主細(xì)胞不難實現(xiàn)表達(dá)。通 過表達(dá)產(chǎn)生后，可采用任何合適的技術(shù)分離和/或純化VH或VL結(jié)構(gòu)域或結(jié)合成員，然后適 當(dāng)使用。本發(fā)明核酸可包含DNA或RNA，其可以是完全或部分合成的。除非另有表述，述及 本文所示核苷酸序列包括具有所示序列的DNA分子，還包括具有所示序列的RNA分子，其中 U取代T。還有另一方面提供產(chǎn)生抗體VH可變區(qū)的方法，該方法包括表達(dá)編碼核酸。該方法 可包括在產(chǎn)生所述抗體VH可變區(qū)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。產(chǎn)生VL結(jié)構(gòu)域和包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的類似方法是本發(fā)明的其 它方面。制備方法可包括分離和/或純化產(chǎn)物的步驟。制備方法可包括將產(chǎn)物配制成含有 至少一種其它組分，例如藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。熟知在各種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì) 菌、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母菌和桿狀病毒系統(tǒng)及轉(zhuǎn)基因植物和動物。本領(lǐng) 域熟知在原核細(xì)胞中表達(dá)抗體和抗體片段。綜述可參見PlUckthim 1991。常用的細(xì)菌宿主 是大腸桿菌。作為制備結(jié)合成員的另一選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員還能在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中表 達(dá)，例如 Chadd 禾口 Chamow，Current Opinion in Biotechnology 12 188—194，2001)， Andersen 禾口 Krummen(Current Opinion in Biotechnology 13:117,2002), Larrick 禾口 Thomas (Current Opinion in Biotechnology 12 :411_418，2001)。本領(lǐng)域可用于表達(dá)異源 多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑色素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞和許多其它細(xì)胞?？梢赃x擇或構(gòu)建含有合適的調(diào)節(jié)序列的合適載體，包括啟動子序列、終止子序 列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)記基因和其它序列(如果需要的話)。載體可以是質(zhì) 粒，例如噬菌粒，或病毒，例如噬菌體(如果需要的話)。其它細(xì)節(jié)可參見例如Sambrook 和 Russell (Molecular Cloning :a Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 3 版，2001年，冷泉港實驗室出版社)。Ausubel等編著的Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology (分 子生物學(xué)簡便方法最新分子生物學(xué)方法概要)(約翰威利父子公司，第4版，1999)詳細(xì)描 述了操作核酸的許多已知技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建物、誘變、測序、將DNA引入細(xì)胞 和基因表達(dá)以及分析蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面提供含有本文公開的核酸的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可以在體 外并可處于培養(yǎng)物中。這種宿主細(xì)胞可以在體內(nèi)。宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可以將本發(fā)明結(jié)合 成員表達(dá)成“胞內(nèi)抗體”或細(xì)胞內(nèi)的抗體。胞內(nèi)抗體可用于基因療法。還有另一方面提供了包括將本發(fā)明核酸引入宿主細(xì)胞的方法?？刹捎萌魏魏线m的 技術(shù)實施這種引 入。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如痘苗病毒，或者就昆蟲細(xì)胞 而言是桿狀病毒。將核酸引入宿主細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞可利用病毒或質(zhì)粒系統(tǒng)。質(zhì)粒系 統(tǒng)可以維持于附加體或可摻入宿主細(xì)胞或摻入人工染色體。摻入可以是將一份或多份拷貝 隨機或靶向整合在單一或多個基因座處。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電 穿孔和利用細(xì)菌噬菌體轉(zhuǎn)染。引入后可表達(dá)核酸，例如通過在表達(dá)基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。可通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的方法純化表達(dá)的產(chǎn)物。在一個實施方式中，本發(fā)明核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組(例如，染色體)。按照 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，納入促進(jìn)與基因組重組的序列可促進(jìn)整合。本發(fā)明還提供包括在表達(dá)系統(tǒng)中利用上述構(gòu)建物以表達(dá)上述結(jié)合成員或多肽的 方法。本發(fā)明結(jié)合成員可用于診斷或治療人或動物對象，例如人的方法中。例如，結(jié)合成 員可用于診斷或治療IL-4Rci相關(guān)疾病或病癥，其例子如本文它處所述?？衫帽景l(fā)明結(jié)合成員治療或診斷的具體病癥包括哮喘、C0PD(包括慢性支氣 管炎、小氣道疾病、和肺氣腫)、炎性腸病、纖維化病癥(包括全身性硬皮病、肺纖維化、寄生 蟲誘發(fā)的肝纖維化、囊性纖維變性)、變態(tài)反應(yīng)(包括例如特應(yīng)性皮炎和食物變態(tài)反應(yīng))、防 止抑制排異的抑制療法、以及遏制延遲型過敏性或接觸過敏性反應(yīng)、作為變態(tài)反應(yīng)的佐劑 以及作為疫苗佐劑。因此，本發(fā)明結(jié)合成員可用作治療涉及IL-4、IL-13或IL-4RCI表達(dá)和/或活性 的病癥的治療劑。其中的一種實施方式是一種治療方法，包括將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員 給予有此需要的患者，其中IL-4Ra活化的功能結(jié)果(functionalconsequences)降低。其 中的另一種實施方式是一種治療方法，包括(i)鑒定顯露IL-4、IL-13和IL-4Rci表達(dá)或 活性的患者，例如采用上述診斷方法，和(ii)將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予該患者，其 中IL-4Ra活化的功能結(jié)果減弱。本發(fā)明的有效量是能調(diào)節(jié)IL-4Ra活化的功能結(jié)果的用量，從而能調(diào)節(jié)(例如減 少或減輕)所治療疾病或病癥的至少一種癥狀的嚴(yán)重性，但不一定 治愈該疾病或病癥。因此，本發(fā)明的一個實施方式是治療或減輕本文所述任何疾病的至少 一種癥狀的嚴(yán)重程度的方法，包括將有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員單獨或以組合治 療方案與本領(lǐng)域已知或本文所述的另一種合適藥物聯(lián)合給予有此需要的患者，從而能降低 所述疾病的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度。其中本發(fā)明的另一種實施方式是拮抗IL-4Ra的 至少一種效應(yīng)的方法，包括接觸或給予有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員，從而能拮抗 IL-4Ra的所述至少一種效應(yīng)，例如IL-4Rci與IL-4形成復(fù)合物(有效信號傳導(dǎo)的前體) 的能力。因此，本發(fā)明的其它方面提供治療方法，包括給予所提供的結(jié)合成員、或包含這種 結(jié)合成員的藥物組合物，和/或這種結(jié)合成員在制備給予的藥物中的應(yīng)用，例如制備藥物 或藥物組合物的方法，包括用藥學(xué)上可接受的賦形劑配制結(jié)合成員。藥學(xué)上可接受的賦形 劑可以是化合物或化合物的組合，其可納入藥物組合物但不會造成繼發(fā)性反應(yīng)并能，例如 促進(jìn)活性化合物的給予，增加其體內(nèi)壽命和/或其效力，增加其在溶液中的溶解度或者延 長其儲存時間。這些藥學(xué)上可接受的載體是熟知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可改進(jìn)這些載體以適 應(yīng)所選擇活性化合物的性質(zhì)和給藥方式。本發(fā)明結(jié)合成員通常以藥物組合物的形式給予，所述組合物可包含除結(jié)合成員外 的至少一種成分。因此，為用于本發(fā)明，除活性成分外，本發(fā)明的藥物組合物可包含藥學(xué)上 可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)無 毒，不應(yīng)干擾活性成分的效力。載體或其它物質(zhì)的精確性質(zhì)取決于給藥途徑，其可以是口 月艮、吸入或經(jīng)注射，例如靜脈內(nèi)給藥。在一個實施方式中，該組合物是無菌的。本發(fā)明還考慮了 口服給予的藥物組合物，例如納米體(nanobody)等。這種口服制 劑可以是片劑、膠囊、粉末、液體或半固體形式。片劑可以包含固體載體，例如明膠或佐劑。 液體藥物組合物通常包含液體載體，例如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成的油。可以 包括生理鹽溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘油，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對于靜脈內(nèi)注射，或在病患部位注射，活性成分可以是胃腸外可接受的水溶液形 式，其不含熱原，PH、等滲性和穩(wěn)定性合適。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員能利用，例如等滲載體， 例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制備合適的溶液。如果需要，可利用防腐 齊IJ、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其它添加劑，包括緩沖液，例如磷酸、檸檬酸、組氨酸和 其它有機酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化 銨；氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨，氯化芐乙氧銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷酯， 例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3’ -戊醇；和間-甲酚)；低分 子量多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯 烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其 它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海 藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白絡(luò)合物)；和/或非離 子表面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。根據(jù)分子的理化特性和遞送途徑，可將本發(fā)明結(jié)合成員配制成液體、半固體或固 體形式。制劑可包含，例如以下賦形劑或賦形劑的組合糖、氨基酸和表面活性劑。液體制 劑包含的抗體濃度和PH范圍很廣。可通過，例如冷凍干燥、噴霧干燥或超臨界液體技術(shù)干燥來制備固體制劑。抗-IL-4Ra的制劑取決于所需遞送途徑例如，肺部遞送的制劑可由 顆粒構(gòu)成，其物理特性確保在吸入后能透入肺深部；局部制劑可包含能延長藥 物在作用部 位停留時間的粘性改性劑。在某些實施方式中，可用能防止結(jié)合成員快速釋放的載體制備 結(jié)合成員，例如控釋制劑，包括植入體、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)。可利用生物可降解的、 生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知制備這些制劑的許多方法。參見，例如Robinson，1978?？煽诜?例如，納米體)、通過注射(例如，皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)或 肌肉內(nèi))、通過吸入、通過囊泡內(nèi)途徑(滴注入膀胱)或通過局部(例如，眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、 給予入傷口或給予皮膚上)給予利用本發(fā)明結(jié)合成員的抗-IL-4RCI治療?？赏ㄟ^脈沖輸 注，特別是以劑量漸降的結(jié)合成員來給予治療?？梢酝ㄟ^治療的理化特征、通過疾病的具體 考慮因素或優(yōu)化效力或盡可能降低副作用的要求來決定給藥途徑。一種具體的給藥途徑是 靜脈內(nèi)。給予本發(fā)明藥物組合物的另一種途徑是皮下。可以設(shè)想，抗-IL-4RCI治療將不局 限于在醫(yī)院或診所中使用，而可以包括家庭和工作場所。因此，優(yōu)選利用無針頭裝置的皮下 注射。依據(jù)待治療的疾病，組合物可以單獨或與其它治療組合，同時或依次或作為含另 一種治療劑或多種藥劑的組合制品給予。IL-4RQ的結(jié)合成員可用作與其它藥物組分聯(lián)用的組合治療的一部分?？刹捎媒M 合治療提供明顯的協(xié)同作用，特別是抗-IL-4Ra結(jié)合成員與一種或多種其它藥物的組合。 就治療本文所述的一種或多種疾病而言，IL-4Ra的結(jié)合成員可同時或依次或作為含另一 種或多種治療劑的組合制品而給予。可以組合或加入了一種或多種以下藥劑的形式提供本發(fā)明結(jié)合成員-細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子功能的激動劑或拮抗劑(例如，作用于細(xì)胞因子信號傳 導(dǎo)途徑的藥劑，例如SOCS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑)，例如α-、β-和/或Y-干擾素；I型胰島素樣 生長因子(IGF-I)、其受體和相關(guān)結(jié)合蛋白；白介素(IL)，例如IL-1-33中的一種或多種，和 /或白介素拮抗劑或抑制劑，例如阿那白滯素；白介素家族成員的受體的抑制劑或這些受 體的特定亞單位的抑制劑；腫瘤壞死因子α (TNF-α)抑制劑，例如抗-TNF單克隆抗體(例 如，英夫利昔單抗；阿達(dá)木單抗和/或CDP-870)、和/或TNF受體拮抗劑，例如免疫球蛋白 分子(例如依那西普)和/或低分子量藥劑，例如已酮可可堿(pentoxyfylline)；-B細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，例如靶向B-淋巴細(xì)胞(例如⑶20 (利妥昔單抗)或MRA_aIL16R) 或T-淋巴細(xì)胞(例如CTLA4-Ig、或阿巴西普(Abatac^pt))的單克隆抗體；-抑制破骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)劑，例如RANKL的抗體；_趨化因子或趨化因子受體功能的調(diào)節(jié)劑，例如以下趨化因子的拮抗劑CCR1、 CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO 或 CCRll (就 C-C 家族 而言)；CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4 和 CXCR5 或 CXCR6 (就 C-X-C 家族而言)和 CX3CR1 (就 C-X3-C家族而言)；-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，即以下一種或多種的抑制劑間質(zhì)溶解素、膠原 酶和明膠酶以及聚集蛋白聚糖酶；特別是膠原酶-I(MMP-I)、膠原酶-2(MMP_8)、膠 原酶-3 (MMP-13)、間質(zhì)溶解素-1 (MMP-3)、間質(zhì)溶解素_2 (MMP-10)和/或間質(zhì)溶解 素-3 (MMP-Il)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如強力霉素等藥劑；
-白三烯生物合成抑制劑、5-脂肪氧合酶(5-L0)抑制劑或5_脂肪氧合酶 活化蛋白(FLAP)拮抗劑，例如齊留通；ABT-761 ；芬留頓；替泊沙林；Abbott-79175 ； Abbott-85761 ；N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺酰胺；2，6-二叔丁基苯酚腙；甲氧基四 氫吡喃，例如澤尼卡ZD-2138 ；化合物SB-210661 ；吡啶基-取代的2-氰基萘化合物，例如 L-739, 010 ；2-氰基喹啉化合物，例如L-746，530 ；吲哚和/或喹啉化合物，例如MK-591、 MK-886 和 / 或 BAY χ 1005 ； -白三烯(LT)Β4、LTC4、LTD4和LTE4的受體拮抗劑，選自吩噻嗪-3-ls，例如 L-651, 392 ；脒基化合物，例如CGS-25019c ；氨基苯并惡唑類(benzoxalamines)，例如昂 唑司特；芐脒類(benzenecarboximidamides)，例如BIIL 284/260 ；和諸如扎魯司特、阿 魯司特、孟魯司特、普侖司特、維魯司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP 45715A)和 BAY χ 7195 等化合物；-磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，例如甲基黃嘌呤(methylxanthanine)，如茶堿和/或 氨茶堿；和/或選擇性PDE同工酶抑制劑，例如PDE4抑制劑和/或同種型PDE4D的抑制劑， 和/或PDE5抑制劑；-1型組胺受體拮抗劑，例如西替立嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯 汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴司汀、氯苯那敏、普魯本近、賽克利嗪和/或咪唑 斯汀(通常口服、局部或胃腸外應(yīng)用)；-質(zhì)子泵抑制劑(例如奧美拉唑)或胃保護(hù)性組胺2型受體拮抗劑；-組胺4型受體拮抗劑；-α-1/α-2腎上腺素受體激動劑、血管收縮劑、擬交感神經(jīng)藥，例如環(huán)己丙甲胺、 苯福林、苯丙醇胺、麻黃素、偽麻黃堿、鹽酸萘甲唑啉、鹽酸氧甲唑啉、鹽酸四氫唑啉、鹽酸木 甲唑啉、鹽酸曲馬唑啉和鹽酸乙基去甲腎上腺素；-抗膽堿能藥，例如毒蕈堿受體(Ml、M2、M3、M4和M5)拮抗劑，例如阿托品、東莨 菪堿、甘羅溴銨(glycopyrrrolate)、異丙托溴銨、噻托溴銨、氧托溴銨、哌侖西平和替侖西 平；腎上腺素受體激動劑(包括β受體亞型1-4)，例如異丙腎上腺素、柳丁氨 醇、福莫特羅、沙美特羅、叔丁喘寧、間羥異丙腎上腺素、雙甲苯喘定甲磺酸鹽和/或吡布特 羅，例如它們的手性對映體；-色酮，例如色甘酸鈉和/或奈多羅米鈉；_糖皮質(zhì)激素，例如氟尼縮松、曲安西龍縮丙酮、二丙酸氯地米松、布地奈德、丙酸 氟替卡松、環(huán)索奈德和/或糠酸莫米松；-調(diào)節(jié)核激素受體的藥劑，例如PPAR；-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或調(diào)節(jié)Ig功能的拮抗劑或抗體，例如抗-IgE(例如， 奧瑪立珠單抗(奧馬珠單抗))；-其它全身性或局部應(yīng)用的抗炎藥，例如沙利度胺或其衍生物、類維生素Α、蒽三 酚和/或卡泊三醇；-氨基水楊酸鹽和磺胺吡啶的組合，例如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奧沙拉 秦；免疫調(diào)節(jié)劑，例如巰基嘌呤(thiopurines)和皮質(zhì)類固醇，例如布地奈德；_抗菌劑，例如青霉素衍生物、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮、甲硝噠唑和/或吸入性氨基糖苷類；和/或抗病毒劑，例如阿昔洛維、泛昔洛韋、纈昔洛韋、更昔 洛韋、西多福韋；三環(huán)癸烷胺、金剛乙胺；利巴韋林；扎那米韋和/或奧塞米韋；蛋白酶抑制 劑，例如印地那韋、那非那韋、利托那韋和/或沙奎那韋；核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如地達(dá)諾 新、拉米夫定、司他夫定、扎西他濱、齊多夫定；非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如奈韋拉平、依法 韋侖；-心血管藥物，例如鈣通道阻斷劑、β-腎上腺素受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE)抑制劑、血管緊張素-2受體拮抗劑；降脂劑，例如他汀類和/或貝特類；血細(xì)胞形態(tài) 的調(diào)節(jié)劑，例如已酮可可堿；溶解血栓和/或抗凝劑，例如血細(xì)胞聚集抑制劑；-CNS藥，例如抗抑郁藥(例如舍曲林)、抗-帕金森藥(例如塞利吉林、左旋多巴、 羅平尼咯、普拉克索、MAOB抑制劑，如塞樂金(selegine)和雷沙吉蘭、comP抑制劑，如托卡 朋、A-2抑制劑、多巴胺再攝取抑制劑、NMDA拮抗劑、煙堿激動劑、多巴胺激動劑和/或神 經(jīng)元一氧化氮合酶抑制劑)和抗阿爾茨海默病藥物，例如多奈哌齊、利凡斯的明、他克林、 C0X-2抑制劑、丙戊茶堿或美曲磷酯；-治療急性和慢性疼痛的藥劑，例如中樞或外周作用的鎮(zhèn)痛劑，例如阿片類似物或 衍生物、卡巴米嗪、苯妥英、丙戊酸鈉、阿米替林(amitryptiline)或其它抗抑郁藥、對乙酰 氨基酚或非類固醇抗炎藥；-胃腸外或局部-應(yīng)用的(包括吸入的)局部麻醉劑，例如利諾卡因或其類似物；-抗-骨質(zhì)疏松劑，例如激素藥物，如雷洛昔芬或雙膦酸鹽，如阿倫膦酸鹽；⑴胰蛋白酶抑制劑；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗劑；(iii)白介素轉(zhuǎn)換酶 (ICE)抑制劑；(iv) IMPDH抑制劑；(ν)粘附分子抑制劑，包括VLA-4拮抗劑；(vi)組織蛋白 酶；(vii)激酶抑制劑，例如酪氨酸激酶抑制劑(例如，Btk、Itk、Jak3MAP抑制劑的例子可 包括吉非替尼(Gefitinib)、甲磺酸伊馬替尼)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如，MAP激酶，如 p38、JNK、蛋白激酶A、B和C及IKK的抑制劑)、或參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的激酶(例如，依賴周期 蛋白的激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(ix)激肽-B 1-和/或B2-受體拮抗 劑；(χ)抗-痛風(fēng)藥劑，例如秋水仙素；(xi)黃嘌呤氧化酶抑制劑，例如別嘌呤醇；(xii)排 尿酸劑，例如，丙磺舒、苯磺唑酮和/或苯溴馬??；(xiii)生長激素促分泌素；(xiv)轉(zhuǎn)化生 長因子(TGFii) ； (XV)血小板衍生的生長因子(PDGF) ； (xvi)成纖維細(xì)胞生長因子，例如堿 性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) ； (xvii)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) ； (xviii) 辣椒堿乳膏；(xix)速激肽NKl和/或NK3受體拮抗劑，例如NKP-608C、SB-233412 (他奈 坦)和/或D-4418 ； (XX)彈性蛋白酶抑制劑，例如UT-77和/或ZD-0892 ； (xxi) TNF- α轉(zhuǎn) 化酶抑制劑(TACE) ； (xxii)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑或(xxiii)表達(dá)在TH2細(xì) 胞上的化學(xué)引誘物受體—同源分子，(例如，CRTH2拮抗劑)；(xxiv)P38的抑制劑；(xxv) 調(diào)節(jié)Toll-樣受體(TLR)的功能的藥劑和(xxvi)調(diào)節(jié)嘌呤能受體活性的藥劑，例如P2X7 ； (xxvii)轉(zhuǎn)錄因子活化的抑制劑，例如NFkB、API和/或STATS。抑制劑可以是特異性抑制劑或可以是混合型抑制劑，例如靶向上述多種分子(例 如受體)或分子類型的抑制劑。結(jié)合成員還可以共同給予或免疫偶聯(lián)物的形式與化療劑或另一種酪氨酸激酶抑 制劑聯(lián)用。所述抗體非片段還可用在通過重組機制或生物化學(xué)偶聯(lián)獲得的雙特異性抗體 中，從而能結(jié)合上述抗體的特異性與其它抗體的特異性，所述其它抗體能識別涉及IL-4R α有關(guān)活性的其它分子。為了治療炎性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、氣喘、變應(yīng)性鼻炎、慢性阻 塞性肺疾患(COPD)、或牛皮癬，本發(fā)明結(jié)合成員可與一種或多種藥物聯(lián)用，諸如非類固醇抗 炎藥(下稱NSAID)，包括無選擇性環(huán)加氧酶(COX)-1/C0X-2抑制劑(無論局部應(yīng)用或全 身性應(yīng)用)，例如吡羅昔康、雙氯芬酸、丙酸類如甲氧萘丙酸、氟聯(lián)苯丙酸、苯氧苯丙酸、酮 洛芬和布洛芬、滅酸酯類如甲滅酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑酮，例如苯丁唑酮、水 楊酸鹽，例如阿司匹林)；選擇性C0X-2抑制劑(例如，美洛昔康、塞來考昔、羅非考昔、伐 地考昔、陸瑪考昔(lumarocoxib)、帕瑞考昔和艾托考昔)；抑制一氧化氮供體的環(huán)加氧酶 (CINOD)；糖皮質(zhì)激素(無論通過局部、口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)途徑)；甲氨蝶呤、來 氟米特；羥氯喹、d-青霉胺、金諾芬或其它胃腸外或口服金制品；鎮(zhèn)痛劑；雙醋瑞因；關(guān)節(jié)內(nèi) 治療，例如透明質(zhì)酸衍生物；和營養(yǎng)添加劑，例如葡糖胺。本發(fā)明結(jié)合成員還可與治療癌癥的現(xiàn)有治療劑組合使用?？山M合使用的合適藥劑 包括(i)用于醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的抗增殖/抗腫瘤藥物和它們的組合，例如格列衛(wèi)(甲磺酸伊 馬替尼)、烷化劑(例如，順鉬、碳鉬、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、瘤可寧、白消安和亞硝基脲)； 抗代謝物(例如，抗葉酸劑，如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖 胞苷、羥基脲、吉西他濱和紫杉醇；抗腫瘤抗生素(例如，蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素、博來霉 素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素-C、更生霉素和光輝霉素)；抗(有 絲分)裂劑(例如，長春花堿，如長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱及紫杉烷，如紫杉 酚和泰索帝)；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，鬼臼乙叉甙，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、 托泊替康及喜樹堿)；(ii)細(xì)胞抑制藥，例如抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬 和吲哚昔芬(iodoxyfene))、雌激素受體下調(diào)劑(例如，氟維司群)、抗雄激素(例如，比卡 魯胺、氟他胺、尼魯米特和醋酸環(huán)丙氯地孕酮)、LHRH拮抗劑或LHRH激動劑(例如，戈舍瑞 林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制劑(例如，阿那曲 唑、來曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5 α -還原酶的抑制劑，例如非那雄胺；(iii)抑制癌細(xì)胞侵襲的藥劑(例如，金屬蛋白酶抑制劑，如馬立馬司他和尿激酶 纖維蛋白溶酶原激活劑受體功能的抑制劑)；(iv)生長因子功能的抑制劑，例如，這種抑制劑包括生長因子抗體、生長因子受體 抗體(例如，抗-erbl32抗體，曲妥珠單抗和抗-erbbl抗體西妥昔單抗[C225])、法尼基轉(zhuǎn)移 酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，例如，表皮生長因子家族抑制 劑(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制劑，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基_6_(3_嗎啉基 丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)_6，7_ 二 O-甲氧基乙氧 基)喹唑啉-4-胺(埃羅替尼(埃羅替尼)、0SI-774)和6-丙烯基酰氨基-N-(3-氯-4-氟 苯基)-7-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(Cl 103 )，例如，血小板衍生的生長因子家族 的抑制劑和例如，肝細(xì)胞生長因子家族的抑制劑；(ν)抗血管生成藥劑，例如抑制血管內(nèi)皮生長因子的作用的那些藥劑，(例如，抗 血管內(nèi)皮生長因子抗體貝伐珠單抗、國際專利申請WO 97/22596,W097/30035,WO 97/32856 和TO 98/133Μ公開的化合物，各份專利全文納入本文)和以其它機制起作用的化合物(例如，利諾胺、整聯(lián)蛋白α να 3功能的抑制劑和血管他丁)；(vi)血管破壞劑，例如考布他汀Α4和國際專利申請WO 99/02166、W000/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/044 和WO 02/08213中公開的化合物(通過引用將各份 專利全文納入本文)；(vii)反義治療，例如，針對上述靶標(biāo)的那些，如ISIS 2503、抗_ras反義；(viii)基因治療方法，包括例如，替代異常基因，如異常P53或異常BRCAl或 BRCA2的方法、GDEPT(基因指導(dǎo)的酶前藥治療)方法，例如利用胞嘧啶脫氨酶、胸苷激酶或 細(xì)菌硝基還原酶的那些方法和增加患者對化療或放療耐受性的方法，例如多藥抗性基因治 療；和(ix)免疫治療方法，包括例如，離體和體內(nèi)方法以增加患者腫瘤細(xì)胞的免疫原性， 如用細(xì)胞因子，如白介素2、白介素4或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子轉(zhuǎn)染，降低T細(xì)胞無反 應(yīng)性的方法，利用轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，例如細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞的方法，利用細(xì)胞因子轉(zhuǎn) 染的腫瘤細(xì)胞系的方法和利用抗獨特型抗體的方法。本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種上述其它醫(yī)學(xué)組分可用于制備藥物。藥物可以單 獨或組合給予個體，因此可包含結(jié)合成員和其它組分，例如組合制品或單獨的制品。單獨的 制品可用于促進(jìn)單獨且依次或同時給藥，并能通過不同途徑，例如口服和胃腸外給藥而給 予諸組分。按照本發(fā)明，提供的組合物可給予哺乳動物。給藥可以是足以向患者顯示益處的 “治療有效量”。這種益處可以至少緩解至少一種癥狀。所給予的實際量和給藥速度及時 程取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，所治療的具體哺乳動物，各患者的臨床情況，疾病 的誘因，組合物的遞送部位，結(jié)合成員的類型，給藥方法，給藥時間表和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知 的其它因素。普通開業(yè)人員和其它醫(yī)生負(fù)責(zé)治療處方，例如劑量的決定等，其取決于所治 療疾病癥狀的嚴(yán)重程度和/或進(jìn)展?？贵w的恰當(dāng)劑量在本領(lǐng)域是眾所周知的(Ledermarm 等，Int. J. Cancer47 :659-664, 1991 ；Bagshawe 等，Antibody, Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals 4 :915_922，1991)?？衫眠m合于所給予藥物類型的本文所述 或Physician' s Desk Reference (醫(yī)師案頭參考)(2003年版)的具體劑量?？赏ㄟ^在動 物模型中比較其體外活性和體內(nèi)活性來測定本發(fā)明結(jié)合成員的治療有效量或合適劑量。已 知將小鼠和其它測試動物中的有效劑量外推至人的方法。精確劑量取決于許多因素，包括 抗體是用于診斷、預(yù)防還是治療，治療區(qū)域的大小和部位，抗體的精確性質(zhì)(例如，全抗體、 片段或雙抗體)和任何可檢測標(biāo)記物或與抗體相連的其它分子的性質(zhì)。對于全身性給藥， 典型抗體劑量是100μ g-lg，對于局部應(yīng)用是1 μ g-lmg?？梢韵冉o予較高的加載劑量，然后 給予一次或多次較低劑量?？贵w一般是全抗體，例如IgGl同種型。這是成年患者單次治療 的劑量，對于兒童和嬰兒可作適當(dāng)調(diào)整，對于其它抗體形式也可根據(jù)分子量成比例地調(diào)節(jié)。 治療可遵醫(yī)囑以每日一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)。治療可以是每2-4 周皮下給予和每4-8周靜脈內(nèi)給予。在本發(fā)明的一些實施方式中，治療是周期性的，給藥之 間的時期約為兩周或更長，例如約3周或更長，約4周或更長，或約每月一次。在本發(fā)明的 其它實施方式中，治療可以在外科手術(shù)之前和/或之后給予，可以直接給予或應(yīng)用于外科 手術(shù)治療的解剖部位。以下非限制性實施例和附圖對本發(fā)明作出進(jìn)一步描述，其中
圖1是抗體2-42與抗體1的VH結(jié)構(gòu)域的比對(分為表a和表b)。圖2是抗體2-42與抗體1的VL結(jié)構(gòu)域的比對(分為表a和表b)。圖3是抗體1-19和21-42與抗體20的VH結(jié)構(gòu)域的比對(分為表a和表b)。圖4是抗體1-19和21-42與抗體20的VL結(jié)構(gòu)域的比對(分為表a和表b)。圖5是6xCDR的序列相同性表(分為a、b、和c)。圖6是3xVH CDR的序列相同性表(分為a、b、和c)。圖7是3xVL CDR的序列相同性表(分為a、b、和c)。實施例實施例11. 1人IL-4Ra胞外結(jié)構(gòu)域的克隆使用基于人IL_4Ra cDNA序列(RefSeq NM_000418)的引物，經(jīng)PCR從HUVEC cDNA 文庫擴增編碼人IL-4Rci胞外結(jié)構(gòu)域序列(氨基酸殘基1-229，Swiss-Prot保藏號P24394) 的cDNA。所得cDNA遵循生產(chǎn)商(英杰公司(Invitrogen))的使用說明書亞克隆到pD0NR201中。編碼IL-4Ra胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA片段隨后用LR Gateway 反應(yīng)(英杰公司)轉(zhuǎn) 移到哺乳動物表達(dá)載體PDEST12. 2(英杰公司)。pDEST12. 2載體已經(jīng)修飾，包含人IgGlFc 編碼區(qū)，聚組氨酸(His6)標(biāo)簽與插入的感興趣基因同框，還通過插入pCEP4載體(英杰公 司)的oriP復(fù)制起點，從而在轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系后(比如HEK293-EBNA細(xì)胞)附加質(zhì)粒能復(fù)制 進(jìn)而表達(dá)EBNA-I基因產(chǎn)物。人IL-4Rci mRNA的公共數(shù)據(jù)庫登錄號是NM-000418 ；感興趣的關(guān)鍵區(qū)在該數(shù)據(jù)庫 序列中是M3-929。所得人IL-4Ra /Fe的預(yù)見性氨基酸序列示于SEQID NO 妨4。1. 1. 1表達(dá)與純化HEK-EBNA細(xì)胞用PEI轉(zhuǎn)染。依次采用G蛋白層析和尺寸排阻層析從條件化的培養(yǎng) 液純化蛋白質(zhì)。1. 2重組短尾猴IL-4R α及人IL-4R a I75V突變體的克隆使用以下寡核苷酸作為引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從短尾猴胸腺和淋巴結(jié) (BC股份有限公司(BioCat GmbH))擴增短尾猴IL_4Ra亞基5' ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctttaacttt aagaaggaga tataaccatg gggtggctttgctctgggct cctgttgcct gtgagc-3，(SEQ ID NO :451)5' -ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctgctcgaag ggctccctgt aggagttgta cca-3，(SEQ ID NO :452)所得cDNA遵循生產(chǎn)商(英杰公司)的使用說明書亞克隆到pD0NR201中。短尾猴 IL-4Ra胞外結(jié)構(gòu)域的序列示于SEQ ID NO :455。1. 3 人 IL-4R α I75V 變體的克隆使用包含人IL-4Ra編碼序列(氨基酸殘基1_229NP_000409)的pD0NR201載 體產(chǎn)生的人IL-4Ra，I75V的多態(tài)性。利用以下寡核苷酸作為突變引物，使用斯特拉塔基 因公司的快變多定點誘變試劑盒 ^luikChange Multisite-directed mutagenesis kit, Stratagene)將氨基酸位置75處的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸5’-gaagcccacacgtgtgccctgagaacaacgga-3，(SEQ ID NO :453)1. 4產(chǎn)生短尾猴和I75V變體IL-4R α /Fe的重組桿狀病毒短尾猴IL-4Ra和人IL-4Ra I75V變體隨后插入含有人IgGlFc編碼區(qū)的(Gateway 適應(yīng)的pFastBac載體(內(nèi)部)。短尾猴IL4R α /Fe核苷酸和蛋白序列分別示于SEQ ID NO 456和SEQ ID NO :457。I75V IL4R α/Fe核苷酸及蛋白質(zhì)序列分別示于SEQ ID NO :458和 SEQ ID NO :459。重組桿狀病毒穿梭載體的產(chǎn)生如下所示轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌(英杰公 司)，用選擇培養(yǎng)基涂覆在LB瓊脂上。Sfp細(xì)胞用重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染，得到高滴度 重組桿狀病毒。1. 5人I75V及短尾猴Fc標(biāo)記IL-4R α蛋白變體的表達(dá)和純化在SF-900II SFM培養(yǎng)基(英杰公司)中，用病毒MOI 1感染的Sf21細(xì)胞 (400ml)表達(dá)蛋白質(zhì)，細(xì)胞密度3xl06細(xì)胞/毫升。分別在72和96小時后收獲含有分泌的 IL-4Rci-FC融合蛋白的培養(yǎng)液。將Sf21細(xì)胞000ml)的生長培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至pH 8.0。依次 用G蛋白層析和尺寸排阻層析純化蛋白質(zhì)。2.實施例2.先導(dǎo)物分離2.1 選擇利用克隆入基于絲狀噬菌體M13的噬菌粒載體的原初人單鏈Fv(SCFV)噬菌 體展示文庫進(jìn)行選擇(Vaughan 等，Nature Biotechnology 14(3) :309_314，1996 年； Hutchings, C. Generation of Na'ive Human Antibody Libraries (產(chǎn)生原初人抗體文庫), 刊于 Antibody Engineering (抗體工程改造)，R. Kontermann 和 S. Dubel 編，2001，斯普林 格實驗室手冊(Springer Laboratory Manuals)，伯林，第93頁)?；救缫郧癡aughan等 (Vaughan, TJ.等，Nature Biotechnology 14(3) :309-14,1996)禾Π Hawkins 等(Journal ofMolecular Biology 226 :889-896,1992)所述，利用一系列重組人 IL-4R α Fc 的選擇循 環(huán)由噬菌體展示文庫分離抗IL-4Rci特異性scFv抗體。簡言之，為淘選，將PBS(杜貝克 (Dulbecco)PBS,pH 7.4)配制的人 IL-4R α Fc 吸附至 ImmobilizerTM微量滴定板(Nunc)的 各孔上，4°C過夜。用PBS洗滌各孔，然后用PBS-Marve 1(3% w/v)封閉1小時。將包含10倍 過量的無關(guān)Fc標(biāo)記蛋白質(zhì)的PBS-Marvel (3% w/v)配制的純化噬菌體加入各孔，使之與包 被的抗原結(jié)合1小時。用PBS-吐溫(0. 1% ν/ν)和PBS進(jìn)行多輪洗滌以除去未結(jié)合的噬菌 體。洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒，感染入大腸桿菌TGl細(xì)菌并拯救以進(jìn)行下一輪選擇(Vaughan 等，Nature Biotechnology 14(3) :309-314,1996)。2. 2用未純化的scFv抑制IL4與IL-4受體結(jié)合在兩個平行進(jìn)行的時間分辨的均 一熒光(HTRF⑤)受體-配體實驗中篩選周質(zhì)制品中的未純化scFv，以測定對人和短尾猴 IL4Ra的抑制活性。在人試驗中，未純化的scFv樣品和人生物素化IL4(P印rotec，進(jìn)行內(nèi) 部生物素化)競爭與人IL4Ra -Fc受體結(jié)合(R&D系統(tǒng)公司(R and D Systems), 604-4R)。 在短尾猴試驗中，未純化的scFv樣品和短尾猴生物素化IL4 (內(nèi)部大腸桿菌表達(dá)，內(nèi)部生物 素化)競爭與短尾猴IL4Rci -FC-HIS6結(jié)合(內(nèi)部HEK表達(dá))。詳細(xì)的試驗方法參見材料和 方法章節(jié)(2. 4)。對作為未純化的周質(zhì)提取物在人及短尾猴受體-配體試驗中對IL4結(jié)合IL4Rci 顯示抑制作用的 ScFv 進(jìn)行 DNA 測序(參見0sbourn 等，Immunotechnology. 2 181-196， 1996)。在細(xì)菌中表達(dá)有獨特序列的scFv，并通過親和層析純化(如Bannister等所述，Biotechnology and bioengineering,94. 931-937,2006)。2. 3純化的scFv抑制IL-4與IL-4受體結(jié)合通過將一系列的純化scFv稀釋制品與IL4競爭結(jié)合IL4Ra來測定了 scFv樣品 的效力。平行進(jìn)行人及短尾猴受體-配體試驗，如材料與方法章節(jié)2. 4所述。抗體1的純 化scFv制品抑制人IL4與IL4Ra的結(jié)合，Ki值是12nM(95% C18. 7，16. 6)?？贵w1對短 尾猴IL4與IL4Ra結(jié)合的抑制不完全，觀測到10%的試驗信號抑制。因此，不可能由所得 結(jié)果計算準(zhǔn)確的Ki效力數(shù)據(jù)。2. 4材料和方法抑制IL4與IL4R α結(jié)合的受體-配體ΗΤΙ^ 試驗高通量篩選在兩個平行進(jìn)行的時間分辨的均一熒光(HTRF )受體-配體試驗中篩選選擇結(jié) 果，以測定對人和短尾猴IL4Rα的抑制活性。在這兩個試驗中，選擇結(jié)果作為在50mM MOPS緩沖劑pH 7. 4、0. 5mMEDTA及0. 5M 蔗糖中配制的含scFv的未稀釋或稀釋的未純化細(xì)菌周質(zhì)提取物進(jìn)行篩選。所有稀釋在含 有0. 4M氟化鉀和0. 1% BSA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ (試驗緩沖液)中進(jìn)行。3. 2nM的銪穴合物標(biāo)記的山羊抗人Fc抗體(CIS生物國際公司(CIS Biolnternational) 61HFCKLB)與 0. 5nM 的人 IL4Ra /Fe (R&D 系統(tǒng)公司 604-4R)進(jìn)行預(yù)混 (預(yù)混“八”)。IOnM的XL665-偶聯(lián)的鏈霉親和素(CIS生物國際公司611SAXLB)與4nM的 人生物素化IL4預(yù)混(P印rotec，經(jīng)內(nèi)部生物素化)(預(yù)混“B”)。對于短尾猴試驗，同時將3. 2nM的銪穴合物標(biāo)記的山羊抗人Fc抗體(CIS生物國 際公司61HFCKLB)與0. 5nM的短尾猴IL4Ra /Fe (分離/Sf21表達(dá)的)或短尾猴IL4Ra/Fc HIS6 (優(yōu)化/HEK-表達(dá)的)進(jìn)行預(yù)混(預(yù)混“A”)。IOnM的XL665-偶聯(lián)的鏈霉親和素(CIS 生物國際公司611SAXLB)與3nM的短尾猴生物素化IL4預(yù)混(經(jīng)內(nèi)部大腸桿菌表達(dá)及內(nèi)部 生物素化)(預(yù)混“B”)。對于每一試驗，將5 μ 1的預(yù)混“Α”添加到384孔低體積試驗平板(Costar3676)。 隨后添加5 μ 1未純化的scFv樣品。之后添加10 μ 1的預(yù)混“B”。對于人和短尾猴IL4R α受體-配體結(jié)合試驗，分別利用最終IOnM的單克隆小鼠 IgG2a克隆25463 (R&D系統(tǒng)公司)或最終50nM的短尾猴IL4(內(nèi)部大腸桿菌表達(dá))定義非 特異性結(jié)合。然后在室溫下將試驗平板溫育4小時，再用EnVision平板讀數(shù)計(帕金埃爾默公 司(Perkin Elmer))讀取620nm和665nm發(fā)射波長的時間-分辨熒光。通過計算各樣品的％ AF值分析數(shù)據(jù)。按照方程1測定AF。方程1 %AF=(樣品665nm/620nm比值Vi非特異性對照665nm/620nm比值)X 100(非特異性665nm/620nm比值)隨后用％ AF值計算％特異性結(jié)合，如方程2所述。
方程2:%特異件結(jié)合=樣品的％AF X 100 總結(jié)合對照的％AFKi 確定制備一系列稀釋濃度的純化scFv，以在人和短尾猴試驗中確定scFv效力Ki值。 5 μ 1的預(yù)混“Α”添加至IJ 384孔低體積試驗平板(Costar 3676)。隨后添加5 μ 1的scFv稀 釋樣品。之后添加10 μ 1的預(yù)混“B”。對于人和短尾猴IL4Rci受體-配體結(jié)合試驗，分別利用最終IOnM的單克隆小鼠 IgG2a克隆25463 (R&D系統(tǒng)公司)或最終50nM的短尾猴IL4(內(nèi)部大腸桿菌表達(dá))定義非 特異性結(jié)合。然后在室溫下將試驗平板溫育4小時，再用EnVision平板讀數(shù)計(帕金埃爾默公 司)讀取620nm和665nm發(fā)射波長的時間-分辨熒光。通過計算各樣品的％ AF值分析數(shù)據(jù)。按照方程1測定AF。方程1:%AF=(樣品665nm/620nm比值)~(非特異性對照665nm/620nm比值)X 100(非特異性665nm/620nm比值)隨后用％ AF值計算％特異性結(jié)合，如方程2所述。方程2 %特異性結(jié)合= 枰品的XlOO 總結(jié)合對照的％AF利用4-參數(shù)邏輯方程(方程3)，采用圖墊公司Prism軟件通過曲線擬合測定IC5tl 值。方程3 Y =底+(頂-底)/(1+10" ((LogEC50_X)* 斜率(HillSlope)))X是濃度的對數(shù)。Y是特異性結(jié)合。Y從“底”開始，以S形上升到“頂”。IC50值用方程式4描述的Cheng-Prusoff方程轉(zhuǎn)換為Ki 方程4 Ki = IC50/(l+[L]/Kd)實施例3 將 scFv 變型(reformatting)成 IgG23. 1通過將Vh和\結(jié)構(gòu)域分別亞克隆入表達(dá)完整的抗體重鏈和輕鏈的載體而將克隆 從scFv轉(zhuǎn)換成IgG形式。將￥11結(jié)構(gòu)域克隆入含有人重鏈恒定區(qū)和調(diào)節(jié)元件的載體(pEU9. 2) 以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgG重鏈。類似地，將\結(jié)構(gòu)域克隆入表達(dá)人λ輕鏈恒 定結(jié)構(gòu)區(qū)和調(diào)節(jié)元件的載體(PEU4. 4)，以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgG輕鏈。Persic等(Gene 187 :9_18，1997)首先描述了表達(dá)重鏈和輕鏈的載體?？珊唵蔚赝ㄟ^引入OriP 元件工程改造這些載體。為獲得IgG，將重鏈和輕鏈IgG表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入EBNA-HEK293哺 乳動物細(xì)胞(英杰公司R620-07-)。IgG經(jīng)表達(dá)分泌入培養(yǎng)基。合并收集物，過濾后純化。 采用A蛋白層析純化IgG。將培養(yǎng)物上清液加載于大小合適的A蛋白陶瓷柱(生物譜公 司(BioSepra))上，用 50mM Tris-HCl pH 8. 0,250mM NaCl 洗滌。利用 0. IM 檸檬酸鈉(pH 3. 0)將結(jié)合的IgG從柱上洗脫，加入Tris-HCl (pH 9. 0)中和。利用NaplO柱(安瑪西亞 公司(Amersham)，第17-0854-02號)將洗脫物質(zhì)的緩沖液替換成PBS，利用基于IgG的氨 基酸序列的消光系數(shù)，通過分光光度法測定IgG的濃度(Mach等，Anal Biochem. 200(1) 20-26，1992)。采用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析純化IgG的凝聚或降解。3. 2IgG對IL-13和IL-4誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖的抑制利用TF-I細(xì)胞增殖試驗評估純化IgG制品對人IL-13和IL-14生物活性的中和 效力。TF-I是從紅白血病患者建立的人早幼粒細(xì)胞系(premyeloid cell line) (Kitamura 等，J. Cell Physiol. 140(2) :323_34，1989)。TF_1細(xì)胞系的存活和增殖依賴某些因子。TF-I 細(xì)胞能對人IL-13和IL-4起反應(yīng)(派普羅泰克公司(P印rotech)，大腸桿菌來源)。通過 檢測氚化胸苷向分裂細(xì)胞的新合成DNA中摻入減少來確定IL-4和IL-13依賴性增殖的抑 制。該方法的詳述參見材料和方法章節(jié)3. 2. 1?？贵w1的變型IgG制品以濃度依賴性方式抑制IL-13和IL-14誘導(dǎo)的TF-I細(xì)胞 增殖?？贵w1對IL-13和IL-4的IC5tl幾何平均值的計算值分別是18nM和38nM。3. 2. 1材料和方法-純化IgG對IL-13和IL-4誘導(dǎo)的TF-I細(xì)胞增殖的抑制按照提供的方案培養(yǎng)TF-I細(xì)胞(R&D系統(tǒng)公司)。測定培養(yǎng)基包括含有GLUTAMAX 1(英杰公司)、5%胎牛血清(JRH)、1%丙酮酸鈉(西格瑪公司(Sigma))、l-2%青霉素/鏈 霉素的RPMI-1640。各測定前，300xg離心5分鐘以沉淀TF-I細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，將細(xì)胞重 懸于測定培養(yǎng)基。利用以&105個細(xì)胞/毫升的終濃度重懸于測定培養(yǎng)基的細(xì)胞重復(fù)該過 程兩次。用100微升/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔測定板。用測定培養(yǎng)基將IgG測試溶 液(一式兩份)滴定至所需濃度。不針對IL-4Ra的無關(guān)抗體用作陰性對照。試驗以競爭 形式設(shè)定，各為50微升的細(xì)菌衍生重組人IL-4或IL-1313 (派普羅泰克公司)和恰當(dāng)?shù)臏y 試抗體滴定液依次添加到100微升細(xì)胞中。試驗中最終試驗體積是200微升/孔，濃度為 18pM(IL-4)或400pM(IL-13)。IL-4和IL-13的濃度選定為產(chǎn)生最大增殖反應(yīng)的約50% 時的劑量。在37°C和5% CO2下培育平板72小時。然后，在各測定點加入20 μ 1氚標(biāo)記的 胸苷(5 μ Ci/ml)，然后將平板放回培養(yǎng)箱再溫育4-5小時。用細(xì)胞收獲器在玻璃纖維濾板 (帕金埃爾默公司)上收獲細(xì)胞。用帕克托克O^ckard TopCount)微孔板液體閃爍計數(shù)器 測定胸苷摻入。然后，用圖墊公司Prism軟件分析數(shù)據(jù)。實施例4 抗體優(yōu)化4. 1通過靶向誘變優(yōu)化親代克隆發(fā)現(xiàn)并開發(fā)對另一物種例如短尾猴的直向同源蛋白也顯示交叉活性的人IL-4RCI 抗體是有利和有益的。這樣的抗體有助于表征此類抗體的藥理學(xué)和體內(nèi)安全性。效力和對 另一物種的親和力，例如與人活性的差異小于10倍，是一種適當(dāng)?shù)脑u價。為實現(xiàn)所需的物種交叉反應(yīng)，對親代抗體(抗體1)進(jìn)行優(yōu)化，改善對人及短尾猴 IL4Ra的親和力。這可以采用靶向誘變法通過基于親和力的噬菌體展示選擇實現(xiàn)。對于靶向誘變方法，采用Clackson和Lowman (A PracticalApproach (實用方法)，2004年牛津 大學(xué)出版社)所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，通過寡核苷酸指導(dǎo)的可變重鏈(Vh)和輕鏈 互補決定區(qū)3 (⑶舊)誘變產(chǎn)生衍生自抗體1的scFv-噬菌體大文庫。對這些文庫進(jìn)行基于親和力的噬菌體展示選擇以選擇對IL-4Rci的人和短尾猴 形式親和力較高的變體。基本上如前所述(Thompson, Journal ofMolecularBiology. 256 77-88,1996)進(jìn)行選擇。簡言之，scFv噬菌體顆粒用重組生物素化人或短尾猴IL-4Rα在 溶液(bio-huIL-4Ra FLAG HIS 或 bio-cyno-IL_4R a FcHIS，均為內(nèi)部 HEKjBNA 衍生的)中 培育。所用抗原的種類在每一輪選擇中交替使用。然后按照生產(chǎn)商的推薦用鏈霉親和素包 被的順磁性珠(Dynabeads M280)捕捉與抗原結(jié)合的scFv-噬菌體。所選scFv-噬菌體 顆粒隨后按先前描述(0sbourn，JK.等，Immunotechnology，2 (3) 181-96，1996)拯救，選擇 過程在bio-huIL_4Rα或bi0-Cyn0-IL-4Rα濃度下降的情況下重復(fù)進(jìn)行，在每輪選擇之間 交替種類(500ηΜ-250ρΜ，6 輪)。完成6輪選擇后，則合并VH和VL隨機化文庫以形成單一文庫，其中的克隆含 有隨機配對的單獨隨機化的VH和VL序列。如前所述，選擇隨后在bio-huIL-4Ra或 bio-cyno-IL-4Ra濃度下降的情況下(2. 5nM_0. 5pM，另外5輪)繼續(xù)進(jìn)行，適當(dāng)時交替抗 原的種類。4. 2通過隨機誘變優(yōu)化抗體采用隨機誘變方式進(jìn)一步優(yōu)化抗體之一(抗體20)，以鑒定抗體序列中會改善與 人及短尾猴IL4Ra結(jié)合的關(guān)鍵殘基。在抗體20scFV序列的整個可變區(qū)引入隨機突變，生 成大的scFv-噬菌體文庫。利用Diversify PCR隨機誘變試劑盒(BD生物科學(xué)公司(BD biosciences))，按照生產(chǎn)商說明書進(jìn)行兩輪誘變，以便在每輪誘變中，在每一千個核酸序 列的堿基中平均摻入8. 1個突變。該策略中的方案與國際專利申請公開W02006/072801 (劍 橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology)) 一致。對這些文庫進(jìn)行基于親和力 的噬菌體展示選擇以選擇對IL-4RCI的人和短尾猴形式親和力較高的變體?；旧先缜八?Thompson, Journal of Molecular Biology. 256 :77-88, 1996)進(jìn)行選擇。簡言之，scFv噬菌體顆粒用重組生物素化的人或短尾猴IL-4Rci在 溶液(bio-huIL-4Ra FLAG HIS 或 bio-cyno-IL-4R a Fc HIS,均為內(nèi)部 HEK-EBNA 衍生 的)中培育。在人與短尾猴之間交替抗原的種類以便相應(yīng)地改善對特定IL-4Ra的 親和力。然后按照生產(chǎn)商的推薦用鏈霉親和素包被的順磁性珠Dynabeads M280)捕 捉與抗原結(jié)合的scFv-噬菌體。所選scFv-噬菌體顆粒隨后按先前描述(Osbourm， JK.等，Immunotechnology，2 (3) 181-96，1996)拯救，選擇過程在 bio-huIL_4Ra 或 bio-cyno-IL-4Ra濃度下降的情況下重復(fù)進(jìn)行QOnM-lpM，4輪)。4. 3采用受體-配體結(jié)合試驗從隨機誘變鑒定改善的克隆來自靶向及隨機誘變選擇的scFv在細(xì)菌周質(zhì)中表達(dá)并在兩個平行進(jìn)行的時間分 辨的均一熒光(HTRF )受體-配體試驗中篩選，以測定對人和短尾猴IL4Rα的抑制活性。 詳細(xì)的測定方法參見材料和方法章節(jié)2. 4。對在兩個試驗中顯示出顯著抑制效果的kFv進(jìn) 行DNA測序，有獨特序列的scFv制備成純制品。通過將一系列的純化scFv稀釋制品與IL4競爭結(jié)合IL4Ra來測定純化scFv抗 體的效力。平行進(jìn)行人及短尾猴受體-配體試驗，參見測量與方法章節(jié)2. 4。
各樣品的scFv示例性效力數(shù)據(jù)見表1。Ki(IiM)幾何平均值，括號中是好％置信極限scFV人 IL4R短尾猴IL4RscFV人 IL4R短尾猴 IL4R抗體112.0 (8.7’ 16.6)不完全抗體2449pM (25’ 94)0.8 (0.5， 1.0)抗體20-6 (0.5， 0.7)4.3 (2.1,8.9)抗體 24PGL65pM0.7抗體30.548.0抗體2539pM (20， 79)1.3 (0.7， 2.7)抗體40.8 (0.4’ 1.8)6.8(3.4，13.6)抗體260.11.2抗體50.6 (0.1， 2.8)3.8(1.8, 8.2)抗體2763pM2.8抗體60.33.5抗體2894pM1.8抗體71.116.5抗體2961pM2.4抗體80. 49. 4抗體3069pM3. 6抗體90. 1(0. 1， 0. 3)12. 9(9. 0，19)抗體3144pM(26, 76)2.2(1. 4， 3.4)抗體 ο0. 519. 6抗體3275pM1. 3抗體110. 726. 1抗體3392pM1. 4抗體120. 37. 2抗體；3456pM1. 2抗體130. 322. 2抗體；357 IpM2. 6抗體140. 6(0. 4， 0. 9)27. 7抗體360. 15. 3抗體151. 0(0. 8， 1. 2)32. 3抗體3740pM(30, 51)0.8(0. 7， 1.0)
權(quán)利要求
1.一種人白介素-4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，在用ISpM可溶性人IL_4 蛋白的TF-I增殖試驗中，該結(jié)合成員抑制人IL-4(hIL-4)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的IC5tl幾何平均 值小于50pM，且該結(jié)合成員還能結(jié)合短尾猴白介素-4受體a (CyIL-4Ra)0
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合成員，其特征在于，對hIL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用小 于 20pM。
3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合成員，其特征在于，采用受體-配體結(jié)合試驗檢測到，作為 scFv的所述結(jié)合成員與hIL_4Ra和與cyIL_4Ra的結(jié)合比率至少是6 1。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述比率低于210 1。
5.一種分離的結(jié)合成員，其能在至少一個選自SEQ ID而460位置中位置67、68、92或 93的氨基酸殘基處結(jié)合人白介素-4受體a (hIL-4Ra)。
6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員能結(jié)合SEQIDNO :460位 置中位置92和93處的氨基酸。
7.如權(quán)利要求5或6所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員能結(jié)合SEQID NO 460位置中氨基酸67、68、92和93中的每一個。
8.一種人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其包含一組⑶R :HCDR1、 HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中該組⑶R相對于參比組⑶R有10個或更少的氨 基酸取代，其中HCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO :193 ； HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO :194 ； HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO :195 ； LCDRl具有氨基酸序歹Ij SEQ ID NO :198 ； LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO :199 ；和 LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO :200。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的結(jié)合成員，其特征在于，所述一組⑶R相對于參比組⑶R 有4個或更少的氨基酸取代。
10.如權(quán)利要求8或9所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述氨基酸取代包括圖3和4所 示的一個或多個取代。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述氨基酸取代包括在 CDR內(nèi)的以下一個或多個殘基處的氨基酸取代，采用的是Kabat標(biāo)準(zhǔn)編號HCDR2 中的 53、57 ； HCDR3 中的 97、98、99、101、102 ； LCDRl 中的 27、27A、27B、31 ； LCDR2中的56 ；或LCDR3 中的 92、93、94、95、95A、95B、95C、96 或 97。
12.如權(quán)利要求8或9所述的結(jié)合成員，其特征在于，HCDR2中的Kabat殘基53和/或 57被取代。
13.如權(quán)利要求12所述的結(jié)合成員，其特征在于，HCDR2中的Kabat殘基53是精氨酸， 和/或Kabat殘基57是丙氨酸。
14.如權(quán)利要求8或9所述的結(jié)合成員，其特征在于，IXDRl中的Kabat殘基27和/或27B被取代。
15.如權(quán)利要求14所述的結(jié)合成員，其特征在于，IXDRl的Kabat殘基27是甘氨酸，和 /或Kabat殘基27B是絲氨酸。
16.如權(quán)利要求8或9所述的結(jié)合成員，其特征在于，IXDR3中的Kabat殘基95被取代。
17.如權(quán)利要求16所述的結(jié)合成員，其特征在于，IXDR3中的Kabat殘基95是脯氨酸。
18.如權(quán)利要求8-11中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員在構(gòu)架區(qū) 中以下殘基處還包含一個或多個氨基酸取代，采用的是Kabat標(biāo)準(zhǔn)編號HFffl 中的 11、12 ；HFW2 中的 37、48 ；HFW3 中的 68、84、85 ；HFW4 中的 105、108、113 ；LFffl 中的 1、2、3、9 ；LFW2 中的 38、42 ；或LFW3 中的 58、65、66、70、74、85、87。
19.如權(quán)利要求18所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸取代包括圖3 和4所示的一個或多個取代。
20.一種人白介素-4受體α (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其中 HCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO :363 ；HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO :364 ； HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO :365 ； LCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO :368 ； LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO :369 ；和 LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO :370。
21.一種人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其中 HCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO :233 ；HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO 234 ； HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO 235 ； LCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO :238 ； LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO :239 ；禾口 LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO :240。
22.—種人白介素-4受體a (hIL-4Ra)的分離的結(jié)合成員，其與抗體1_42中任意抗 體的6xCDR復(fù)合序列有至少73%的氨基酸序列相同性。
23.如前述任一項權(quán)利要求所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員是或包括含有 抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含HCDRl、HCDR2、HCDR3 和第一構(gòu)架區(qū)，所述VL結(jié)構(gòu)域包含IXDR1、IXDR2、IXDR3和第二構(gòu)架區(qū)。
24.如權(quán)利要求23所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體分子是scFv。
25.如權(quán)利要求23所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體分子包含抗體恒定區(qū)。
26.如權(quán)利要求25所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體分子是IgGl、IgG2或IgG4分子。
27.如權(quán)利要求2346中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述VH結(jié)構(gòu)域包括選自 下組的氨基酸序列:SEQ ID No :2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、 152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、 342、352、362、372、382、392、402、412、422、432 和 442。
28.如權(quán)利要求27所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述VH結(jié)構(gòu)域包括選自下組的氨基 酸序列=SEQ ID NO :362、442、232、422 和 432。
29.如權(quán)利要求23-27中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述第一和第二構(gòu)架區(qū) 由人種系基因區(qū)段編碼。
30.如權(quán)利要求四所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含人種系構(gòu)架 區(qū) Vhl_DP-7_(l-46)。
31.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體分子包括具 有選自下組的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域=SEQ ID NO :7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、 117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、 307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437 和 447。
32.如權(quán)利要求31所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體分子包括具有選自下組的 氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO :367、237、447、437和427。
33.如權(quán)利要求四所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述抗體VL結(jié)構(gòu)域包含人種系構(gòu)架 區(qū) νλ 1_DPL5。
34.如以上權(quán)利要求中任一項所述的結(jié)合成員，其特征在于，采用表面等離振子共振 技術(shù)檢測，所述結(jié)合成員結(jié)合人IL-4Ra的親和力小于20nM，該結(jié)合成員還結(jié)合短尾猴 IL-4Ra。
35.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1-34中任一項所述分離的結(jié)合成員和藥學(xué)上可接 受的賦形劑。
36.一種包含如權(quán)利要求1-34中任一項所述分離的結(jié)合成員的組合物，所述組合物用 于通過手術(shù)或療法治療人或動物體的方法中。
37.如權(quán)利要求35或36所述的組合物，所述組合物用于治療IL-4Rα相關(guān)疾病。
38.如權(quán)利要求1-34中任一項所述分離的結(jié)合成員在制造治療IL-4、IL-13或 IL-4Ra表達(dá)和/或IL-4Rci活性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
39.如權(quán)利要求35-37所述的組合物，或如權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其特征在于，所述 疾病是下組中的一種或多種變態(tài)反應(yīng)、氣喘、支氣管炎、C0PD、炎性腸病、纖維變性病癥、變 態(tài)反應(yīng)、移植排異、延遲型過敏或接觸過敏性反應(yīng)。
40.一種治療與個體中異常IL-4Ra表達(dá)和/或IL-4Ra活性有關(guān)的疾病的方法，所述 方法包括給予該個體如權(quán)利要求1-34中任一項所述的結(jié)合成員。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述疾病是哮喘。
42.一種分離的核酸分子，其包含編碼如權(quán)利要求所述的1-34中任一項所述的結(jié)合成 員或結(jié)合成員的分離的VH或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。
43.一種用如權(quán)利要求42所述核酸體外轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
44.一種產(chǎn)生結(jié)合成員的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述結(jié)合成員的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求43所述的宿主細(xì)胞。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法還包括分離和/或純化所述結(jié)合 成員。
46.如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將所述結(jié)合成員配 制成包含至少一種其它組分的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及白介素-4受體α(IL-4R)的結(jié)合成員，特別是抗體分子，及其在例如治療或預(yù)防IL-4R、IL-4和/或IL-13有關(guān)病癥，例如哮喘和COPD中的治療應(yīng)用。
文檔編號C07K16/28GK102046658SQ200880123045
公開日2011年5月4日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者C·L·多布森, D·L·萊恩, K·馮瓦徹菲爾德特, P·-O·F·埃里克森, S·科恩 申請人:米迪繆尼有限公司