專利名稱：包含至少一種toll樣受體7或toll樣受體8激動劑以及toll樣受體4激動劑的免疫刺激組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫刺激組合物領(lǐng)域，所述免疫刺激組合物包含至少一種Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑，所述受體在抗原呈遞細(xì)胞上呈遞。更具體地說，本發(fā)明涉及額外包含Toll樣受體4激動劑的組合物，以及特別是額外包含疫苗抗原的上述組合物。
現(xiàn)有技術(shù)中已知需要用選自各種不同種類免疫刺激物的佐劑來增加或定向(orienter)存在于疫苗中的抗原所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這可能是人們所期望的，因為當(dāng)單獨給予時，抗原并不足以產(chǎn)生免疫原性，特別是因為其十分高的純度，或因為期望減少存在于疫苗中的抗原數(shù)量或要進(jìn)行的強化次數(shù)，或因為期望延長疫苗所給予的保護時間。有時，與其將目標(biāo)瞄準(zhǔn)于從數(shù)量上改變誘導(dǎo)的應(yīng)答，倒不如從質(zhì)量上來改變。
業(yè)已描述了許多關(guān)于其佐劑特性的分子；但是，目前疫苗用的主要市售佐劑是基于鋁或乳劑的佐劑。
因此，在已知的現(xiàn)有技術(shù)中，具體提到的是專利EP636031，其披露了在豚鼠中1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺作為單純皰疹病毒2糖蛋白疫苗的佐劑的用途。在該文獻(xiàn)中，在用HSV2病毒激發(fā)動物的過程中，所給予的疫苗并不能完全阻止疾病的發(fā)展，但有可能減少損害、病毒的陰道分泌物以及疾病復(fù)發(fā)現(xiàn)象。
根據(jù)Vasilakos等的標(biāo)題為“Adjuvant activities of ImmuneResponse Modifier R848Comparison with CpG ODN”，CellularImmunology 204，64-74(2000)的出版物，咪唑并喹啉衍生物R-848被描述為是一種在試驗中使用的作為給予小鼠的抗原—卵白蛋白的TH1型佐劑。該出版物也描述了另一種由寡核苷酸組成的疫苗佐劑類型，所述寡核苷酸包括二核苷酸CG，其中胞嘧啶沒被甲基化。
在包括Jurk等的標(biāo)題為“Human TLR7 or TLR8 independentlyconfer responsiveness to the antiviral compound R-848”，NatureImmunology，June 2002，Vol.3，No.6，p 499的出版物的其它現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中，陳述了在病原體的免疫應(yīng)答中Toll樣受體扮演著重要的角色，Toll樣受體9為具有非甲基化CpG單位的細(xì)菌DNA所活化，同時R-848通過Toll樣受體7和Toll樣受體8活化細(xì)胞。在Przetak等的標(biāo)題為“Novel synthetic LPS receptor agonists boost systemic and mucosalantibody responses in mice”，Vaccine 21(2003)p961-970的出版物中，描述了帶有脂肪酸鏈的化合物，該化合物沒有糖環(huán)，但具有破傷風(fēng)毒素或卵白蛋白形成的抗原的佐劑活性。已知這些化合物能起動與Toll樣受體4相關(guān)的作用機理。
取決于給藥情況，已知這些化合物全都分別具有不同程度的免疫刺激特性；然而，還是期望能獲得可以加強這些免疫刺激特性的組合物，特別是在給予疫苗抗原情況下。
為達(dá)到該目的，本發(fā)明的主題是提供一種免疫刺激組合物，其包含至少一種Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑，還額外包含Toll樣受體4激動劑。因此，獲得了免疫刺激應(yīng)答的增強。
根據(jù)本發(fā)明一個特定的實施方案，Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑是不同于Toll樣受體4激動劑的化合物。
根據(jù)一個特定的實施方案，免疫刺激組合物額外包含至少一種疫苗抗原。因此，增強了所誘導(dǎo)的抗抗原的免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明一個特定的實施方案，Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑是咪唑并喹啉胺衍生物。這樣的激動劑可通過純化學(xué)合成獲得，因此保證了制藥應(yīng)用所必須的再現(xiàn)性和安全性。
根據(jù)一個特定的實施方案，所述咪唑并喹啉胺衍生物是4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇。
根據(jù)一個實施方案，Toll樣受體4激動劑是申請WO0044758中，特別是ER804057中描述的化合物；這樣的化合物，可通過純化學(xué)合成獲得，也保證了制藥應(yīng)用所必須的再現(xiàn)性和安全性。
鑒于以下詳述的內(nèi)容，參考圖解說明實施例5所獲得結(jié)果的

圖1-4，還發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的眾多其它優(yōu)點。
本發(fā)明涉及免疫刺激組合物；措辭免疫刺激組合物理解為意指能誘導(dǎo)諸如樹突細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞成熟或活化，然后導(dǎo)致某些可被檢測的標(biāo)記物(CD25、CD80、CD83等)在細(xì)胞上表達(dá)，或?qū)е驴杀环治龅募?xì)胞因子(IL6、IL12p70、TNF-α等)分泌的組合物。
根據(jù)一個特定的實施方案，本發(fā)明的免疫刺激組合物包含至少一種疫苗抗原。措辭疫苗抗原理解為意指當(dāng)將其給予人或動物時，能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)應(yīng)答的抗原。免疫系統(tǒng)應(yīng)答可通過抗體的產(chǎn)生或某些細(xì)胞的活化，特別是抗原呈遞細(xì)胞(如樹突細(xì)胞)、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化來證實。
疫苗組合物可以是預(yù)防應(yīng)用或治療應(yīng)用或兩者皆有的組合物。
可以通過任何疫苗常用或推薦的途徑進(jìn)行給藥腸胃外途徑、粘膜途徑，并可以各種劑型提供可注射的或可粉化的液體、凍干或噴霧干燥或風(fēng)干的制劑等等。可通過注射器或無針頭注射器進(jìn)行肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射給藥。也可通過能遞送干粉或液體噴霧的噴霧器在粘膜層面上給藥，而不管它們是鼻、肺、陰道或直腸粘膜。
根據(jù)本發(fā)明在疫苗組合物中使用的疫苗抗原是“直接”抗原，更確切地說不是編碼這些抗原的DNA，而是抗原自身；可以是全微生物或僅僅是該微生物的一部分；因此，在疫苗常用的抗原中，可提到的具體是-多糖，不管它們是單獨的還是綴合有諸如載體蛋白的載體元件的，-減毒的活的全微生物，-滅活微生物，-重組肽和蛋白，-糖蛋白、糖脂、脂肽，-合成肽，-在疫苗稱為“片段”疫苗情況下的裂解微生物。
這些抗原是用于或能被用于治療或預(yù)防各種疾病的抗原，所述疾病例如白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、百日咳、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、黃熱病、傷寒、水痘、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、日本腦炎、腦膜炎、肺炎球菌感染、輪狀病毒感染、AIDS、癌癥、肺結(jié)核、萊姆病、RSV感染、皰疹、衣原體、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌、粘膜炎莫拉菌或B型流感嗜血菌引起的細(xì)菌病、瘧疾、利什曼病、李斯特菌病等等。
本發(fā)明的疫苗組合物可以是供免疫抗單種病原體或癌之用的組合物，更確切地說是其包含一種或多種來自單種病原體或癌的抗原，或者可以是供抗幾種病原體或癌癥免疫之用的組合物(參考疫苗聯(lián)合體)。
對于本發(fā)明目的來說，措辭Toll樣受體7和Toll樣受體8激動劑理解為意指能結(jié)合這些受體任一或兩者且能觸發(fā)與這些受體相關(guān)的信號級聯(lián)的化合物，特別是能激活編碼任一這些受體或兩者的cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中NF-κB易位的化合物。
在適用于本發(fā)明目的的激動劑中，具體提到的是取代的咪唑并喹啉胺，特別是專利US 5389640中描述的那些。使用4-氨基-2-乙氧基-甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇，也稱為R-848，獲得了特別好的結(jié)果，USP5389640的實施例99和101中描述了制備該化合物的方法。
對于本發(fā)明目的來說，措辭Toll樣受體4激動劑理解為意指能與該受體結(jié)合且觸發(fā)相關(guān)的信號級聯(lián)的化合物，特別是能激活編碼該受體的cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中NF-κB易位的化合物。
在適用于本發(fā)明目的的激動劑中，可提到的是革蘭氏陰性細(xì)菌的LPS或，更恰當(dāng)?shù)?，這些LPS的脂質(zhì)A的單磷酸化衍生物，且尤其是在3-位脫?；膯瘟姿峄|(zhì)A或3D-MPL，描述于RIBI的UK專利號2211502和USP 4436727及其再頒發(fā)專利4912094中。諸如那些描述于CORIXA的申請WO98/50399中的產(chǎn)品類似物，特別是RC-529，或者是那些描述于申請WO02/12258中的這些產(chǎn)品的合成類似物也適用于本發(fā)明。同樣地，OM Pharma的申請WO95/14026、WO00/00462、WO01/46126和WO01/46127的主題化合物也可適用于本發(fā)明。
優(yōu)選使用沒有糖環(huán)的純化學(xué)合成產(chǎn)品，例如那些描述于EISAI CO的專利USP 6290973中的，特別是稱為ER 112066的產(chǎn)品，或更優(yōu)選使用稱為ER804057的產(chǎn)品。該產(chǎn)品是(1R，6R，22R，27R)-1，27-二庚基-1，27-雙十二烷?；?9，19-二羥基-9，19-二氧橋-14-氧代-6，22-雙[(1，3-二氧代十四烷基)氨基]-4，8，10，18，20，24-六氧雜-13，15-二氮雜-9，19-二磷酸二十七烷的二鈉鹽，其可根據(jù)專利申請WO0044758中描述的第50號化合物的制備方法，即描述于第32頁的方法而獲得，前提是在產(chǎn)物39至產(chǎn)物41合成的步驟中在EDC(即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)存在下肉豆蔻酰氯預(yù)先為β-酮肉豆蔻酸所取代，其描述于該專利申請的第28頁中。
無論是Toll樣受體4激動劑還是Toll樣受體7和8激動劑，都已知這些激動劑均有免疫刺激特性。本發(fā)明的價值在于在本發(fā)明上下文中所觀察到的應(yīng)答是增強的應(yīng)答。雖然對于不熟悉免疫學(xué)領(lǐng)域的人而言，獲得這樣增強作用最初認(rèn)為顯而易見的，但正相反在本發(fā)明特定領(lǐng)域中反應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是令人驚奇的；實際上，試驗業(yè)已表明當(dāng)兩種或更多種免疫刺激物存在于同一組合物中時，經(jīng)常發(fā)生其中一種免疫刺激物抑制其它免疫刺激物的情況，或無論如何當(dāng)產(chǎn)品發(fā)揮免疫刺激效應(yīng)時，很難進(jìn)一步增加已獲得的應(yīng)答。
在體外免疫刺激試驗中，觀察到與免疫系統(tǒng)細(xì)胞接觸的免疫刺激物所帶來的協(xié)同效應(yīng)，其誘導(dǎo)了完全預(yù)料不到的細(xì)胞活化水平，無法從分別使用每種免疫刺激物所誘導(dǎo)的活化水平來預(yù)見。
同樣地，當(dāng)免疫刺激組合物包含疫苗抗原時，在所獲得的應(yīng)答中觀察到了協(xié)同效應(yīng)，特別是就應(yīng)答物數(shù)量來說，應(yīng)答水平十分好，這是完全預(yù)料不到的，也根本無法從單獨使用的每種佐劑所獲得的應(yīng)答中得出該結(jié)論。
使用這些Toll樣受體7，8和4激動劑所獲得的結(jié)果更加令人驚奇，因為與單獨使用每種激動劑相比，通過組合幾種其它受體激動劑進(jìn)行的試驗并沒有帶來任何觀察到的增強效應(yīng)。
本發(fā)明Toll樣受體4，7和8激動劑具有被給予的疫苗抗原的佐劑特性，這就意味著與它們不存在情況下所獲得的應(yīng)答相比，它們通常能增加或改變給予該疫苗組合物的生物體的免疫系統(tǒng)應(yīng)答。特別是，其可包括體液應(yīng)答或細(xì)胞應(yīng)答或兩者的增加。在應(yīng)答中效應(yīng)或許不會增加，但所誘導(dǎo)的應(yīng)答產(chǎn)生了不同的定向例如定向于細(xì)胞應(yīng)答而不是體液應(yīng)答，產(chǎn)生了某些細(xì)胞因子而不是其它的細(xì)胞因子，產(chǎn)生了某些類型或亞型的抗體而不是其它的抗體，某些細(xì)胞受刺激而不是其它的細(xì)胞，等等。佐劑的效應(yīng)也可以是隨著時間過去而增加免疫應(yīng)答的持續(xù)時間。也包括減少為使免疫個體獲得保護所必須的給藥量，或減少給藥劑量中所含有的抗原的量。
就本發(fā)明來說，根據(jù)所獲得結(jié)果離差的減少，基本上證實了所觀察到的協(xié)同效應(yīng)，特別是在Th1應(yīng)答方面。
在本發(fā)明激動劑給藥過程中，當(dāng)它們與疫苗組合物的抗原組合時，即當(dāng)它們直接存在于疫苗組合物中時，或當(dāng)它們與期望改變免疫原性的抗原分別給予時，可獲得本發(fā)明激動劑的佐劑效應(yīng)。然而，更可取的是在與待給予的抗原相同的疫苗組合物中使用它們。
下列實施例舉例說明了本發(fā)明的特定實施方案。
1.制備Toll樣受體7和8激動劑的儲備懸浮液從Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)購得二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)。
這些化合物以粉末形式提供。
將補充有150μg R-848(0.51μmol)的342μg DPPC(0.46μmol)溶于984μl的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在園底玻璃燒瓶中蒸干溶液，使得在園底燒瓶壁上形成均勻的脂膜。在高真空下進(jìn)一步干燥該膜以便完全除去痕量的殘留溶劑，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通過渦旋均質(zhì)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液，在超聲浴中進(jìn)行超聲處理，然后在50℃恒溫下通過Lipex擠出機穿過0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接著穿過0.4μm孔隙率的膜，最后穿過0.2μm孔隙率的膜順序擠出。
如此，獲得了DPPC/R-848(0.9∶1mol/mol)脂質(zhì)體，在水中濃度分別為DPPC 114μg/ml和R-848 50μg/ml。
2.制備Toll樣受體4激動劑的儲備懸浮液從Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)購得二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，Eisai公司提供了ER804057。
這些化合物以粉末形式提供。
將補充有150μg ER804057(0.092μmol)的273μg DPPC(0.37μmol)溶于760μl的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在園底玻璃燒瓶中蒸干溶液，使得在園底燒瓶壁上形成均勻的脂膜。在高真空下進(jìn)一步干燥該膜以便完全除去痕量的殘留溶劑，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通過渦旋均質(zhì)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液，在超聲浴中進(jìn)行超聲處理，然后在50℃恒溫下通過Lipex擠出機穿過0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接著穿過0.4μm孔隙率的膜，最后穿過0.2μm孔隙率的膜順序擠出。
如此，獲得了DPPC/ER804057(4∶1mol/mol)脂質(zhì)體，在水中濃度分別為DPPC 91μg/ml和ER804057 50μg/ml。
3.制備Toll樣受體4激動劑和Toll樣受體7和8激動劑的儲備懸浮液從Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)購得二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)，Eisai公司提供了ER804057。
這些化合物以粉末形式提供。
將補充有150μg TLA4(0.092μmol)和150μg R-848(0.51μmol)的273μg DPPC(0.37μmol)溶于1.06ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在園底玻璃燒瓶中蒸干溶液，使得在園底燒瓶壁上形成均勻的脂膜。在高真空下進(jìn)一步干燥該膜以便完全除去痕量的殘留溶劑，然后取出在60℃下溶于3ml的水中。通過渦旋均質(zhì)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液，在超聲浴中進(jìn)行超聲處理，然后在50℃恒溫下通過Lipex擠出機穿過0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接著穿過0.4μm孔隙率的膜，最后穿過0.2μm孔隙率的膜順序擠出。
如此，獲得了DPPC/ER804057R-848(4∶1∶5.5mol/mol/mol)脂質(zhì)體，在水中濃度分別為DPPC 91μg/ml、ER80405750μg/ml以及R-84850μg/ml。
4.制備疫苗組合物制備疫苗組合物包括，能用于抗AIDS疫苗的重組蛋白作為疫苗抗原；其是去毒的TAT III B蛋白，是通過在大腸桿菌中表達(dá)并通過多個層析步驟純化，接著如專利申請WO99/33346中所述的進(jìn)行化學(xué)鈍化而獲得的，在此其被鑒定為羧甲基化的Tat。
該組合物制備方法描述如下。
將實施例1-3制備的脂質(zhì)體懸浮液與濃縮的Tat溶液等體積(0.9ml+0.9ml)混合，該Tat溶液濃度為200μg/ml，溶于含有200mM NaCl，pH 7.4的100mM Tris緩沖液中，以便獲得成分標(biāo)示如下的制劑(終體積1.8ml)，其中抗原和佐劑標(biāo)示的是每200μl劑量的量。
1)Tat(20μg)2)Tat(20μg)+ER804057/DPPC(5μg/9.1μg，即3.1nmol/12.4nmol)
3)Tat(20μg)+ER804057/DPPC R-848(5μg/9.1μg/5μg，即3.1nmol/12.4nmol/16.7nmol)4)Tat(20μg)+R-848/DPPC(5μg/11.4μg，即16.7nmol/15.5nmol)5.對小鼠進(jìn)行免疫測試對購買的4組，每組6只8周齡的雌性BALB/c小鼠皮下注射實施例4中制備的一種組合物，每只小鼠的注射劑量為200μl；在D0和D21進(jìn)行注射。
在D14于眶竇后收集血樣用于評估初次應(yīng)答，在D32進(jìn)行二次應(yīng)答的評估。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測定特異性IgG1和IgG2a的水平。
在D37處死小鼠；取出脾并分離脾細(xì)胞。
關(guān)于體液應(yīng)答所獲得的結(jié)果概述于下表和圖1-4中，其中IgG水平表示為任意的ELISA單位(log10)。
對于每組小鼠而言，表中標(biāo)示的值是每組小鼠所獲得值的幾何平均滴度。
IgG1/IgG2a比值可用于評估所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的定向。實際上，小鼠的Th1型應(yīng)答是出現(xiàn)較高比例的IgG2a，而Th2型應(yīng)答是出現(xiàn)較高比例的IgG1。因此可以看到，與單獨使用每種免疫刺激物相比，使用本發(fā)明組合物應(yīng)答更多地定向為Th1型。
通過圖1-4可見每組小鼠所獲得的應(yīng)答，因此可用于評估或大或小的結(jié)果離差。在強化注射后所獲得的IgG2a應(yīng)答水平上，本發(fā)明組合物的特性是值得特別注意的；實際上，當(dāng)使用具有單個免疫刺激物R-848或ER804057的組合物時，所獲得的應(yīng)答水平滿意度一般，注意的是在這些情況下結(jié)果是相對離散的；而使用本發(fā)明化合物的所有小鼠都產(chǎn)生了高的IgG2a水平。在接種疫苗領(lǐng)域該特性是十分重要的，在接種疫苗領(lǐng)域中總是期望著能保護所有的接種對象，但是在不同個體之間經(jīng)常觀察到易變性，因此無法保證進(jìn)行接種的每一個體都能有相同的效果。
在包含Toll樣受體4激動劑以及Toll樣受體7和8激動劑的佐劑所存在的相同疫苗組合物中，觀察到的這些結(jié)果更令人驚奇，因為與單獨使用每種化合物作為佐劑所獲得的應(yīng)答相比，通過將Toll樣受體7和8激動劑與其它也呈遞到抗原呈遞細(xì)胞上的受體激動劑組合所進(jìn)行的測試并沒有改善應(yīng)答。
為評估本發(fā)明藥物組合物對細(xì)胞應(yīng)答的效果，對ELISPOT測定中能產(chǎn)生γ-干擾素的脾細(xì)胞計數(shù)。對有活力的細(xì)胞(fresh cells)和再刺激的細(xì)胞都進(jìn)行該測試。
為進(jìn)行該測試，在僅有培養(yǎng)基或添加重組TAT抗原條件下，將脾細(xì)胞以200000個細(xì)胞/孔的密度在細(xì)胞培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。培養(yǎng)16小時后，目測ELISPOT，即對相應(yīng)于分泌γ-干擾素的細(xì)胞的斑點進(jìn)行計數(shù)。所獲得的結(jié)果概述于下表中；標(biāo)示的值是平均值(每組小鼠)，該平均值是對每只小鼠進(jìn)行添加重組TAT的孔中每百萬細(xì)胞的斑點數(shù)與僅有培養(yǎng)基的孔中每百萬細(xì)胞的斑點數(shù)之間的差值計算得到的平均值。
下表概述了對有活力的細(xì)胞所獲得的結(jié)果。
下表概述了對體外再刺激7天的細(xì)胞所獲得的結(jié)果，條件是存在IL2，使用完整覆蓋TAT蛋白序列的重疊肽庫。
此外，使用ELISA對包括在重組TAT存在或不存在下培養(yǎng)5天的脾細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中IL5細(xì)胞因子和γ-干擾素的分泌進(jìn)行平行測定。所獲得的結(jié)果表示為pg/ml，概述于下表中
這些結(jié)果表明使用本發(fā)明組合物獲得了對TH1應(yīng)答特別有利的效果。
6.制備用于人細(xì)胞刺激測試的脂質(zhì)體懸浮液從Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)購得二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，InVivogen公司提供了4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇(R-848)。
這些化合物以粉末形式提供。
將補充有1mg R-848(3.38μmol)的9.92mg DPPC(13.5μmol)溶于2ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在園底玻璃燒瓶中蒸干溶液，使得在園底燒瓶壁上形成均勻的脂膜。在高真空下進(jìn)一步干燥該膜以便完全除去痕量的殘留溶劑，然后取出在60℃下溶于4ml的水中。通過渦旋均質(zhì)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液，在超聲浴中進(jìn)行超聲處理，然后在50℃恒溫下通過Lipex擠出機穿過0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接著穿過0.4μm孔隙率的膜，最后穿過0.2μm孔隙率的膜順序擠出。
如此，獲得了DPPC/R-848(4∶1mol/mol)脂質(zhì)體，在水中濃度分別為DPPC 2.48mg/ml和R-848250μg/ml。
從Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)購得二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，Eisai公司提供了ER804057。
這些化合物以粉末形式提供。
將補充有11mg ER804057(6.7μmol)的19mg DPPC(25μmol)溶于5ml的氯仿/甲醇4∶1(v/v)混合液中。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在園底玻璃燒瓶中蒸干溶液，使得在園底燒瓶壁上形成均勻的脂膜。在高真空下進(jìn)一步干燥該膜以便完全除去痕量的殘留溶劑，然后取出在60℃下溶于11ml的水中。通過渦旋均質(zhì)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液，在超聲浴中進(jìn)行超聲處理，然后在50℃恒溫下通過Lipex擠出機穿過0.8μm孔隙率的聚碳酸酯膜，接著穿過0.4μm孔隙率的膜，最后穿過0.2μm孔隙率的膜順序擠出。
如此，獲得了DPPC/ER804057(4∶1mol/mol)脂質(zhì)體，在水中濃度分別為DPPC 1.72mg/ml和ER804057 1mg/ml。
7.體外人細(xì)胞刺激測試對4個獨立供體評估本發(fā)明組合物體外誘導(dǎo)來源自人單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞成熟的能力。單核細(xì)胞獲得自外周血單核細(xì)胞并在IL4和GM-CSF存在下培養(yǎng)5-6天。
然后在下列組合物之一存在下培養(yǎng)這些細(xì)胞2天-僅有培養(yǎng)基，作為陰性對照，-根據(jù)實施例6制備R-848/DPPC脂質(zhì)體并稀釋以得到2.96μg/ml的R-848，-根據(jù)實施例6制備的ER804057/DPPC脂質(zhì)體，濃度為0.1μg/ml，-2種脂質(zhì)體制劑的組合物。
然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型分析，可以測定成熟標(biāo)記物CD25、CD80和CD83的表達(dá)，并使用ELISA測定這些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(TNF-α、IL6和IL12p70)。
示于下表的結(jié)果代表對4個供體計算得到的平均值
所獲得的結(jié)果表明本發(fā)明組合物誘導(dǎo)標(biāo)志TH1定向應(yīng)答的細(xì)胞因子例如IL12p70分泌的高能力；通過組合2種產(chǎn)品所獲得的協(xié)同效應(yīng)是顯著的。因此，在所有尋求獲得Th1定向免疫系統(tǒng)應(yīng)答的處理方法中，特別是在期望誘導(dǎo)下列細(xì)胞因子TNF-α、IL-6或IL12p70之一分泌的情況下，特別推薦使用本發(fā)明組合物。
權(quán)利要求
1.一種包含至少一種Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑的免疫刺激組合物，其特征在于額外包含Toll樣受體4的激動劑。
2.如前述權(quán)利要求所述的免疫刺激組合物，其特征在于Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑是不同于Toll樣受體4激動劑的化合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的免疫刺激組合物，其特征在于額外包含至少一種疫苗抗原。
4.如前述權(quán)利要求之一所述的免疫刺激組合物，其特征在于Toll樣受體7激動劑是咪唑并喹啉胺衍生物。
5.如前述權(quán)利要求所述的免疫刺激組合物，其特征在于咪唑并喹啉胺衍生物是4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-1-乙醇。
6.如前述權(quán)利要求之一所述的免疫刺激組合物，其特征在于Toll樣受體4激動劑是ER804057。
7.如前述權(quán)利要求之一所述的免疫刺激組合物在制備藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-6之一所述的免疫刺激組合物在制備能誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一種Toll樣受體7或Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體4激動劑的免疫刺激組合物。本發(fā)明組合物也可包含疫苗抗原。
文檔編號A61P37/04GK1921862SQ200480041947
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者N·布爾丁, J·亨斯勒 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司