用于疫苗接種或免疫的化合物和方法

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用于疫苗接種或免疫的化合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種疫苗接種或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化劑、抗原分子(例如疫苗組分)、和增強光化學內化(PCI)介導的疫苗接種效果的試劑，并用有效活化所述光敏化劑的波長的光進行照射，其中，所述試劑是本文定義的Toll樣受體(TLR)的配體。本發(fā)明還涉及可用于所述方法的抗原組合物，例如疫苗組合物。本發(fā)明還提供了產生抗原呈遞細胞的方法，所述抗原呈遞細胞可用于產生免疫應答，例如用于疫苗接種，該方法涉及利用與上述相同的組分將抗原分子(例如疫苗組分)引入到細胞中以實現(xiàn)抗原呈遞，和可用于所述方法的抗原組合物。本發(fā)明還提供了將利用所述方法體外產生的細胞用于對患者體內施用以引發(fā)免疫應答，例如實現(xiàn)疫苗接種。還提供了將抗原分子內化到細胞中的方法。
【專利說明】用于疫苗接種或免疫的化合物和方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗接種或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化劑、抗原分子 (例如疫苗組分）、和增強光化學內化(PCI)介導的疫苗接種效果的試劑，并用有效活化所述光敏化劑的波長的光進行照射，其中，所述試劑是本文定義的Toll樣受體(TLR)的配體。本發(fā)明還涉及可用于所述方法的抗原組合物，例如疫苗組合物。本發(fā)明還提供了產生抗原呈遞細胞的方法，所述抗原呈遞細胞可用于產生免疫應答，例如用于疫苗接種，該方法涉及利用與上述相同的組分將抗原分子(例如疫苗組分）引入到細胞中以實現(xiàn)抗原呈遞，和可用于所述方法的抗原組合物。本發(fā)明還提供了將利用所述方法體外產生的細胞用于對患者體內施用以引發(fā)免疫應答，例如實現(xiàn)疫苗接種。還提供了將抗原分子內化到細胞中的方法。
[0002] 疫苗接種涉及施用抗原分子以激發(fā)免疫系統(tǒng)從而刺激發(fā)展對病原體的適應性免疫。疫苗可預防或改善感染的發(fā)病率。疫苗接種是預防傳染性疾病的最有效方法，由疫苗接種引起的廣泛免疫力是全球根除天花和世界上大部分地區(qū)限制如脊髓灰質炎、麻疹和破傷風等疾病的主要原因。
[0003] 疫苗的活性劑可以是完整但失活(非感染性)或減毒(具有降低的感染性）的致病病原體形式，或病原體的已發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的純化組分(例如，病毒外殼蛋白）。產生類毒素以針對基于毒素的疾病進行免疫，如對破傷風的破傷風痙攣毒素進行修飾以去除其毒性作用，但保留其免疫原性作用。
[0004] 由于大多數(shù)疫苗通過內吞作用被抗原呈遞細胞攝取，通過核內體運輸至溶酶體以進行抗原消化，并經由MHC-II類途徑呈遞，疫苗接種主要激活CD4T輔助細胞和B細胞。為抗擊病癥或疾病如癌癥和細胞內感染，對細胞毒性CD8T-細胞應答的刺激是重要的。然而，細胞毒性⑶8T細胞的誘導通常由于難以將抗原遞送至胞漿和遞送至抗原呈遞的MHC I類途徑而失敗。光化學內化(PCI)改善了分子向胞漿的遞送，并且采用PCI的疫苗接種方法已知。 PCI是使用光敏化劑并結合可激活該試劑的照射步驟的技術，并且已知實現(xiàn)了將共同施用于細胞的分子釋放到胞漿。這種技術允許被細胞攝取到細胞器如核內體中的分子在照射時從這些細胞器中釋放到胞漿中。PCI提供了一種以不會導致廣泛細胞的破壞或細胞死亡的方式將不可透過膜(或透過性很差)的分子引入細胞的胞漿中的機制。
[0005] 光化學內化(PCI)的基本方法在W096/07432和W000/54802中有所描述，通過引用將二者并入本文。在這樣的方法中，需要內化的分子(其在本發(fā)明中是抗原分子)和光敏化劑與細胞接觸。光敏化劑和需要內化的分子攝取到細胞內的細胞膜包繞的亞區(qū)中，即，它們被內吞到細胞內囊泡(例如溶酶體或核內體）中。在細胞暴露于適當波長的光時，所述光敏化劑被激活，其直接或間接地產生破壞細胞內囊泡的膜的活性物質。這使得內化的分子被釋放到胞漿中。
[0006] 已經發(fā)現(xiàn)，按照這樣的方法，大多數(shù)細胞的功能或活力并沒有受到有害影響。因此，提出了利用這種稱為"光化學內化"的方法來將包括治療劑在內的各種不同的分子輸送到胞漿，即到細胞的內部。
[0007] W000/54802利用這種常用方法來將傳遞分子呈遞或表達在細胞表面上。因此，在分子運輸和釋放到細胞胞漿中后，它（或該分子的一部分)可以被輸送至細胞表面，在這里它可以被呈遞在細胞外側，即，細胞的表面上。這種方法在疫苗接種領域特別有用，其中，疫苗組分即抗原或免疫原可以被引入到細胞以呈遞在細胞的表面上，從而誘導、促進或增強免疫應答。
[0008] 雖然疫苗接種已經取得了一些值得注意的成功，但仍然需要替代的改進疫苗接種方法。本發(fā)明解決了這一需求。
[0009] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，有利的是，涉及利用光敏化劑、抗原分子(例如疫苗組分)和本文限定的TLR配體并以有效活化所述光敏化劑的波長的光進行照射的方法產生了改善的疫苗接種或改善的免疫應答。
[0010] 如將在下面的實施例更詳細進行描述的那樣，已經證實本發(fā)明的方法產生了改進的疫苗接種或改進的免疫應答，例如，產生數(shù)量增加的抗原特異性T細胞。例如，圖1表明，與僅用抗原和光敏化劑治療/照射相比，使用抗原、TLR配體(CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉）、光敏化劑在小鼠體內疫苗接種，并用有效激活光敏化劑的波長的照射，導致小鼠血液和脾臟中抗原特異性T細胞的百分比顯著增加。在體內采用一系列其他TLR配體例如聚（1C)、咪喹莫特和MPLA的實施例中，也表現(xiàn)出協(xié)同效應。因此，本發(fā)明人已證明，在體內使用本發(fā)明方法中的多種TLR配體也可以實現(xiàn)免疫應答的協(xié)同改進。
[0011] 雖然不希望受理論的束縛，但據(jù)信本發(fā)明的方法導致在MHC I類分子的抗原呈遞提高，使得CD8+T細胞應答增加，因而改善了疫苗接種方法。如下面所討論，本申請一些實施例利用〇T-1細胞的模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于評估MHC I類呈遞（參見例如De 1 amarre等 J.Exp.Med. 198:111-122，2003)。在該模型系統(tǒng)中，抗原表位SIINFEKL的MHC I類呈遞導致 0T-1T細胞活化，并且所述活化可通過抗原特異性T細胞的增殖的增加或者IFNy或IL-2的產量的增加來測定。本發(fā)明方法的結果顯示抗原特異性T細胞的數(shù)量增加，以及由T細胞產生的IL-2和IFNy增加，這與增加或改善的抗原呈遞相關。
[0012] 因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括使所述細胞接觸所述抗原分子、光敏化劑、和TLR配體，并用有效活化所述光敏化劑的波長的光照射所述細胞，其中，所述抗原分子釋放到所述細胞的胞漿中，并且所述抗原分子或其一部分隨后呈遞在所述細胞表面上。
[0013]優(yōu)選的是，該方法（以及之后描述的方法)僅利用所述方法中的上述三種活性成分 (試劑），并且所述試劑在該方法中以適當水平(例如，下述的最小水平)存在，從而可影響本發(fā)明的效果（即，在增強PCI疫苗接種/抗原呈遞/免疫應答刺激中有積極作用）。因此，優(yōu)選的是所述試劑存在于不具有其他活性成分的緩沖液中。
[0014] 在所述方法中，所述抗原分子和所述光敏化劑以及可選的本文所述的TLR配體各自被攝取至胞內囊泡中；當照射細胞時，胞內囊泡的膜破裂，將抗原分子釋放到所述細胞的胞漿中。
[0015] 各種試劑可以相對于彼此被攝取至相同或不同的胞內囊泡中。已經發(fā)現(xiàn)，由光敏化劑產生的活性物質可延伸到包含該光敏化劑的囊泡外，和/或囊泡可融合從而使囊泡內容物通過與破裂的囊泡融合而釋放。在本文中提到的"攝取"表示所攝取的分子被完全包含在囊泡內。胞內囊泡由膜包繞，并且可以是在內吞后形成的任何這類囊泡，例如核內體或溶酶體。
[0016] 本文中所用的"破裂的"區(qū)室是指對該區(qū)室的膜的完整性永久或臨時的破壞，該破壞足以使其中容有的抗原分子釋放。
[0017] 本文中所用的"光敏化劑"是能夠在所述試劑受適當波長和強度的照射后活化而產生活性物質時，將吸收的光能轉化為化學反應的化合物。這些過程的高反應性終產物可產生細胞毒性和血管毒性。方便的是，所述光敏化劑可以是定位到細胞內區(qū)室、特別是核內體或溶酶體的光敏化劑。
[0018] 光敏化劑可以通過許多機制直接或間接地發(fā)揮其作用。因此，例如，某些光敏化劑在通過光活化時直接變?yōu)橛卸?，而另一些光敏化劑起到產生毒性物種的作用，所述毒性物種例如為氧化劑，如單線態(tài)氧或其他反應性氧物質，它們對于如脂質、蛋白和核酸等細胞物質和生物分子破壞性極強。
[0019] 多種所述光敏化劑是本領域中已知的，在文獻(包括W096/07432,通過引用將其并入本文）中所有描述，并且可用于本發(fā)明的方法。存在許多已知光敏化劑，包括卟啉、酞菁、紅紫素、二氫卟吩、苯并卟啉、親溶酶體(lysomotropic)弱堿、萘酞菁、陽離子染料和四環(huán)素或它們的衍生物（Berg等，（1997)，J.Photochemistry and Photobiology ,65,403-409)。其他光敏化劑包括特沙弗林、脫鎂葉綠酸(pheophorbides)、類卟吩(porphycenes)、菌綠素 (bacteriochlorin)、酮綠素類(ketochlorins)、血卟啉衍生物和5-氨基乙酰丙酸及其衍生物誘導的內源性光敏劑、光卟啉、光敏化劑二聚體或其他偶聯(lián)物。
[0020] 卟啉是最廣泛研究的光敏化劑。其分子結構包括通過次甲基橋連接在一起的四個吡咯環(huán)。它們是經常能夠形成金屬絡合物的天然化合物。例如，在氧轉運蛋白血紅素的情形中，鐵原子被引入血紅素B的卟啉核中。
[0021] 二氫卟吩是大的雜環(huán)芳香環(huán)，其核心處由通過四個次甲基鍵偶聯(lián)的三個吡咯和一個吡咯啉構成。因此，不像卟啉，二氫卟吩在很大程度上是芳香性的，但不是在整個環(huán)呈現(xiàn) 出芳香性。
[0022] 本領域技術人員可理解哪種光敏化劑適合用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的是定位到細胞核內體或溶酶體的光敏化劑。因此，光敏化劑優(yōu)選是被攝取到溶酶體或核內體的內區(qū)室中的試劑。優(yōu)選的是，光敏化劑通過內吞攝取到細胞內區(qū)室中。優(yōu)選的光敏化劑是二磺化酞菁鋁和四磺化酞菁鋁（例如AlPcS 2a)、磺化四苯基卟啉（TPPSn)、磺化四苯基菌綠素（例如 IPBS2a)、尼羅河藍、二氫卟吩e 6衍生物、尿卟啉I、葉赤素、血卟啉和亞甲基藍?？捎糜诒景l(fā)明的其他合適的光敏劑在W003/020309(通過引用將其并入本文）中有所描述，即，磺化間四苯基二氫卟吩，優(yōu)選TPCS 2a。優(yōu)選的光敏化劑是兩親性光敏化劑(例如二磺化光敏化劑），如兩親性酞菁、撲啉、二氫卟吩和/或菌綠素，特別包括TPPS 2a(二磺酸四苯基卟啉）、AlPcS2a(二磺酸酞菁鋁）、TPCS2a(二磺酸四苯基二氫卟吩）和TPBS 2a(二磺酸四苯基菌綠素）、或其藥學可接受的鹽。此外，還優(yōu)選親水性光敏化劑，例如TPPS4(四磺酸間四苯基卟啉）。特別優(yōu)選的光敏化劑是磺化酞菁鋁、磺化四苯基卟啉、磺化四苯基二氫卟吩和磺化四苯基菌綠素，優(yōu)選 TPCS 2a、AlPcS2a、TPPS4和TPBS2a。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，光敏化劑是二氫卟吩 TPCS 2a (二磺化四苯基二氫卟吩，例如Amphinex ?)。
[0023] 光敏化劑可與載劑連接，從而提供光敏化劑。因此，在本發(fā)明該實施方式的優(yōu)選的方面，所述光敏化劑是光敏化劑和式(I)限定的殼聚糖的綴合物：
[0025]其中，
[0026] n是大于或等于3的整數(shù)；
[0027] R在所述化合物中出現(xiàn)n次，并且
[0028] 所述總的Rn基團的0.1 %~99.9% (優(yōu)選0.5%~99.5% )中，各R是選自以下的基團A:
[0030] 其中，各Ri可以相同或不同，選自H、CH3和-(CH2)b-CH 3;a是1、2、3、4或5;并且b是0、 1、2、3、4或5(其中反荷離子可以為例如CD;優(yōu)選的是辦是?并且b是1，
[0031] 和
[0033] 其中，Y為0、S、S02、-NCH3 或，(〇12)<]〇13;0 = 1、2、3、4或5;并且(1=1、2、3、4或5，優(yōu)選 Y是NCH3并且c是1，
[0034] 其中，各R基團可以相同或不同，并且
[0035] 所述總的Rn基團的0.1 %~99.9% (優(yōu)選0.5%~99.5% )中，各R是選自以下的基團B:
，和
[0037] 其中，
[0038] e是〇、1、2、3、4或 5;并且f是1、2、3、4或 5;優(yōu)選e 和f = l，
[0039] R2是選自以下的基團和
[0041 ] W是選自0、S、NH或N(CH3)的基團，優(yōu)選是NH，
[0042] R3是選自以下的基團
[0045] V是選自C0、S02、P0、P02H或CH2的基團，優(yōu)選的是C0，和
[0046] R4是選自 H、-OH、-0CH3、-CH3、-COCH3、C (CH3) 4、-NH2，-NHCH3、-N (CH3) 2 和-NC0CH3、優(yōu) 選H的基團（取代在鄰、間或對位），其可以相同或不同，其中，各R基團可以相同或不同。 [0047] 殼聚糖聚合物具有至少3個單元(n = 3)。然而，優(yōu)選n是至少10、20、50、100、500、 1000,例如10至100或10至50。
[0048]在優(yōu)選的實施方式中，R2選自
[0050]在另一優(yōu)選的實施方式中，R3選自
[0052] 優(yōu)選的是 R2 或 R3 是 TPPa、TPCalSTPCcl。
[0053] 基團A可提供70至95%的總Rn基團，基團B可提供5至30%的總Rn基團。
[0054]在最優(yōu)選的實施方式中，光敏化劑和殼聚糖的綴合物選自（見圖4中示意圖1-5B的編號）：
[0055] 17:B:25% ,A:75%
[0057] 19:B:25% ,A:75%
[0063] 在上述結構中，所給出的A/B%值是指基團A或B占 Rn基團的比例。星號表示殼聚糖聚合物的其余部分。
[0064] 這些化合物可通過利用本領域標準程序的合成方法制備，本領域技術人員對此熟悉。例如，編號17、19、33和37的下述優(yōu)選綴合物的合成如圖4的反應示意圖1-5B所示(并且還見圖4說明）。
[0065] 本文所使用的"抗原"分子是這樣的分子，其中當以適當方式提呈至免疫系統(tǒng)或免疫細胞時，該分子或其一部分能夠刺激免疫應答。因此有利的是，所述抗原分子將成為疫苗抗原或疫苗組分，如含有多肽的實體。
[0066] 許多這種抗原或抗原疫苗組分在本領域中是已知的，并包括所有方式的細菌或病毒抗原，或者實際上任何致病菌種(包括原生動物或高等生物體）的抗原或抗原組分。雖然傳統(tǒng)上疫苗的抗原組分已包括整個生物體(無論是活的、死的還是減毒的），即全細胞疫苗，但是除此以外，亞基疫苗（sub-unit vaccine)，即，基于生物體的特定抗原組分(例如蛋白或肽，甚至碳水化合物)的疫苗已被廣泛研究并報道在文獻中。任何此類基于"亞基"的疫苗組分均可以用作根據(jù)本發(fā)明的抗原分子。
[0067] 然而，本發(fā)明特別可用在肽疫苗領域中。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選抗原分子是肽 (其如本文中所限定，包括長度較短和較長的肽，即，肽、寡肽或多肽，以及蛋白分子或其片段，例如，5~500、例如10~250、如15~75或8~25個氨基酸的肽）。
[0068]非常大量的肽疫苗候選物已在文獻中提出，例如在病毒性疾病和感染，如AIDS/ HIV感染或流感、犬細小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治療中（參見例如Phanuphak等， Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshil994, 69(4) ,811-20;Casal 等，J.Virol.，1995,69(11)，7274-7;Belyakov等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4)，1709-14;Naruse等，Proc.Natl.Sci.USA,1994 91 (20)，9588-92;Kabeya等，Vaccine 1996, 14(12)，1118_22;Itoh等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,83(23)9174-8)。類似地，可以使用細菌肽，事實上也可以使用源于其他生物體或物種的肽抗原。
[0069] 除源于病原微生物的抗原之外，肽也已被提出用作針對癌癥或如多發(fā)性硬化癥等其他疾病的疫苗。例如，突變癌基因肽非常有希望成為在細胞毒性T淋巴細胞的刺激方面充當抗原的癌癥疫苗（Schirrmacher，Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers ,1997,17,316-327)。合成肽疫苗用于轉移性黑色素瘤的治療也已得到評價 (Rosenberg等，Nat .Med. 1998，4(3)，321-7)。用于多發(fā)性硬化癥的治療的T細胞受體肽疫苗描述于Wilson等，J.Neuroimmunol ? 1997,76(1-2)，15-28中。任何此類肽疫苗組分均可以用作本發(fā)明的抗原分子，事實上因為文獻中描述或提出作為肽疫苗的任何肽也可以。肽因此可以是合成的或分離的肽，或者是源于生物體。
[0070] 本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，抗原是黑色素瘤抗原。"黑色素瘤抗原"可包括一種或多種不同的抗原。
[0071] 例如，在一方面，黑色素瘤抗原是黑色素瘤蛋白或肽，例如抗原肽或T-細胞表位，例如選自gpl〇〇、Melan-A、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3和酪氨酸酶相關蛋白-2(TRP-2)中的一種或多種或其肽表位。這些和其他合適的黑色素瘤抗原在Renkvist等，Cancer Immunol. Immunother ? 50: 3-15，2001 (及其中的參考文獻）和Hodi，Clin ? Cancer ? Res ? 12: 673-678，2006中有所公開，將它們通過引用并入本文。特別是，gplOO、Melan-2、酪氨酸酶、 MAGE-1、MAGE-3和TRP-2及其肽表位在Renkvi st等（同上）中有所描述。因此，本發(fā)明外延至 gp100 、Melan-2、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3或TRP-2,或包括它們經公開的肽表位或由這些肽表位組成的抗原（公開于Renkvist等，同上），或與其具有至少95%序列同一性(利用本領域一致的標準比較技術，在相關比較窗口中）的序列的應用。優(yōu)選的實施方式中，抗原是 TRP-2 和/或 gp 100，優(yōu)選TRP-2。
[0072] 肽抗原，例如長達至少200個氨基酸的肽抗原，可獲自進行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(前United peptide Corp ?，Herndon，VA，美國）。
[0073] 在替代性優(yōu)選的實施方式中，抗原分子源自人乳頭瘤病毒(HPV)。乳頭瘤病毒基因組分為早期區(qū)域(E)和晚期區(qū)域(L)，早期區(qū)域(E)編碼6個化^244』546和￡7)開放閱讀框(0RF)，它們在最初感染宿主細胞后即刻表達;晚期區(qū)域(L)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。所有病毒0RF編碼在一個DNA鏈中。
[0074] 在優(yōu)選的實施方式中，抗原分子包括蛋白或肽、或其片段，即，來自人乳頭瘤病毒 (HPV)的抗原(例如，源自所述病毒），其優(yōu)選是本文所述的早期或晚期蛋白中的一種或其一部分。因此，HPV抗原可以是一種或多種已知抗原肽或T-細胞表位，例如選自任何類型HPV的一種或多種任何已知抗原。HPV類型和抗原的具體情況可見于Ma等，Current Cancer Therapy Reviews 6:81-103,2010〇
[0075] 例如，抗原肽可源自HPV-16和/或HPV-18型HPV或31型或45型HPV。例如，抗原可源自任何￡1、￡2、￡445、￡6或￡7蛋白或任何11和12蛋白。抗原肽可源自冊￥-16和18的￡2、￡6和 E7蛋白中的一種或多種。在優(yōu)選的實施方式中，抗原分子包含HPV-16E7序列GQAEPD RAHYMIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗體字表示）。因此，HPV抗原可以是35個氨基酸的肽。作為另選，抗原分子可僅為CD8表位RAHYNIVTF，即更短的肽。
[0076] HPV肽抗原可獲自進行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(前 United peptide Corp ?，Herndon，VA,美國）。
[0077] -旦通過光化學內化法釋放在細胞胞衆(zhòng)中，抗原分子可以通過細胞的抗原加工機構而加工。因此，根據(jù)本發(fā)明表達或呈遞在細胞表面上的抗原分子可以是被內化(胞吞）的抗原分子的部分或片段。所呈遞或表達的抗原分子的"一部分"優(yōu)選包括通過細胞內的抗原加工機構產生的部分。然而，所述部分也可以通過其他方式(通過適當?shù)目乖O計實現(xiàn)，例如pH敏感的鍵)或通過其他細胞加工方式產生。通常，所述部分的尺寸足以產生免疫應答，例如在大于5個、例如大于10或20個氨基酸的肽的情形中。
[0078] 本發(fā)明增強PCI介導的疫苗接種的試劑是Toll樣受體(TLR)的配體。Toll樣受體是在先天免疫系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)中起關鍵作用的一類蛋白。TLR和白細胞介素-1受體形成受體超家族，命名為白細胞介素-1受體/Toll樣受體超家族。這個家族的所有成員具有Toll-IL-1受體結構域(TIR)。白細胞介素-1受體(IL-1R)家族的成員特征為細胞外免疫球蛋白樣域和細胞內Toll/白細胞介素-IR(TIR)域。具有亞族2TIR域的受體被視為TLR。
[0079] TLR是單一跨膜的非催化性的受體，通常表達在前哨細胞如巨噬細胞和樹突細胞中，這些細胞識別來自微生物的結構保守分子。一旦這些微生物突破如皮膚或腸道粘膜等物理屏障，它們就被Toll樣受體識別，從而激活免疫細胞反應。這些受體識別如病原相關分子等分子，所述分子據(jù)信對病原體的功能至關重要且難以通過突變改變。它們可包括:細菌細胞表面脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂肽和脂阿拉伯甘露糖；蛋白，如來自細菌鞭毛的鞭毛蛋白；病毒的雙鏈RNA;或細菌和病毒DNA的未甲基化CpG島；和在真核DNA的啟動子中發(fā)現(xiàn)的 CpG島；以及某些其它RNA和DNA分子。對于大多數(shù)TLR，配體識別特異性現(xiàn)已通過基因靶向確立。
[0080] 據(jù)估計，大多數(shù)哺乳動物物種具有10到15種類型的Toll樣受體。人和小鼠中一共鑒定出13種TLR(簡稱TLR1至TLR13)(小鼠中13種，人中10種）。
[0081] 本發(fā)明涵蓋了 TLR的所有配體。術語〃配體〃用于表示與生物分子形成復合物以達到生物學目的的物質。在TLR配體的情況中，其為信號觸發(fā)分子，與靶標TLR上的位點結合。當配體與其同源受體結合，其改變受體的化學構象。受體蛋白的構象狀態(tài)決定其功能狀態(tài)。 [0082]因此，本發(fā)明的TLR配體是結合至少一種、或一種或多種toll樣受體(TLR)并導致 TLR活化、例如TLR介導的細胞信號傳導活化的分子。
[0083] TLR信號傳導分為兩種不同信號傳導途徑，MyD88依賴的途徑和TRIF依賴的途徑。本發(fā)明TLR配體激活所述兩種途徑中的一種或兩種。因此，本發(fā)明的配體是結合一種或多種 TLR并活化TLR的分子，例如通過配體結合導致受體構象改變來激活TLR信號傳導。
[0084] MyD88依賴性響應在TLR受體二聚化時發(fā)生，并且由除TLR3之外的每種TLR利用。它的主要作用是活化NFkB和絲裂原活化蛋白激酶。受體中發(fā)生的配體結合和構象變化募集接頭蛋白MyD88，其是TIR家庭成員。MyD88然后募集IRAK4、IRAK和IRAK2。IRAK激酶然后使蛋白 TRAF6磷酸化并活化，該蛋白進而將蛋白TAK1及其本身多泛素化，從而促進與IKKP結合。在結合時，TAK1使IKKP磷酸化，然后IKKP使IKB磷酸化導致其降解，并允許NFKB擴散到細胞核中，激活轉錄，并隨后誘導炎性細胞因子。
[0085] 另一途徑是TRIF依賴的途徑，其被TLR3和TLR4采用。對于TLR3,雙鏈RNA(或類似的，見下文)導致受體激活，募集接頭蛋白TRIFJRIF激活激酶TBK1和RIP1，這會在信號傳導通路中產生支路。TRIF/TBK1信號傳導復合物將IRF3磷酸化，允許其移位至細胞核中，并產生I型干擾素。同時，RIP1的激活以與MyD88-依賴的途徑相同的方式，導致TAK1的泛素化和活化和NFkB轉錄。
[0086]用于確定TLR信號傳導的激活的標準方法在本領域中是公知的，例如確定適當?shù)?信號傳導蛋白的磷酸化狀態(tài)。作為另選，可以通過本領域中公知的方法確定配體是否通過 TLR起作用，例如通過基因刪除編碼特定TLR的基因，并確定配體的作用是否被保留。這種方法可以用于體外和轉基因敲除小鼠體內，轉基因敲除小鼠可商購(TLR2、3和4敲除體可獲自 The Jackson Laboratory，TLR1、2、3、4、5、6、7和9敲除體可獲自 OrientalBioService Inc)。此外，可用的有HEK-Blue?細胞（Invivogen，San Diego，CA，美國），所述細胞被設計為通過測定NF-kB/API活化而研究TLR的刺激?？色@得用于TLR2-9和13的這種細胞。另外，TLR 詰抗劑，例如那些可從Invi vogen獲得的TLR詰抗劑可用于確定TLR的詰抗作用是否抑制推定配體的作用。因此，確定分子是否是TLR配體、例如特定TLR配體的方法是本領域中公知的。
[0087] TLR的結構由富含亮氨酸重復序列（LRR)胞外結構域、螺旋跨膜結構域和細胞內 Toll/IL-1受體同源(TIR)信號傳導結構域構成。胞外結構域含有不同數(shù)量的LRR并類似于彎曲成馬蹄鐵形的螺線管。在兩端存在遮蔽馬蹄鐵體的疏水核心的末端LRR。這些胞外結構域是高度可變的。它們直接參與識別多種病原體相關基序，包括脂多糖、脂肽、胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)DNA、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉、和ds/ssRNA。當受體活化后，TIR信號傳導復合物在受體和接頭蛋白TIR域之間形成。
[0088]受體TLR7、8和9是具有比其他TLR更長的氨基酸序列的家族。它們定位細胞內并響應于非自身的核酸而發(fā)出信號。它們也在其LRR14和15之間包含不規(guī)則鏈段。
[0089] TLR受體的序列是已知的，并且可按照例如前文所述評價本文中所描述配體對受體的結合。例如，已知的TLR氨基酸序列示于下表1中。
[0090] 表 1
[0091]
[0092] TLR1是細胞表面受體，其配體包括脂蛋白和多種三酰脂肽，例如來自細菌的那些。 TLR1自身不識別配體，而是以與TLR2形成的復合物起作用。因此，配體識別TLR1與TLR2的復合物。TLR1識別與TLR2(作為異源二聚體)組合的肽聚糖和(三酰基)脂蛋白。
[0093] 脂蛋白/肽是由與蛋白/肽連接的脂質構成的分子。細菌表達這種分子。三?；?蛋白/肽包括3個?；?。優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的TLR1配體是三酰脂肽。
[0094] TLR1 配體可購自 Invivogen或Enzo Life Sciences(Farmingdale，NY，美國）。例如，Pam3CSK4(InViV〇gen)是合成的三?；?LP)，其模擬了細菌LP的酰基化氨基端。 [00 95]作為另選，可使用Pam3Cys-Ser_(Lys)4三鹽酸鹽（Enzo Life Sciences)，其是與 TLR2復合的TLR1的選擇性激動劑。
[0096] TLR2是被各種各樣的微生物分子刺激的細胞表面受體，所述微生物分子代表了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及支原體和酵母的廣泛物種群。TLR2識別革蘭氏陽性菌的細胞壁組分如肽聚糖、脂磷壁酸和脂蛋白、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖和酵母細胞壁的酵母聚糖。
[0097] 優(yōu)選的TLR2配體為脂聚糖，如脂阿拉伯甘露糖和恥垢分枝桿菌的脂甘露聚糖。特別優(yōu)選的脂聚糖是具有對TLR2特異性的脂多糖(LPS)。這些分子具有通過共價鍵連接的脂質和多糖，且見于革蘭氏陰性菌的外構件中，并充當內毒素。在優(yōu)選特征中，LPS來自牙齦卟啉菌。LPS由通過稱為脂質A的特定糖脂部分錨定在外細菌膜中的多糖區(qū)域構成。脂質A也是內毒素，其引起LPS的免疫刺激活性。
[0099] (Lipid A =脂質A;〇-antigen = 〇-抗原；repeat 40units =重復40個單元；Core poly saccharide =核心多糖；Di saccharide diphosphate =二磷酉愛二糖；Fatty acids =月旨肪酸）
[0100] 脂質A的最具活性形式含有6個脂肪?；⒋嬖谟诓≡绨ＯＪ洗竽c桿菌和沙門氏菌中。
[0101 ]其他優(yōu)選的TLR2配體有:脂磷壁酸，例如，源自諸如枯草桿菌和金黃色葡萄球菌等不同細菌屬的脂磷壁酸;肽聚糖，例如源自諸如枯草桿菌、埃希氏大腸桿菌菌株(例如0111: B4或K12)、金黃色葡萄球菌等等細菌屬的肽聚糖;合成脂蛋白，如合成二酰基化脂蛋白或合成三?；鞍祝缓徒湍妇厶?例如來自釀酒酵母），其為重復葡萄糖單元由0-1，3_糖苷鍵連接的葡聚糖。TLR2配體可商購自Invivogen。
[0102] TLR3見于細胞區(qū)室中。本發(fā)明優(yōu)選的配體為模擬病毒dsRNA的雙鏈RNA分子，例如聚腺苷酸-聚尿苷酸(P〇ly(A:U))或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))。特別優(yōu)選Poly(I:C)。
[0103] 雙鏈RNA(dsRNA)是具有互補雙鏈的RNA，與所有細胞中發(fā)現(xiàn)的DNA相似。dsRNA形成某些病毒(雙鏈RNA病毒）的遺傳物質。雙鏈RNA如病毒RNA或siRNA可觸發(fā)真核細胞中的RNA 干擾，以及脊椎動物中的干擾素應答。
[0104] 在優(yōu)選的特征中，配體是Poly^ChPoly I:C是一條鏈為肌苷酸聚合物、另一條鏈為胞苷酸聚合物的錯配雙鏈RNA。這種分子可通過公知技術制備。存在各種商購來源，例如可購自Invivogen的以下物質，并形成優(yōu)選的實施方式：
[0105] -Poly(I:C)(HMW)，具有高分子量，平均尺寸為1.5kb_8kb，和
[0106] -Poly(I:C)(LMW)，具有低分子量，平均尺寸為0.2kb_lkb。
[0107] 高分子量和低分子量形式均是用于本發(fā)明的優(yōu)選形式。
[0108] TLR4也存在于細胞表面，并具有數(shù)種配體類型，尤其包括脂多糖(LPS)、數(shù)種熱休克蛋白、纖維蛋白原、硫酸肝素片段、透明質酸片段、鎳和各種阿片類藥物。在一個優(yōu)選方面，配體是LPS1PS可源自各種細菌物種，例如埃希氏大腸桿菌0111:B4或K12或沙門氏菌 (通過酚-水混合物提取），在優(yōu)選的特征中，LPS源自埃希氏大腸桿菌或明尼蘇達沙門氏菌，例如菌株R595。在另一優(yōu)選的方面，TLR4配體是單磷酰脂A(MPLA)，其可從細菌(例如明尼蘇達沙門氏菌R595)中分離或通過合成制備。通常，TLR4配體可商購自例如Invi vogen。
[0109] TLR5結合來自革蘭式陽性菌和革蘭氏陰性菌的配體鞭毛蛋白，如枯草桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌等。鞭毛蛋白是球狀蛋白，將其自身排列為空心圓筒從而形成細菌鞭毛中的細絲。其具有約30,000至60,000道爾頓的質量。鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要取代物，大量存在于幾乎所有有鞭毛的細菌中。因此，優(yōu)選的TLR5配體是鞭毛蛋白，優(yōu)選來自如上所述的細菌。TLR5配體可商購自例如Invivogen。
[0110] TLR6結合多種二酰脂肽。如上所述，脂肽存在于細菌中，并包含與肽連接的脂質。二酰脂肽具有2個?；?，并形成用于本發(fā)明的優(yōu)選TLR6配體。TLR6配體可商購自Invivogen。例如，F(xiàn)SL-l(Pam2CGDPKHPKSF)是來自唾液支原體的與MALP-2相似的合成脂蛋白，MALP-2是源自發(fā)酵支原體的脂肽(LP)。支原體LP(如FSL-1)含有二?；陌腚装彼釟埢毦鶯P 含有三?；陌腚装彼釟埢SL-1被TLR6與TLR2的組合識別，而細菌LP被TLR2和TLR1的組合識別。
[0111] TLR7配體包括小的合成化合物咪唑并喹啉、如腺嘌呤和鳥苷類似物（例如洛索立賓)等堿基類似物和溴匹立明，以及單鏈RNA。
[0112]咪唑并喹啉化合物是雙環(huán)有機分子，優(yōu)選具有下式，其中辦和此處的基團可變。 [0113]優(yōu)選的是，咪唑并喹啉化合物具有式1或其藥學可接受的鹽：
[0115] 其中，是氨基烷基，其可選地取代有例如羥基，并且R2是烷基，且可選地間插有氧或氮基團；其中，優(yōu)選的是
[0116] 辦是^012-(：(013)2-1?3;
[0117] R2 是-CH2-X-CH2CH3 或氫原子；
[0118] R3是0H或氫原子，并且X是0或NH。
[0119] 上式中，烷基可以為基團。
[0120]這些化合物的實例在本領域中已知，例如雷西莫特(或R848)(l-[4-氨基_2_(乙氧基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇）、咪喹莫特(3-(2_甲基丙基)-3,5,8_ 三氮雜三環(huán)[7.4.9.0 2'6]十三碳-1(9)，2(6)，4,7，10，12-己烷-7-胺）和嘎德莫特(1?1是1 CH2-C (CH3) 2〇H; R2是-CH2-NH-CH2CH3; 1 - [ 4-氨基-2-(乙基氨基甲基）咪唑并[4，5-C ]喹啉-1 -基]-2-甲基丙-2-醇）（均可獲自InvivoGen(San Diego CA,美國））。在優(yōu)選的實施方式中，化合物選自雷西莫特和咪喹莫特。
[0121] 這些化合物的藥學可接受鹽也涵蓋在本發(fā)明中。合適的鹽包括例如乙酸鹽、溴鹽、氯鹽、檸檬酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、硬脂酸鹽、甲苯磺酸鹽、鈣鹽、葡甲胺鹽、鉀鹽和鈉鹽。
[0122] 洛索立賓是在N7和C8位衍生化的鳥苷類似物。這種核苷是免疫系統(tǒng)的非常強力的刺激劑。
[0123] 溴匹立明是具有抗癌和抗病毒性質的試驗藥物，結構如下所示：
[0125] 單鏈RNA是優(yōu)選的TLR7配體，例如ssPolyU，其中，優(yōu)選的是所述單鏈分子長度為20 至200個核苷酸。所述分子容易通過合成制備。
[0126] TLR8配體是通常較小的合成化合物或單鏈RNA。優(yōu)選的是所述TLR8配體是上述 ssPolyU 分子。
[0127] TLR9配體包括未甲基化的CpG寡脫氧核苷酸DNAXpG〃寡核苷酸（或CpG 0DN)是所述配體的實例，是胞嘧啶三磷酸脫氧核苷酸(〃C〃)與鳥嘌呤三磷酸脫氧核苷酸(〃G〃)結合形成的短單鏈合成DNA分子。〃p〃是指連續(xù)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，不過某些0DN作為替代具有經修飾的硫代磷酸酯(PS)骨架。如本文所指代，CpG核苷酸稱為CpG基序。CpG基序未被甲基化。包含CpG基序的序列被認為是病原體相關的分子模式(PAMP)，這是因為它們大量存在于微生物基因組中，但在脊椎動物基因組中極少。CpG PAMP被模式識別受體(PRR)To 11樣受體9(TLR9)識別。TLR9識別特定的將微生物DNA與哺乳動物DNA區(qū)分開的非甲基化CpG寡核苷酸(0DN)序列。
[0128] 已經描述了三種主要類型的刺激性0DN:A型、B型和C型。A型CPG 0DN由混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架構成，并含有一種或多種CpG基序作為回文序列的一部分。A型CPG 0DN具有位于3'和5'端的poly G尾部(促進串聯(lián)體(concatemer)形成的結構基序）j型CPG 0DN通常在一端或兩端含有7至10個硫代磷酸酯修飾的堿基，抵抗核酸酶的降解，并提高0DN 的穩(wěn)定性。例如，內部回文序列長度可以為8至16(優(yōu)選的是10、12或14)個堿基對并在堿基順序上有變化，然而，優(yōu)選的模式5'-0 Pu CG Pu:泛CG Py Py-3'，其中，與回文中心（以 ":"標示)等距離的堿基Pu、Py互補。在DNA鏈任一末端的poly G尾部的長度可變。
[0129] B型CPG 0DN可具有一種或多種包含CpG基序的6聚體共有序列。人共有序列可包含序列5'-Pu Py C G Py Pu-3'（小鼠序列可以不同型CPG 0DN具有完全硫代磷酸酯化(PS 修飾)的骨架，通常長度為18至28(例如18-22)個核苷酸。B型CPG 0DN的實例是0DN 1826,其具有序列5 ' -tccatgacgttcctgacgtt-3 '。
[0130] C型CPG 0DN結合了A型和B型的特征。C型CPG 0DN完全由硫代磷酸酯核苷酸構成，并含有包含一種或多種CpG基序的回文序列。C型CpG 0DN的實例是0DN 2395,具有序列5'- tcgtcgttttcggcgc: gcgccg-3 '（下劃線為回文序列）。
[0131] 另外，還可以使用含有兩個回文序列的P型CpG 0DN，從而使它們形成更高級的結構。
[0132] CpG寡核苷酸可通過本領域已知的標準寡核苷酸合成方法來合成。
[0133] 因此，本發(fā)明的CpG寡核苷酸外延為6個至50個堿基(優(yōu)選18個至27個、優(yōu)選20個至 25個堿基）的單鏈寡核苷酸，，其包含至少一個CpG基序和各處在所述基序3 '和5 '側的至少一個堿基，其中，所述CpG基序是胞嘧啶和其后以磷酸酯或硫代磷酸酯鍵連接的鳥嘌呤，其中胞嘧啶的嘧啶環(huán)未被甲基化。在一個實施方式中，一個或多個基序側翼是與所述一個或多個基序共同形成回文序列的序列。如本文所用的〃回文序列〃是指正向序列與反向的互補序列連接，從而使該序列可形成發(fā)夾，例如 CggCgC:gCgCCg(其中，回文的中心以〃：〃標示）。 CpG基序可形成序列的中心和/或位于回文序列中的其他部位。優(yōu)選的是，回文序列(包括正向和反向序列）長度為8至16、優(yōu)選10至12或10至14個堿基。
[0134] 在另一優(yōu)選的方面，CpG寡核苷酸序列包含回文序列5'_Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3'（其中，與回文中心（以":"標示)等距離的堿基Pu、Py互補)和/或一個或多個共有序列 5'-Pu Py CG Py Pu-3'?？蛇x地，CpG寡核苷酸可含有長度為3至8個堿基的位于3'或5'末端的poly G尾部。
[0135] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，CpG寡核苷酸是18-27個堿基的C型CPG 0DN，其具有10-14個堿基的回文序列和硫代磷酸酯骨架。特別優(yōu)選的是具有下述序列的0DN 2395:
[0136] 5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg_3'（下劃線為回文序列）。
[0137] 在本發(fā)明的替代性優(yōu)選的實施方式中，CpG寡核苷酸是具有18-22個堿基和硫代磷酸酯骨架的B型CPG 0DN。特別優(yōu)選的是具有下述序列的0DN 1826:
[0138] 57-tccatgacgttcctgacgtt-37 〇
[0139] TLR11和TLR12配體包括抑制蛋白（profilin)，抑制蛋白是參與肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)翻轉和重構的肌動蛋白結合蛋白。因此，優(yōu)選的TLR11/12配體是來自弓形蟲的抑制蛋白，弓形蟲是引起弓形蟲病的專性細胞內寄生原蟲。抑制蛋白可購自例如Enzo Life Sciences。
[0140] TLR13配體包括細菌核糖體RNA序列"CGGAAAGACC"，包含該核苷酸序列的核酸與該配體構成本發(fā)明的一個優(yōu)選方面。序列為5 '-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3 '的寡核苷酸是TLR13 配體，可購自例如Invivogen。
[0141] 因此，優(yōu)選所述TLR配體是TLR2、3、4、7、8或9配體，優(yōu)選如上所述的配體。在優(yōu)選的實施方式中，TLR配體是TLR3配體，優(yōu)選如上所述。在替代性的優(yōu)選實施方式中，TLR配體是 TLR4配體，優(yōu)選如上所述。在另一替代性的優(yōu)選實施方式中，TLR配體是TLR7~9配體、或 TLR7配體、或TLR8配體或TLR9配體，優(yōu)選如上所述。
[0142] 此處所用的"表達"或"呈遞"是指抗原分子或其一部分提呈在所述細胞表面上，其使得該分子的一部分暴露于細胞周圍的環(huán)境并與其互通，優(yōu)選使得可對所呈遞的分子或其一部分產生免疫應答。在"表面"上的表達可以如此實現(xiàn)，其中擬表達的分子與細胞膜和/或可存在于該膜中或可致使存在于該膜中的組分接觸。
[0143] 本文中使用的術語"細胞"包括所有真核細胞(包括昆蟲細胞和真菌細胞）。因此，代表性"細胞"包括所有種類的哺乳動物和非哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和原生動物。但是，優(yōu)選的是，所述細胞為哺乳動物細胞，例如來自貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的細胞，但最優(yōu)選的是來自人的細胞。進行本發(fā)明方法、應用等的細胞可以是能夠在表面上表達或呈遞被施用或運輸?shù)狡浒麧{中的分子的任何細胞。
[0144] 所述細胞通常為免疫細胞，即，參與免疫應答的細胞。然而，其他細胞也可以將抗原呈遞至免疫系統(tǒng)，因此這些細胞也落入本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的細胞因此有利地是下文所述的抗原呈遞細胞。抗原呈遞細胞可參與本文所述的免疫應答的任何方面或"臂(arm)"。
[0145] 細胞毒性細胞的刺激需要抗原呈遞至將被抗原呈遞細胞以特定方式刺激的細胞，例如MHC I類呈遞(例如，CD8+細胞毒性T細胞的激活需要MHC-1抗原呈遞）。產生抗體的細胞還可以被抗原呈遞細胞的抗原呈遞所刺激。
[0146] 抗原還可以被抗原呈遞細胞通過內吞來攝取，并在內吞囊泡中降解為肽。這些肽可結合核內體中的MHC II類分子，并運輸至細胞表面，在那里肽-MHC II類復合物可被⑶4+ T輔助細胞識別，并誘導免疫應答。作為另選，胞漿中的蛋白可被降解，例如被蛋白酶體降解，并通過ATP(與抗原呈遞相關的轉運子)運輸至內質網(wǎng)，在那里肽可結合MHC I類分子，并運輸至細胞表面(Yewdell和Bennink, 1992,Adv. Immunol .52:1-123)。如果肽是異源抗原來源，肽-MHC I類復合物將被⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)識別。CTL可結合肽-MHC(HLA)I類復合物并由此被活化，開始增殖并形成CTL克隆。靶標細胞和細胞表面上具有相同肽-MHC I類復合物的其他靶標細胞可被CTL克隆殺死。如果胞漿中引入了足夠量的抗原，則可以建立對抗異源抗原的免疫力（Yewdell和Bennink, 1992，同上；Rock, 1996，Immunology Today 17 : 131-137)。這是開發(fā)尤其是癌疫苗的基礎。最大的實際問題之一是向胞漿中引入足夠量的抗原(或抗原的部分）。這可通過本發(fā)明來解決。
[0147] 如上所述，一旦通過光化學內化法釋放在細胞胞漿中，抗原分子可以通過細胞的抗原加工機構而加工，并以適當方式(例如通過MHC I類)而呈遞在細胞表面上。該加工可以涉及抗原的降解，例如蛋白或多肽抗原降解成肽，所述肽然后與用于呈遞的MHC分子復合。因此，根據(jù)本發(fā)明表達或呈遞在細胞表面上的抗原分子可以是被內化(胞吞）的抗原分子的部分或片段。
[0148] 多種不同的細胞種類可在其表面上呈遞抗原，例如包括淋巴細胞(T和B細胞）、樹突細胞、巨噬細胞等。其他細胞包括例如癌細胞，例如黑素瘤細胞。這些細胞在本文中稱為" 抗原呈遞細胞〃?！▽ｉT抗原呈遞細胞〃是主要參與將抗原遞呈給免疫系統(tǒng)效應細胞的細胞，這在本領域中已知并在文獻中有所描述，包括B淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞。優(yōu)選的是，細胞是專門抗原呈遞細胞。
[0149] 對于由抗原呈遞細胞向細胞毒性T-細胞(CTL)進行的抗原呈遞，抗原分子需要進入抗原呈遞細胞的胞漿(Germain，Cel 1，1994，76，287-299)。
[0150] 在本發(fā)明的例如涉及體外或離體方法的實施方式中，或作為另選涉及體內方法的實施方式中，細胞是樹突細胞。樹突細胞為形成哺乳動物免疫系統(tǒng)一部分的免疫細胞。其主要功能是將抗原材料加工并呈遞在免疫系統(tǒng)的其他細胞的表面上。一旦被激活，它們迀移至淋巴結并在那里與T細胞和B細胞相互作用從而引發(fā)適應性免疫應答。
[0151] 樹突細胞源自造血骨髓祖細胞。這些祖細胞初始轉變?yōu)槲闯墒鞓渫患毎?，未成?樹突細胞的特征是高內吞活性和低T-細胞激活潛力。一旦它們接觸到可呈遞的抗原，它們就被活化成成熟的樹突細胞，并開始迀移至淋巴結。未成熟的樹突細胞吞噬病原體并將其蛋白降解為小塊，并在成熟時將那些片段利用MHC分子呈遞在其細胞表面。
[0152] 樹突細胞可源自任何合適的樹突細胞來源，例如如來自皮膚、鼻內襯、肺、胃、腸或血液。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，樹突細胞來源于骨髓。
[0153] 樹突細胞可以從天然來源分離，以用于本發(fā)明的體外方法，或可以在體外產生。樹突細胞產生自單核細胞，即，在體內循環(huán)并根據(jù)正確信號可以分化成樹突細胞或巨噬細胞的白細胞。單核細胞轉而由骨髓中的干細胞形成。單核細胞衍生的樹突細胞可以從外周血單個核細胞(PBMC)體外生成。將PBMC鋪設在組織培養(yǎng)瓶中使得單核細胞粘附。以白細胞介素-4(IL-4)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)處理這些單核細胞導致在約一周內分化為未成熟樹突細胞（iDC)。后續(xù)以腫瘤壞死因子(TNF)處理進一步將iDC分化為成熟的樹突細胞。
[0154] 如本文所用的"接觸"是指使細胞和光敏化劑和/或抗原分子和/或本文定義的TLR 配體在適合于內化到細胞中的條件下相互物理接觸，例如優(yōu)選的是在37°C在適當營養(yǎng)培養(yǎng) 基中，例如25°C至39°C，或在體內于體溫（即，36°C至38°C)。
[0155] 細胞可以連續(xù)或同時與本文限定的光敏化劑和抗原分子和TLR配體接觸。優(yōu)選并且方便的是，所述組分與細胞同時接觸。光敏化劑和抗原分子(和可選的TLR配體)可被細胞攝取到相同或不同的細胞內區(qū)室(例如，它們可以共同轉位）。
[0156] 隨后將細胞暴露于適合波長的光以激活光敏化合物，該光敏化合物進而引起細胞內區(qū)室膜的破裂。
[0157] W0 02/44396(通過引用將其并入本文)描述了一種方法，其中，該方法中步驟的順序可以安排為例如使光敏化劑接觸細胞，然后在需要內化的分子(此情況中為抗原分子)接觸細胞之前以照射進行活化。該方法利用了以下事實:將被內化的分子在照射時無需與光敏化劑存在于同一細胞亞區(qū)室中。
[0158] 因此在一個實施方式中，所述光敏化劑和/或所述抗原分子和/或本文定義的TLR 配體一同地或相互分開地應用于細胞。然后在至少光敏化劑和抗原分子存在于同一細胞內區(qū)室中時進行照射。這被稱為〃后光（light after)〃法。
[0159] 在替代性實施方式中，所述方法可通過首先使所述細胞接觸光敏化劑，然后接觸抗原分子和/或本文定義的TLR配體來進行，照射在光敏化劑被攝取到細胞內區(qū)室中之后、但在細胞攝取抗原分子(和可選的TLR配體)進入包含所述光敏化劑的細胞內區(qū)室之前（例如，其在光暴露時可存在于不同的細胞內區(qū)室)進行，優(yōu)選在細胞攝取抗原分子(和可選的 TLR配體)到任何細胞內區(qū)室之前進行，例如在任何細胞攝取抗原分子(和可選的TLR配體）之前進行。因此，例如可施用光敏化劑，然后進行照射，并隨后施用其余試劑。這是所謂的〃先光(light before)〃法。
[0160] 如本文所用的"內化〃是指分子的細胞內遞送，例如胞漿遞送。在此情形中，"內化〃可包括分子從細胞內/膜包繞區(qū)室中釋放到細胞的胞漿中的步驟。
[0161] 如本文所用的"細胞攝取"或"轉位"是指內化的一個步驟，即，其中細胞膜外的分子被攝入到細胞中從而使其出現(xiàn)在外部排布的細胞膜之內，例如通過內吞作用或其它適當的攝入機制，例如進入或結合細胞內膜所限定出的區(qū)室，例如內質網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、核內體等。
[0162] 細胞與各種試劑接觸的步驟可以以任何方便的或期望的方式來進行。因此，如果該接觸步驟在體外進行，則細胞可方便地保持在水性介質中，例如適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中，并在適當?shù)臅r間點將各種試劑在適當?shù)臈l件(例如適當?shù)臐舛群瓦m當?shù)臅r長)下簡單地加入到介質中。例如，所述細胞可在無血清培養(yǎng)基的存在下或含血清培養(yǎng)基的存在下與所述試劑接觸。
[0163] 下面的評述對分開將各種試劑應用于細胞進行討論。不過，如上所述，這些試劑可以一起、分別、同時或依次應用于細胞。如本文所述，在本發(fā)明方法中使用的各種試劑可在體外或體內應用于細胞。在體內的情形中，如下文更詳細地描述那樣，應用可以通過直接 (即，局部)或間接(即，全身或非局部)施用。
[0164] 光敏化劑以適當?shù)臐舛群瓦m當?shù)臅r長接觸細胞，所述適當?shù)臐舛群瓦m當?shù)臅r長是本領域技術人員利用常規(guī)技術容易確定的，并取決于諸如所用的特定光敏化劑和靶標細胞類型和位置等因素。光敏化劑的濃度利于使得一旦其被攝入到細胞中（例如進入或結合一種或多種其細胞內區(qū)室)并被照射激活，則一種或多種細胞結構就會被破壞，例如一種或多種細胞內區(qū)室裂解或破裂。例如，本文所述的光敏化劑可以以例如l〇μg/ml至50μg/ml的濃度使用。
[0165] 對于體外使用，范圍可以更寬，例如0.0005μg/ml至500μg/ml。對于人體內治療，光敏化劑可以在進行全身施用時以〇 . 〇5mg/kg體重至20mg/kg體重來使用。作為另選， 0.005mg/kg體重至20mg/kg體重的范圍可用于全身施用。更方便的是，光敏化劑可局部施用，例如通過皮內、皮下或腫瘤內施用，并且在此情況下，劑量可以是lyg至5000yg，例如10y g 至 2500iig、25iig 至 1000iig、50iig 至 500iig、lOyg 至 300iig 或 lOOlig 至 300iig。優(yōu)選的是，劑量選自100邱、150辟、200邱和250邱。優(yōu)選的是劑量是75辟至125邱，例如100辟。所提供的劑量是針對人的平均重量（即，70kg)而言。對于皮內注射，光敏化劑的劑量可以溶解于1 OOyl至lml 中，即，濃度可以為lμg/ml至50000μg/ml。在較小的動物中，濃度范圍可以不同并可以相應地調整，不過當局部施用時，對于不同動物幾乎不需要改變劑量。
[0166]抗原的使用濃度取決于所用的抗原。方便的是，可在體外使用濃度為0.001 -500y g/ml (例如，20iig/ml ~500iig/ml、20iig/ml ~300iig/ml、20iig/ml ~lOOug/ml、20iig/ml ~50ii g/ml、lOμg/ml~50iig/ml、5μg/ml~50iig/ml、lμg/ml~50iig/ml、0 ? Olμg/ml~50iig/ml或 0.001lig/ml~50μg/ml)的抗原。對于肽抗原，可使用更低濃度，例如0.001iig/ml~500iig/ ml，例如0 ? 00 lμg/ml ~lμg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50iig/ml或 100iig/ml。對于蛋白抗原，可使用更高濃度，例如〇.5μg/ml~500iig/ml。對于體內使用，蛋白抗原劑量可以為0.5yg~500ii g，例如l〇yg~l〇〇yg或l〇yg~200iig。對于肽抗原，可米用0? lyg~4000iig、例如0? lyg~2000 噸、0.1噸~1000噸或0.1辟~500辟，例如0.1邱~100邱的體內劑量。這些劑量適合于局部施用?？筛鶕?jù)所研究的試劑被所研究的細胞攝入的效率以及在細胞中所需要實現(xiàn)的最終濃度來確定適合的濃度。
[0167] 本文定義的TLR配體的濃度也取決于所要施用的具體分子，本領域技術人員將了解合適的濃度或劑量。合適的體外和體內濃度或劑量的實例如下表2所示。
[0168] 表2
[0169]
[0170] 因此，例如，可以體外方便地使用lμg/ml~1 OOμg/ml (例如20iig/ml~1 OOμg/ml或 20μg/ml~50μg/ml)的濃度?？梢允褂皿w內劑量為10yg~lOOOyg的咪唑并喹啉化合物，例如小鼠中為2〇yg~lOOyg，人中為l〇yg~10mg。對于局部施用，例如咪喹莫特在人體內局部施用，可使用2 ? 5mg~50mg的劑量，例如lmg/cm2~5mg/cm2，例如2 ? 5mg/cm2。對于雷西莫特，劑量可以為〇 ? lmg~50mg，例如lmg~5mg，例如lmg/cm2~5mg/cm2。相似的劑量適于嘎德莫特。對于皮內注射咪唑并喹啉化合物，可以使用更小的劑量，例如至少1 〇yg或50yg，例如可使用 10yg~lmg。對于CpG寡核苷酸和其他TLR配體，可使用相似的劑量。Poly(IC)可以以小鼠體內lyg~100yg的劑量和人體內lyg~10mg的劑量施用。
[0171] 在大多數(shù)情況下，光敏化劑、抗原分子和如本文所定義的TLR配體一起施用，但是這可變化。因此，對于各不同組分，設想了不同的施用時間或模式或部位(或與細胞接觸），并且本發(fā)明的范圍內涵蓋了這些方法。
[0172] 在一個實施方式中，將TLR配體，例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物、LPS或如本文所定義的P〇ly(IC)分子與抗原分開施用，例如，在不同的制劑中分開施用，例如乳膏或凝膠，或全身性施用，例如通過口服施用(例如使用雷西莫特時）。因此，在一個實施方式中，例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物等TLR配體可在施用抗原和/或光敏化劑前施用，例如24小時之前，例如通過局部預處理施用。在一些情況下，例如Poly (1C)或LPS等TLR配體在抗原之前、同時或之后施用。
[0173] TLR配體可與其他試劑分開施用，例如在照明前約2小時施用。在替代性實施方式中，所述試劑可以隨同抗原或與抗原在同一時間（即，同時地)施用。
[0174] 便利的是，細胞與光敏化劑和/或抗原分子和/或本文所定義的TLR配體之間的接觸15分鐘至24小時，例如30分鐘至4小時，優(yōu)選1.5至2.5小時。作為另選，時間的范圍可為約 1小時至約48小時，例如約2小時至約40小時，或約6小時至約36小時，例如從12小時至30小時，例如16小時至20小時，例如18小時或約18小時。
[0175] 在優(yōu)選的實施方式中，細胞首先與光敏化劑溫育。在一個實施方式中，施用光敏化劑與抗原分子和/或TLR配體之間的時間以小時計。例如，光敏化劑可在照明前16至20小時 (例如18小時)應用，抗原分子和/或TLR配體可在照明前1至3小時（例如2小時）應用。因此，施用光敏化劑與抗原分子和/或所述TLR配體之間的時間可以為15至23小時。
[0176] 因此，細胞在與光敏化劑溫育后，與抗原和/或如本文所述的TLR配體溫育。方便的是，細胞在接觸光敏劑/抗原后并在照射之前，可以放置在無光敏劑/抗原的培養(yǎng)基中，例如 30分鐘至4小時，例如從1.5至2.5小時，這取決于與光敏化劑和抗原分子和TLR配體的溫育時機。
[0177] 使各種試劑與靶細胞接觸的合適體內方法和溫育時間取決于諸如施用模式和所用試劑類型等因素。例如，如果所述試劑注入到需要處理/照射的腫瘤、組織或器官中，則注射點附近的細胞會接觸到所述試劑，因此傾向于比遠離注入點的細胞速度更快地攝入所述試劑，遠離注入點的細胞可能在更晚的時間點以更低的濃度接觸所述試劑。便利的是，可以使用6至24小時的時間。
[0178] 另外，通過靜脈注射或口服施用的制劑可能需要一些時間才能到達靶細胞并因此可能需要更長的施用后時間（例如幾天），以便使足夠或最佳量的試劑累積在靶細胞或組織中。個體細胞所需要的體內施用時間可能隨這些參數(shù)以及其他參數(shù)而改變。
[0179]然而，雖然體內情況比體外更復雜，但本發(fā)明的基本概念仍然是相同的，即，分子與靶細胞接觸的時間必須使得在照射發(fā)生前適量的光敏化劑已被靶細胞攝入以及下述的任一項：（i)在照射之前或照射期間，抗原分子(和可選的TLR配體)或者已被攝入到細胞中，或者將在與靶細胞充分接觸后被攝入到細胞中，例如進入與光敏化劑相同或不同的細胞內區(qū)室，或（ii)在照射之后，抗原分子（以及可選的TLR配體)與細胞接觸一段足以使其被攝入到細胞中的時間。
[0180] 對于本文所述試劑的體內施用，可采用本領域常用或標準的任何施用模式，例如對內部和外部身體表面進行的注射、輸注、局部施用、經皮施用等。對于體內使用，本發(fā)明可以用于含有細胞的任何組織（需要內化的包含光敏化劑的化合物或分子被定位至所述細胞），包括體液位置，以及實體組織。可以治療所有組織，只要光敏化劑被靶細胞攝入，并且可以正確地遞送光即可。優(yōu)選的施用方式是皮內、皮下、局部或腫瘤內施用或注射。優(yōu)選的施用通過皮內注射進行。
[0181] 為了實現(xiàn)所期望的結果，例如抗原呈遞、產生免疫應答或疫苗接種，所述方法或其一部分可重復進行，例如可進行"重新疫苗接種"。因此，本發(fā)明整體上可在適當時間間隔后進行多次(例如2、3或更多次），或該方法的部分可以重復，例如，進一步施用如本文所定義的TLR配體或附加的照射步驟。例如，該方法或方法的部分可以在第一次實施之后的數(shù)天或數(shù)周之內再次進行，例如5到60天（例如7、14、15、21、22、42或51天），例如7~20天，優(yōu)選14 天，或例如1周至5周（例如，1、2、3或4周）。所述方法的所有或部分可以在適當?shù)臅r間間隔重復多次，所述時間間隔為例如每兩周或14天。在優(yōu)選的實施方式中，所述方法重復至少一次。在另一實施方式中，所述方法重復兩次。
[0182] 在一個實施方式中，在第2次或隨后次進行所述方法時，抗原分子與光敏化劑和照明聯(lián)合施用，即，在第2次或隨后次進行所述方法時不施用TLR配體。
[0183] 在替代性實施方式中，可以在進行本發(fā)明方法之前進行本發(fā)明方法的部分。例如，可以在進行本發(fā)明方法之前，將該方法在不存在TLR配體的情況下進行一次或多次，例如兩次。作為另選，該方法可以在進行本發(fā)明方法之前在不存在光敏化劑和照明的情況下進行一次或多次，例如兩次?？梢栽谶M行本發(fā)明的方法之前數(shù)天(例如7或14天)或數(shù)周(例如1、3 或4周）進行本發(fā)明方法的一部分?？梢栽谶M行本發(fā)明的方法之前，以上述時間間隔將該方法的一部分重復一次或多次。因此，在優(yōu)選的方面，抗原分子(例如向受試者)施用2次以上 (例如，以上述的時間間隔），其中，至少所述抗原分子的施用根據(jù)本發(fā)明的方法進行。
[0184] "照射"以活化光敏化劑是指如下文中所述直接或間接地施加光。因此，受試者或細胞可以例如直接(例如，對體外的單一細胞)或間接地用光源來照射，所述間接例如是在體內，其時細胞處在皮膚表面之下或者處于不是其全部均可被直接照射(即，無其他細胞遮蔽）的一層細胞的形態(tài)。可以在施用光敏化劑、抗原分子和文本限定的TLR配體之后約18至 24小時進行對細胞或受試者的照射。
[0185] 活化光敏化劑的照射步驟可根據(jù)本領域公知的技術和程序進行。所用的光的波長和強度根據(jù)所使用的光敏化劑選擇。適當?shù)娜斯す庠词潜绢I域中公知的，例如，使用藍色 (400nm~475nm)或紅色（620mn~750nm)波長的光。對于TPCS 2a，例如可以使用的波長為 400nm至500nm、更優(yōu)選400nm至450nm，例如430nm~440nm，進而更優(yōu)選約435nm或435nm。在適當?shù)那闆r下，例如卟啉或二氫卟吩等光敏化劑可被綠光激活，例如KillerRed(Evrogen, Moscow,俄羅斯)光敏化劑可被綠光激活。
[0186] 合適的光源是本領域已知的，例如PCI Biotech AS的LuniiSourcc?燈。作為另選，可以使用基于LED的照明裝置，其具有高達60mW的可調節(jié)輸出功率和430nm~435nm的發(fā)射光譜。對于紅光，合適的照明源是PCI Biotech AS 652nm激光系統(tǒng)SN576003二極管激光器，不過也可以使用任何合適的紅色光源。
[0187] 本發(fā)明方法中細胞暴露于光的時間可變。分子向胞漿中內化的效率隨曝光增加而提高直至達到最大值，超過該最大值后細胞損傷且因此細胞死亡會增加。
[0188] 照射步驟的優(yōu)選時長取決于下述因素，例如靶、光敏劑、積聚在靶細胞或組織中的光敏劑的量，以及光敏劑的吸收光譜與光源的發(fā)射光譜之間的重疊。通常，照射步驟的時長為數(shù)秒至數(shù)分鐘或者高達數(shù)小時(甚至達12小時）的量級，例如，優(yōu)選至多60分鐘，例如0.25 分鐘或1分鐘~30分鐘，例如0.5分鐘~3分鐘或1分鐘~5分鐘或1分鐘~10分鐘，例如3分鐘 ~7分鐘，并優(yōu)選約3分鐘，例如2.5分鐘~3.5分鐘。也可以采用較短的照射時間，例如1秒~ 60秒，例如10秒~50秒、20秒~40秒或25秒~35秒。
[0189] 適當?shù)墓鈩┝靠梢杂杀绢I域技術人員選擇，并且將同樣取決于所使用的光敏劑和在靶細胞或組織中積聚的光敏劑的量。當使用在可見光譜中具有較高消光系數(shù)(例如，在紅光區(qū)域，或如果使用藍光則在藍光區(qū)域，取決于所用的光敏化劑）的光敏劑時，光劑量通常較低。例如，當采用可調輸出功率高達60mW并且發(fā)射光譜為430nm~435nm的基于LED的照明裝置時，可以使用通量為〇 ? 〇5mW/cm2~20mW/cm2、例如2 ? 0mW/cm2的0 ? 24J/cm2~7 ? 2J/cm2的光劑量。作為另選，例如如果采用LumiSource?燈，適合的是通量為0. lmW/cm2~20mW/cm2( Lumis.ource€>:提供13mW/cm 2)的0 . lj/cm2~6J/cm2的光劑量。對于紅光，可以使用通量為 0 ? lmW/cm2~5mW/cm2、例如0 ? 81mW/cm2 的0 ? 03J/cm2~1 J/cm2、例如0 ? 3J/cm2 的光劑量。
[0190] 此外，如果要保持細胞活力，則需避免生成過高水平的毒性物種，并且可以因此而調節(jié)相關參數(shù)。
[0191] 本發(fā)明方法可能不可避免地由于光化學治療而導致一些細胞損傷，即，通過光敏化劑活化時產生的有毒物質所導致的光動力學治療效應。根據(jù)所提出的應用，這種細胞死亡可能不嚴重，并可能實際上對某些應用是有利的（例如癌癥治療）。然而，在大部分實施方式中，避免了細胞死亡，從而能由呈遞細胞產生免疫應答。本發(fā)明的方法可修改，從而通過選擇相對于光敏化劑濃度的光劑量來調節(jié)存活細胞的分數(shù)或比例。同樣，這類技術是本領域公知的。
[0192] 優(yōu)選的是，基本上所有或大部分（例如，至少75 %，更優(yōu)選至少80 %、85 %、90 %或 95%的細胞)的細胞沒有被殺死。PCI治療后的體外細胞活力可以通過本領域已知的標準技術如MTS試驗測定。一種或多種細胞類型的體內細胞死亡可以在施用點1厘米范圍（或在一定的組織深度）內進行評估，例如通過顯微鏡進行評估。由于細胞死亡可能不會立即發(fā)生，所述細胞死亡％是指在照射數(shù)小時（例如照射后至多4小時）內保持活力的細胞百分比，但優(yōu)選是指照射后4小時以上的活細胞％。
[0193] 所述方法可以在體內、體外或離體進行。優(yōu)選的是，所述方法在體外或離體產生用于體內施用或體內方法的細胞。因此，在優(yōu)選的特征中，所述方法可用于在受試者中產生免疫應答。
[0194] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者中產生免疫應答的方法，所述方法包括對所述受試者施用抗原分子、光敏化劑和上文限定的TLR配體，并對受試者照射有效活化所述光敏化劑的波長的光，其中，產生免疫應答。
[0195] 可以產生的"免疫應答"可以是體液和細胞介導的免疫，例如刺激抗體的產生，或刺激細胞毒性細胞或殺傷細胞，這些細胞可識別并破壞(或是消除)在其表面上表達"外來" 抗原的細胞。術語"刺激免疫應答"因而包括所有種類的免疫應答和刺激它們的機制，并且涵蓋了對CTL的刺激(其構成本發(fā)明一個優(yōu)選方面）。優(yōu)選的是，所刺激的免疫應答是細胞毒性CD8T細胞。免疫應答的程度可通過免疫應答的標志物來評價，例如分泌的分子如IL-2或 IFNy或抗原特異性T細胞的產生(例如，如實施例中所述的評估）。
[0196] 對細胞毒性細胞或抗體產生細胞的刺激需要將抗原呈遞至將以特定方式由抗原呈遞細胞所刺激的細胞，所述方式例如為MHC I類呈遞(例如CD8+細胞毒性T細胞的激活需要MHC-I抗原呈遞）。優(yōu)選的是，免疫應答通過MHC-I呈遞刺激。
[0197] 優(yōu)選的是，免疫應答用于治療或預防疾病、病癥或感染，例如癌癥。
[0198] 在一個實施方式中，癌癥是黑色素瘤。黑色素瘤是黑色素細胞的惡性腫瘤，黑色素細胞是負責產生黑色素(造成膚色的暗色素）的細胞。這些細胞主要出現(xiàn)在皮膚中，但也存在于身體的其他部位，包括腸和眼睛中。黑色素瘤可以在包含黑色素細胞的身體任何部位產生。
[0199] 本文所用的"黑色素瘤"包括所有類型的黑色素瘤，例如包括淺表擴散性黑色素瘤、結節(jié)性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、纖維組織增生性黑色素瘤、肢端雀斑樣痣黑色素瘤和無黑色素的黑色素瘤、息肉樣黑色素瘤、具有小痣樣細胞的黑色素瘤和具有斯皮茨痣特征的黑色素瘤。
[0200] 雖然大部分黑色素瘤在皮膚上發(fā)生(皮膚惡性黑色素瘤），但黑色素瘤也可在身體其他地方發(fā)生，例如在內部器官中，例如在粘膜中。透明細胞肉瘤是軟組織的惡性黑色素瘤。黑色素瘤也可以發(fā)生在眼睛（葡萄膜黑色素瘤）、外陰、陰道或直腸。這些黑色素瘤也包括在本發(fā)明的范圍內。優(yōu)選的是，待治療的黑色素瘤是皮膚黑色素瘤。黑色素瘤也外延至轉移性黑色素瘤，即，源自原發(fā)黑色素瘤但已轉移至不同位置從而產生繼發(fā)性腫瘤的細胞。如本文所述的黑色素瘤的治療或預防外延至原發(fā)黑色素瘤和/或從原發(fā)黑色素瘤派生的繼發(fā) 性腫瘤的治療。因此，本發(fā)明還涉及治療轉移性黑色素瘤的應用。
[0201] 在替代性實施方式中，癌癥與乳頭瘤病毒相關或由乳頭瘤病毒引起/由乳頭瘤病毒誘導，特別是人乳頭瘤病毒(HPV)。如上文所討論，乳頭瘤病毒基因組是分為早期區(qū)(E)和晚期區(qū)（L)，早期區(qū)（E)編碼被宿主細胞初始感染后立即表達的6個化1』2444546和￡7) 開放閱讀框(ORF)，晚期區(qū)（L)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。所有病毒的ORF編碼在一條DNA鏈上?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的HPV抗原可與由HPV感染導致的癌癥相關，可以是如本文所討論的一種或多種已知的抗原肽或T-細胞表位。如上文所討論，有數(shù)種類型的HPV，而本發(fā)明所述的與HPV相關的癌癥可以與任何類型的HPV相關或由任何類型的HPV所導致，例如HPV-16和/或HPV-18,或者HPV-31或HPV-45。根據(jù)本發(fā)明使用的抗原可源自E1、E2、E4、E5、 E6或E7蛋白中的任一種或L1和L2蛋白中的任一種。因此，所述抗原分子可源自HPV-16和 HPV-18的E2、E6和E7中的一種或多種。在優(yōu)選的實施方式中，抗原分子包含HPV-16的E7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗體字表示）。因此，HPV抗原可以是35氨基酸肽。作為另選，抗原分子可以僅為CD8表位RAHYNIVTF，即，更短的肽。
[0202]在替代性實施方式中，所述疾病、病癥或感染是病毒感染，優(yōu)選乳頭瘤病毒感染，特別是人乳頭瘤病毒(HPV)感染。
[0203]優(yōu)選的是所述方法用于疫苗接種。如本文中所述，"疫苗接種(vaccination)"是使用抗原(或包含抗原的分子）引起免疫應答，該免疫應答預防或治療疾病、病癥或感染的發(fā) 展(或進一步發(fā)展），其中，所述疾病、病癥或感染與抗原的異常表達或存在有關。優(yōu)選的是，所述疾病是癌癥，例如黑色素瘤或與乳頭瘤病毒如HPV相關的癌癥。在一個實施方式中，疫苗接種具有治療性，例如用于治療本文中所討論的癌癥。在替代性實施方式中，疫苗接種具有預防性，例如用于預防癌癥或在對更早期的癌癥以治療疫苗接種進行治療后進一步降低癌癥發(fā)展。在另一實施方式中，當要產生針對感染(例如病毒感染，例如乳頭瘤病毒感染)的免疫應答時，疫苗接種具有預防性質。
[0204] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述方法例如疫苗接種的受試者是哺乳動物，優(yōu)選貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最優(yōu)選的受試者是人。
[0205] 優(yōu)選的是本文描述的方法實現(xiàn)協(xié)同效應(synergy)，即，與通過(i)在不存在的TLR 配體的情況下用抗原分子進行所述方法和（ii)在不存在光敏化劑和照射步驟的情況下用抗原分子進行所述方法而觀察到的加和增強相比，細胞表面呈遞或免疫應答產生的程度增強，即，觀察到了所述方法之間的協(xié)同效應。細胞表面呈遞或免疫應答產生的水平可以通過適當方式評估，例如抗原特異性CD8+細胞的數(shù)目或免疫應答激活的標記物（例如IFN y或 IL-2)的水平。
[0206]本文所用的"協(xié)同效應"是指相對于簡單加和效應的定量提高。
[0207] 本發(fā)明方法中所用的各種試劑可分別、依次或同時施用給受試者。
[0208] 上述與本發(fā)明在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分的方法相關而論述的方面和特征在適當時也適用于以上產生免疫應答的方法。
[0209] 本發(fā)明還提供了將抗原分子引入細胞的胞漿中的方法，所述方法包括使細胞接觸需要引入的抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體，并以有效活化所述光敏化劑的波長的光照射細胞。一旦被激活，所述細胞的包含所述化合物的細胞內區(qū)室將這些區(qū)室中所含的分子釋放到胞漿中。
[0210] 本發(fā)明上述方法可在體外或體內使用，例如用于原位治療或用于離體治療，然后將經治療的細胞施用到身體內。
[0211] 本發(fā)明還提供了在表面上表達抗原分子或其一部分的細胞，或細胞群，所述細胞通過本文限定的任何方法獲得或可通過其獲得。還提供如下文所述用于預防或治療的細胞或細胞群。
[0212] 細胞群可在藥物組合物中提供，所述組合物還包括一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。
[0213] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體以及一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。
[0214] 這些組合物(和本發(fā)明的產品）可以以任何方便的方式根據(jù)藥物領域中已知的技術和程序進行配制，例如利用一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑進行配制。 "藥學可接受的"在本文中是指與組合物(或產品）的其它成分相容并且接受者生理上可接受的成分。組合物的性質和載劑或賦形劑材料、劑量等可以在常規(guī)的方式中根據(jù)選擇和期望的施用途徑、治療目的等選擇。劑量同樣可以在常規(guī)的方式中確定，并可取決于分子(或組合物或產品的組分）的性質、治療目的、患者的年齡、施用模式等。對于光敏化劑而言，也應考慮在照射時破壞膜的效能/能力。
[0215] 細胞、例如抗原呈遞細胞可以在體外制備。在治療方法中，這些細胞可施用于體內或離體組織，從而出于例如預防或治療的目的使這些細胞刺激免疫應答。
[0216] 因此，本發(fā)明還提供了如本文所定義的細胞群(或包含細胞群的組合物），或抗原分子、光敏化劑、以及本文定義的TLR配體，其用于預防或治療或用于刺激免疫應答，例如用于疫苗接種目的，例如在受試者體內刺激CTL，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，特別是用于治療或預防癌癥，如黑色素瘤或與乳頭瘤病毒（如HPV)相關聯(lián)的癌癥。作為另一種方式限定而言，本發(fā)明提供（i)細胞群、（ii)本文所定義的組合物、或（iii) 抗原分子和/或光敏化劑和/或TLR配體在制備藥物中的應用，所述藥物用于刺激受試者免疫應答(例如，刺激CTL)，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥，如黑色素瘤或乳頭瘤病毒(如HPV)相關的癌癥，其中，優(yōu) 選的是所述免疫應答由本文所定義的方法刺激。
[0217] 所述刺激、治療或預防優(yōu)選包括對所述受試者施用所述藥物。
[0218] 抗原分子、光敏化劑和TLR配體可組合并存在于所述組合物中。換言之，本發(fā)明提供了抗原分子和/或光敏化劑和/或本文定義的TLR配體在藥物制備中的應用，所述用于刺激免疫應答(例如刺激受試者的CTL)，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，特別用于疫苗接種目的，其中，所述藥物包括在細胞表面上表達抗原分子或其一部分的細胞群(所述細胞可通過本文限定的方法獲得），用于施用給所述受試者。優(yōu)選的是，細胞群通過所述方法獲得。細胞群用于對受試者施用。
[0219] 在替代性實施方式方式中，本發(fā)明提供了抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體，用于在細胞的表面上表達所述抗原分子或其一部分，以刺激受試者的免疫應答(例如刺激CTL)，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，其中，所述應用包括本文限定的方法，優(yōu)選用于制備細胞群，例如樹突細胞。這些細胞隨后可施用于受試者。
[0220] 本發(fā)明還提供了包括抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體作為聯(lián)合制劑的產品，其用于在本文所述的方法中同時、分別或依次使用以刺激受試者的免疫應答(或用于在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分，或用于將抗原分子內化到細胞的胞漿中），優(yōu)選用于治療或預防受試者的疾病、病癥或感染。
[0221] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒用于在本文所述的方法中刺激受試者免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防受試者的疾病、病癥或感染，例如用于疫苗接種或免疫、或用于在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分，或用于將抗原分子內化到細胞的胞漿中，所述試劑盒包括
[0222] 第一容器，其包含本文定義的光敏化劑；
[0223] 第二容器，其包含本文定義的所述抗原分子;和 [0224]第三容器，其包含本文定義的TLR配體。
[0225] 本發(fā)明的產品和試劑盒是用于實現(xiàn)本文限定的細胞表面呈遞(或治療方法）。
[0226] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在受試者體內產生免疫應答(例如刺激CTL)、優(yōu) 選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染的方法，所述方法包括根據(jù)本文所述方法制備細胞群，并隨后將所述細胞施用于所述受試者。
[0227] 當經處理的細胞體內施用時，由所要求保護的發(fā)明實現(xiàn)的抗原呈遞可有利地導致對免疫應答的刺激。優(yōu)選的是，產生了免疫應答，該免疫應答賦予了針對后續(xù)由包括或包含所述抗原分子或其一部分的實體進行的激發(fā)(challenge)的保護，因此本發(fā)明可特別作為疫苗接種方法使用。
[0228] 所述疾病、病癥或感染是可通過產生免疫應答進行治療或預防的任何疾病、病癥或感染，例如通過消除異?；蛲鈦砑毎麃磉M行治療或預防，所述異?；蛲鈦砑毎鶕?jù)使其與正常細胞有所區(qū)別(并被消除）的抗原(或其表達水平)而被識別。對所要使用的抗原分子的選擇決定所要治療的疾病、病癥或感染?；谏鲜龅目乖肿?，本文所述的方法、應用和試劑盒等可用于治療或預防例如感染(例如上文提及的病毒或細菌感染）、癌癥或多發(fā)性硬化癥。對所述疾病、病癥或感染的預防可成為疫苗接種。
[0229] 本文限定的"治療"是指使所要治療的疾病、病癥或感染的一種或多種癥狀與治療之前相比有所減輕、緩解或消除?！A防〃是指延遲或阻止疾病、病癥或感染的癥狀的發(fā)作。預防可以是絕對的（因此不發(fā)?。?，或可僅對一些個體或在有限時間內有效。
[0230]對于體內施用細胞，可以使用本領域常用的或標準的任何細胞群施用模式，例如通過適當途徑注射或輸注。方便的是，細胞通過淋巴管內注射來施用。優(yōu)選的是，每kg受試者體重施用1 X 104至1 X 108個細胞（例如人體中為1.4 X 104/kg至2.8 X 106/kg)。因此，例如，在人體內，可以以〇. 1 X 107至20 X 107細胞的劑量（即，每劑)施用，例如作為疫苗接種劑量。必要時該劑量可在晚些時候重復。
[0231] 現(xiàn)在將參考附圖在以下非限制性實施例中更詳細描述本發(fā)明：
[0232] 圖1顯示了以抗原卵清蛋白（0VA)和標示出的情況下的TPCS2a(PCI)和CpG或R848的混合物對小鼠進行體內疫苗接種后血(A)和脾臟(B和C)中的抗原特異性T細胞％。圖(A)顯示了疫苗接種7天后血中的抗原特異性CD8+T細胞％，各圓圈表示一只動物。圖（B)顯示疫苗接種14天后脾臟中的抗原特異性CD8+T細胞％，各圓圈表示一只動物。圖（C)是表示與(B)所示數(shù)據(jù)相同的柱狀圖。
[0233] 圖2顯示的是來自按圖1圖例所示進行接種的小鼠的CD8+脾細胞在以SIINFEKL抗原肽進行體外刺激后的IFN- y產生程度。通過針對IFN- y的細胞內染色并通過流式細胞術進行細胞分析來完成分析。圖B是表示圖A所示數(shù)據(jù)的柱狀圖。
[0234] _顯示的是來自按圖1圖例所示進行接種的小鼠的總脾細胞在以SIINFEKL抗原肽進行體外刺激后的IFN-y和IL-2產生量。分析通過ELISA完成。圖A和C顯示進行和不進行 SIINFEKL再刺激的結果，結果顯示為不經過根據(jù)相應標準曲線進行校正的來自ELISA測試的直接讀數(shù)。圖B和D顯示SIINFEKL刺激的樣品的相同數(shù)據(jù)，其中IFN- y和IL-2的濃度根據(jù) 相應標準曲線進行計算。
[0235] 里i顯示方案1:合成化合物5的合成路線。試劑和條件：（a)丙酸，回流，1小時 (20%);(13)恥腸2(1.8當量），丁卩厶，室溫，3分鐘（67%);(。）511(：12.2112〇，濃11(：1，60°(：，1小時 (88%) ;(d)溴乙酰溴，Et3N，CH2Cl2,室溫，1 小時（64%); (e)哌嗪，CH2C12,室溫，1 小時 (94%)〇
[0236] 方案2:N-改性殼聚糖衍生物(TPP-CS-TMA&TPP-CS-MP)的合成。此處A-表示第1批化合物，B-表示第2批化合物。試劑和條件：（a )MeS03H/H20，10 °C~室溫，1小時，（90 % ); (b) TBDMSC1，咪唑，DMS0，室溫，24小時（96 % ); (c)溴乙酰溴，Et3N，CH2C12，-20°C，1 小時（92 % ); (d) 化合物5,即TPP-NH-Pip(0.1 或0.25當量）4七北〇1(：13，室溫，2小時（92%~90%);(6) NMe 3或 1-甲基哌嗪，CHC13，室溫，24小時；（f)TBAF，NMP，55°C，24小時或濃HCl/MeOH，室溫，24 小時。
[0237] 方案3-化合物1、3、20和21的合成方案。反應和條件：（a)丙酸，回流，1小時， (20%) ; (b)NaN02(l .8當量），TFA，室溫，3分鐘；（c)SnCl2 ? 2H20,濃HC1，60°C，1小時， (54 % ); (cU)對甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小時；（d2)鄰氯苯醌，CH 2C12，室溫，（80 % ); (e) 氯乙酰氯，Et3N，CH2C12，室溫，2小時，原位；（f)哌嗪，CH 2C12，室溫，12小時，（61 % )。化合物20和21的所有衍生物將含有TPCaj^PCa2異構體。但是僅TPCai結構顯示在方案和結構圖中。
[0238] 方案4-化合物22~28的合成方案。反應和條件：（a)乙酰氯，MeOH，回流，24小時， (87 % ); (b)BF3 ? Et20，CHC13，室溫，對氯苯醌，48小時，（14 % ); (c) 2N K0H(在MeOH中），THF: 吡啶（10:1)，回流，24小時（71 % ); (cU)對甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小時；（d2)鄰氯苯醌，CH2CI2:MeOH(75:25)，室溫，（70 % ); (e)EDCI ? HC1，H0BT，Et3N，N-Boc-哌嗪5，DMF，室溫，24小時（54% ); (f )TFA，CH2C12，室溫，1小時（89% )?；衔?6~28的所有衍生物將含有 TPCcd^PCc2異構體。但是僅TPCcd#構顯示在方案和結構圖中。
[0239] 方案 5A和 5B:試劑和條件（6A):(a)化合物 21，即，TPC-NH-Pip(0.1 當量）、Et3N、 CHC13，室溫，2h(78 % ); (b)NMe3或1-甲基哌嗪，CHC13，室溫，24h。試劑和條件(6b): a)化合物 28, SP，TPC-C0-Pip(0.1 當量），Et3N，NMP，75°C，12h(89% ); (b)NMe3或 1-甲基哌嗪，CHC13,室溫，24h。
[0240] 圖5顯示的是佐劑poly(IC)和CpG的效果。以 10ug 0VA，以 100yg 0VA，以 10yg OVA 和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸，以 10yg 0VA、50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg Poly(IC)，以lOyg 0VA、50yg Poly(IC)和 150iig TPCS2Jt小鼠進行免疫，或不進行處理。對接受TPC&j^小鼠進行照射。小鼠在第7天取血，并通過流式細胞術分析0VA特異性CD8T細胞的頻率。在第14天獲得脾細胞，并以 SIINFEKL肽再刺激，通過干擾素-y ELISA進行分析。（A)顯示了實驗組第7天血中的平均值 (總CD8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％)(每組5只動物，誤差條:平均值的標準誤差）。0) 顯示以SIINFEKL肽再刺激脾細胞第14天后由干擾素-y (IFN-y )ELISA獲得的結果。
[0241] _顯示以OVA和po 1 y (IC)第1次和第2次免疫小鼠后的（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)平均值。
[0242] &顯示在第2次(第22天)免疫后實驗中各動物在第2次免疫后的值(總⑶8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％ )(誤差條是標準誤差）。
[0243] 圖8顯示第2次免疫后TRP-2五聚體染色實驗組的平均值（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)。
[0244] _顯示了在第1和第2次免疫后利用紅光照射以激活光敏化劑時實驗組的平均值 (總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％ )。
[0245] 圖10顯示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后實驗組的平均值（總CD8+細胞中抗原特異性CD44+細胞的％ )(誤差條為平均值的標準誤差）。
[0246]圖11顯示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫實驗組的平均值(總CD8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％ )。
[0247] 圖12顯示了圖中所示以SIINFEKL肽再刺激或不進行再刺激的脾細胞中平均ELISA 值。
[0248] 圖13顯示了在第1和第2次免疫后實驗組(每組5只動物，誤差條是標準偏差）的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％ )。
[0249] 圖14顯示三次免疫的每一次之后的實驗組的總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％。
[0250]圖15顯示3次免疫之后實驗組的總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％。
[0251]圖16顯示第1和第2次免疫后的實驗組(每組5只動物，誤差條是標準偏差）的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％ )。
[0252]圖17顯示來自三個實驗組中的典型動物在第三次免疫后的流式細胞術點狀圖。
[0253] 圖18顯示了3次免疫中每一次之后的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)。
[0254] 圖19顯示了在兩次免疫后的實驗組的總CD8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％。
[0255] 圖20顯示了在兩次免疫后的實驗組的總CD8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％ +/-SEM。實施例
[0256] 材料和方法 [0257] 小鼠
[0258] C57BL/6小鼠購自Har 1 an(Horst，荷蘭）。識別卵清蛋白（0VA)的MHC I類限制表位 0VA257-264的T-細胞受體轉基因0T-I小鼠在蘇黎世大學設施中繁殖(原購自Taconic Europe (Ry，丹麥））。所有小鼠保持在專門無病原體(SPF)條件下，所進行的程序經瑞士獸醫(yī)部門批準。在0T-1小鼠中，對T-細胞受體基因進行工程化，從而使這些小鼠中的所有⑶8+T細胞(稱為0T-1細胞)特異性識別卵清蛋白（0VA)抗原的特定肽表位(SIINFEKL)。
[0259] 免疫程序
[0260] 在第0天，對雌性C57BL/6小鼠在尾靜脈靜脈內注射來自Rag2/0T-1小鼠的1.5 X 1 〇6個脾細胞。這樣，經過接種的小鼠具有如下的CD8T細胞"背景"：當（且僅當）其適當以MHC I類呈遞在抗原呈遞細胞時，其能夠響應于來自0VA的SIINFEKL-表位。因此，0T-1細胞的轉移"擴增"經接種的小鼠的檢測系統(tǒng)，使得通過測量抗原特異性CD8+T細胞以及IFN-y和IL-2產生，可以容易地測定體內疫苗接種的效果。
[0261] 4小時后，對動物在腹部皮下接種（包含以下規(guī)定成分的2X50iil溶液）。6組動物 (每組4只)接種的總劑量為：
[0262] 第1組：25ug TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0263] 第2組：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+60yg CpG。
[0264] 第3組：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0265] 第4組：10yg卵清蛋白。
[0266] 第5組：lOyg卵清蛋白+60lig CpG。
[0267] 第6組：10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0268] 所用的CpG寡核苷酸是B型20聚體0DN 1826(由Microsynth(Balgach,瑞士）合成），序列為(5Z-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3')，具有全硫代磷酸酯(PS修飾)骨架。
[0269] 在第1天，對第1、2和3組的動物進行麻醉，并利用LumiSource燈(PCI Biotech AS) 以藍光照射6分鐘。在注射抗原溶液后約18小時對動物進行照射，照射的通量率為約13mW/ cm2。第7天，從尾靜脈對小鼠采血，以SIINFEKL五聚體(Pro Immune)以及⑶8和⑶44抗體對血細胞染色，以便進行流式細胞術分析(見以下規(guī)程）。在第14天，將小鼠安樂死，并收集脾臟。對一份等分試樣的脾細胞以SIINFEKL肽(EMC Microcollections，Tuebingen，德國）進行再刺激，對細胞內IFN-y表達進行染色，通過流式細胞術分析(見下文)進行分析。將另一等分式樣的脾細胞重懸浮在細胞培養(yǎng)基中，在不進行再刺激的情況下在該培養(yǎng)基中保持過夜 (純粹出于實踐原因），如上述以SIINFEKL-五聚體染色，通過流式細胞術（見下文）進行分析。
[0270] 脾細胞的SIINFEKL-五聚體
[0271] 對重懸在細胞培養(yǎng)基中并在不進行再刺激的情況下在該培養(yǎng)基中保持過夜(純粹出于實踐原因）的細胞進行脾細胞的SIINFEKL-五聚體染色和流式細胞術。
[0272] SIINFEKL-五聚體染色和流式細胞術
[0273] 收集5~10滴尾部全血，并加入0.5ml的紅細胞裂解液(Sigma)。在5~6分鐘后，將細胞旋轉沉淀，以〇. 5ml PBS洗滌兩次。細胞沉淀重懸浮在FACS緩沖液(具有0.01 %疊氮化鈉的2%FCS/roS)中，轉移到U形96孔板中，并與FcR封閉抗體（l.Oyl Pharmingen的Anti-CD16/CD32)在冰上溫育10分鐘（lyl+49yl FACS緩沖液）。不經過洗滌，加入SIINFEKL-五聚體-PE(ProImmune; 5ul/樣品），混合并在37°C溫育15分鐘。不經過洗滌，加入熒光標記的⑶8 或⑶44,達到1:100的終濃度，并在冰上溫育25至45分鐘。細胞在100yl FACS緩沖液中洗滌，并懸浮在l〇〇yl FACS緩沖液中。以FACSCanto對細胞進行分析。
[0274] 脾細胞離體再刺激
[0275] 通過以下方式分離并制備用于細胞內染色的脾細胞:將脾壓碎，通過在裂解緩沖液(Sigma)中攪拌1至2分鐘在2%FCS/roS中分離細胞，并在2%FCS/roS中洗滌。在24孔板的每個孔中加入完全培養(yǎng)基中的lml細胞懸浮液(500，000細胞/ml )，并在每個孔中加入5yg/ ml SIINFEKL，然后在37°C溫育過夜。各孔中加入布雷費德菌素A(lμg/ml~2μg/ml)，并在37 °C溫育4小時。細胞轉移至U形96孔板，在2 % FCS/roS中洗滌，并重懸浮在50yl具有FcR封閉抗體(Pharmingen的l.Oyl抗-CD16/CD32)的FACS緩沖液中，在冰上溫育10分鐘。不經過洗滌，細胞與表面抗體⑶8或⑶44冰上溫育20至45分鐘（暗處），以FACS緩沖液洗滌，并通過重懸在冰上的l〇〇yl多聚甲醛(PFA) (PBS中1 % )中固定10-20分鐘。細胞以FACS緩沖液洗滌，重懸浮在100yl NP40(PBS中1 % )中，并冰上溫育3分鐘。在FACS緩沖液中洗滌后，加入熒光標記的干擾素y抗體，并避光在冰上溫育35分鐘。在FACS緩沖液中洗滌和懸浮后，利用Flowjo 8.5.2軟件(Tree Star, Inc.，Ashland,OR)通過FACSCanto對細胞進行分析。
[0276] 流式細胞術
[0277] 通過流式細胞術(BD Biosciences的FACSCanto,San Jose,美國）確定0VA特異性T 細胞的頻率。在流式細胞術運行之前，利用以各抗體分別染色的珠進行補償。在抗體染色之前，利用紅細胞裂解液（Sigma)將血紅細胞裂解。對各樣品記錄10 000個⑶8+事件，利用 Tree Star，Inc.(Ashland，0R)的Flowjo 8 ? 5 ? 2軟件（http : //www ? flow jo ? com/)計算 SIINFEKL-五聚體陽性細胞的百分比。
[0278] ELISA
[0279] 利用Ready-set Go !試劑盒（eBioscience)根據(jù)制造商手冊對相關分子進行 ELISA。
[0280]實施例1 :TLR配體對OVA體內疫苗接種的影響
[0281] 通過上述免疫規(guī)程對小鼠體內接種。7天后分離血，14天后分離脾臟。用血分析抗原特異性CD8+T細胞，對脾細胞直接分析抗原特異性CD8+T-細胞，或在體外再刺激后分析 IFN-y或IL-2的產生。
[0282] 血和脾臟中抗原特異性T細胞的水平
[0283] 通過流式細胞術，利用特異性結合抗原特異性T-細胞的熒光標記的抗原特異性 "五聚體"測定抗原特異性T細胞的水平。確定了動物體內總CD8+T細胞中的抗原特異性CD8+ T細胞％ (見免疫規(guī)程中描述的染色和流式細胞術分析以及SIINFEKL染色的具體內容）。
[0284] 將內源T細胞作為效果的抗原特異性的內部對照，這是因為對T細胞的一般性刺激還將影響內源T細胞，而不引起抗原特異性細胞％的增加。通常，在疫苗接種之前和在疫苗接種之后的時間點測定0T-1細胞％。將僅采用抗原的效果（"常規(guī)疫苗接種"）與抗原+PCI的效果相比較。
[0285] 以抗原離體刺激后脾細胞中IFN- y產生的水平(流式細胞術）
[0286] 對在疫苗接種的第14天移除的脾臟進行脾細胞分離并以SIINFEKL抗原肽再刺激，并對IFN-y產生進行細胞內染色，以便通過以上規(guī)程中描述的流式細胞術分析CD8+T細胞。
[0287] 以抗原離體刺激后脾細胞中IFN- y和IL-2產生的水平(ELISA)
[0288]對在疫苗接種的第14天移除的脾臟進行脾細胞分離并以SIINFEKL抗原肽再刺激，并通過以上規(guī)程中描述的ELISA分析IFN-y和IL-2的產生。
[0289] 莖里
[0290] 血和脾臟中抗原特異性T細胞的水平
[0291] 結果如圖1所示?？梢钥吹剑斣诘?天進行測試時，與僅用0VA抗原的情況相比 (A)，PCI引發(fā)了顯著更好的效果。CpG寡核苷酸與僅用0VA抗原的情況相比也改善了疫苗接種，但沒有PCI程度那么大。單獨的R848與僅用0VA抗原的情況相比沒有改善疫苗接種，相反其似乎在一定程度上抑制了疫苗接種的效果。與PCI+0VA的效果相比，將PCI與R848或CpG組合改善了疫苗接種。這種改善在疫苗接種后14天分析脾細胞時更明顯(B和C)?？梢钥闯觯?這一時刻單獨的PCI+OVA治療的效果已經回到了背景水平，對于未使用PCI的R848/CpG+0VA 組也是如此。然而，在R484或CpG與PCI組合的兩組中，觀察到了明顯更好的效果，對于R848 尤其明顯。
[0292]細胞以抗原離體刺激后脾臟中IFN- y產生的水平(流式細胞術）
[0293] IFN-y和IL-2是以抗原刺激后⑶8+T細胞產生的細胞因子。結果如圖2所示。與圖1 所示結果相符，圖2顯示了 CpG/R848與PCI組合產生了最好的效果，在測試該參數(shù)時，CpG+ PCI看似好于R848+PCI。還可以看出，單獨的抗原(OVA)未得到可檢測的結果，而0VA+PCI引起了可觀察到的效果。未采用PCI的CpG/R848+0VA組未獲得效果(CpG)，或僅獲得勉強開檢測到的效果(1?848)，而組合0￥4+0口6+?(：1和0￥4+1?848+?(：1分別比0￥4+?(：1好約6倍和2.5倍。
[0294] 以抗原離體刺激后脾細胞中IFN- y產生的水平(ELISA)
[0295] 結果如圖3所示。圖3A和3C中顯示IFN-y和IL-2的產生均在0VA+CpG/R848+PCI組中最高，并且該產生依賴于SIINFEKL肽抗原的刺激，表明其為是抗原特異性效果。圖B和D顯示CpG/R848+0VA+PCI組中的效果顯著好于其他治療組。
[0296] 實施例2:其他TLR配體對0VA體內疫苗接種的影響
[0297] 采用上述方法進行體內疫苗接種。因此，可進行上述方法，其中14組（每組4只動物)接種的總劑量為：
[0298] 第1組：250iig TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0299] 第2組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙齦卟啉菌）。
[0300] 第3組：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+50iig LPS(埃希氏大腸桿菌）。
[0301] 第4組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(明尼蘇達沙門氏菌）。
[0302] 第5組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼蘇達沙門氏菌）。
[0303] 第6組：250lig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0304] 第7組：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0305] 第8組：10yg卵清蛋白。
[0306] 第9組：10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙齦卟啉菌）。
[0307] 第10組：10yg卵清蛋白+50yg LPS(埃希氏大腸桿菌）。
[0308] 第11組：l〇yg卵清蛋白+5〇yg LPS(明尼蘇達沙門氏菌）。
[0309] 第12組：10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼蘇達沙門氏菌）。
[0310]第 13組：10iig卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0311 ]第 14組：10lig卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0312] Poly( I: C)、LPS、MPLA和ssPolyU均獲自 Invivogen。
[0313] 實施例3:P〇ly(IC)和CpG對OVA體內疫苗接種的影響 [0314]材料和方法
[0315] 動物
[0316] C57BL/6小鼠購自Harlan(Horst，荷蘭）DCD8T-細胞受體轉基因0T-1小鼠 (B6? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb)llOOMjb)購自Taconic Europe(Ry，丹麥）或Jackson Laboratories (Bar Harbor，Maine) aOT-lCDST細胞識別卵清蛋白的H_2Kb_限制表位 311即￡此((^4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??條件下，所進行的程序得到瑞士和挪威獸醫(yī)管理結構的批準。
[0317] 材料和細胞
[0318] 雞0VA購自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽購自EMC Microcollections (Tuebingen，德國），Poly(IC)(高MW)和CpG寡核昔酸0DN2395購自 InvivoGen(San Diego，美國）。光敏化劑二磺酸四苯基二氫卟吩（TPCS2a)購自PCI Bi〇tech(LySaker，挪威hOVA、 TPCS 2JPP〇ly(IC)(如果采用)在PBS中混合，保持避光，在制備后60分鐘內施用于小鼠。通過 LumiSource?(PCI Biotech)以照射激活TPCS2a〇
[0319] 小鼠的皮內光敏化和免疫
[0320]在免疫前一天，從雌性0T-1小鼠體內分離脾臟和淋巴結，從均化細胞懸浮液中通過裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解緩沖液Hybri-Max)移除紅細胞。剩余的細胞在PBS中洗滌，通過70mi尼龍粗濾器過濾，通過靜脈注射將2X10 6個0T-1細胞注射給受體雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特異性CD8T細胞的適應性轉移有助于通過流式細胞術檢測免疫應答。1天或 8小時后，通過尾部放血對小鼠采血，將血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特異性⑶8T 細胞的基線頻率。
[0321]然后，將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內注射疫苗，所述疫苗由0VA或者由OVA、TPCS2a、Po ly (1C) (50yg)或CpG寡核苷酸(50yg)的混合物組成。疫苗保持避光，并在制備后60分鐘內使用。該疫苗在腹部中線的左側和右側分兩次注射施用，每次 SOyhOVA使用劑量為10yg或100yg，并且TPCS 2a劑量為150yg。疫苗注射后18小時，通過腹膜內注射氯胺酮（25mg/kg體重）和賽拉嗪（425mg/kg)的混合物將小鼠麻醉，并放置在 LumiSource光源上(進行照射和光敏化劑TPCS 2a激活）。照射時間為6分鐘。
[0322] 在之后第7和14天，小鼠經尾部放血采血，并通過裂解去除紅細胞，之后通過流式細胞術分析抗原特異性CD8T細胞。在實驗結束時(第14天），小鼠處以安樂死，并離體分析脾細胞。
[0323]免疫應答的分析
[0324] 用抗CD8抗體和H_2Kb/SIINFEKL Pro5五聚體（Proimmune，Oxford，英國）染色細胞，以進行流式細胞術分析，從而監(jiān)測血中OVA特異性CD8+T細胞的頻率。通過流式細胞術檢測CD44的表達，來進一步分析細胞的活化狀態(tài)。細胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San ]〇86，美國）進行分析，并使用？1〇￥]〇8.5.2軟件(1^66 3七31'，1]1〇.，4811]^11(1，010進行分析。
[0325] 對于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中對2X105個脾細胞進行再刺激。72小時后，收集上清液并通過ELISA分析IFN-y (eBioscience-根據(jù)制造商的說明書進行）。
[0326] Poly(IC)和 CpG 實驗
[0327] 按照"材料和方法"部分描述進行實驗，疫苗接種后第7天的小鼠血樣通過所述流式細胞術進行分析。第14天的脾細胞以SIINFEKL肽進行再刺激，并通過上述干擾素y ELISA 進行分析。所有小鼠接受所述0T-1細胞。
[0328] 以下試驗組包括：
[0329] 1.未治療:小鼠接受0T-1細胞，但未接種或照射。
[0330] 2.0VA:小鼠以10yg 0VA接種。它們未進行照射。
[0331] 3.0VA 100yg:小鼠以100yg 0VA混合物接種。它們未進行照射。
[0332] 4.0VA 10yg PCI:小鼠以10yg 0VA+150yg TPCS2a混合物接種。如上所述進行照射。
[0333] 5.CpG OVA:小鼠以10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸混合物接種。它們未進行照射。
[0334] 6.CpG 0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸+150yg TPCS2a混合物接種。如上所述進行照射。
[0335] 7.Poly(IC)0VA:小鼠以10yg 0VA+50yg Poly(IC)混合物接種。它們未進行照射。
[0336] 8.Poly(IC)0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg Poly(IC)+150yg TPCS2a混合物接種。如上所述進行照射。
[0337] 圖5A顯示了實驗組的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)?？梢钥?出CpG和Poly(IC)佐劑在單獨使用時均有僅很一般(CpG)或不明顯(Poly(IC)的效果，并且 PCI在單獨使用時明顯比這些佐劑中任一種更有效。然而，當PCI與CpG或Poly(IC)組合使用時刻觀察到明顯的協(xié)同效果，并且組合PCI+Poly (1C)最突出。
[0338] 圖5B示出了SIINFEKL肽重刺激脾細胞后，干擾素-y (IFN-y )ELISA的結果。首先，可以看出IFN-y的產生完全依賴于重刺激(未刺激的細胞的條勉強可見），表明這種產生具有嚴格的抗原特異性。還可以看出，雖然來自CpG或Poly(IC)組的細胞實際上沒有效果（單獨0VA也沒有效果），但在所有的PCI治療組中可觀察到再刺激的強效果，再次在PCI+CpG和 PCI+Poly(IC)組中可以觀察到協(xié)同效應，后者代表了更好的組合。
[0339] 對于實施例4至16，采用了以下材料和方法：
[0340] 動物
[0341] C57BL/6小鼠購自Harlan(Horst，荷蘭）DCD8T-細胞受體轉基因0T-1小鼠 (B6 ? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb) 1 lOOMjb)購自 Taconic Europe(Ry，丹麥）或購自 Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine) qOT-ICDST細胞識別卵清蛋白的H_2Kb_限制表位511即￡此(0￥4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??條件下，所進行的程序得到瑞士和挪威獸醫(yī)管理結構的批準。
[0342] 材料和細胞
[0343] 雞0VA購自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽購自EMC Microcollections (Tuebingen，德國），并且TRP-2 (序列SVYDFFVWL)、gp 100 (序列KVPRNQDWL)和HPV 16 E7 (序列GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR，下劃線為CD8表位）獲自United Peptides (此^1(1〇11，￥4)。？〇17(1〇、0口6寡核苷酸00似395、]\031^-3]\1、咪喹莫特和雷西莫特來自 InvivoGen(San Diego，美國）。光敏化劑二磺酸四苯基二氫卟吩(TPCS2a)購自PCI Biotech (1^881?51'，挪威）。
[0344] SIINFEKL、TRP_2和HPV五聚體購自Proimmune(0xford，英國）（Proimmune肽編碼分別為093、185和5021〇。
[0345] 帶有獲得性轉移的0T-1細胞的小鼠的皮內光敏化和免疫
[0346] 在免疫前一天，從雌性0T-1小鼠體內分離脾臟和淋巴結，從均化細胞懸浮液中通過裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解緩沖液Hybri-Max)移除紅細胞。剩余的細胞在PBS中洗滌，通過70mi尼龍粗濾器過濾，通過靜脈注射將2X10 6個0T-1細胞注射給受體雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特異性CD8T細胞的適應性轉移有助于通過流式細胞術檢測免疫應答。1天或 8小時后，通過尾部放血對小鼠采血，將血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特異性⑶8T 細胞的基線頻率。
[0347] 對于皮內免疫，將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內注射疫苗，所述疫苗由0VA或者由OVA、TPCS 2a和不同佐劑的混合物組成。疫苗保持避光，并在制備后 60分鐘內使用。該疫苗在腹部中線的左側和右側分兩次注射施用，每次50yl。疫苗注射后18 小時，通過腹膜內注射氯胺酮(25mg/kg體重)和賽拉嗪(425mg/kg)的混合物將小鼠麻醉，并根據(jù)各實驗如以下所述進行照射。
[0348] 在第7天，小鼠經尾放血采血，并通過裂解去除紅細胞，之后通過流式細胞術分析抗原特異性CD8+T細胞。在實驗結束時(第14天），小鼠處以安樂死，并離體分析脾細胞。
[0349] 正常小鼠的皮內光敏化和免疫
[0350] 將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內注射疫苗，所述疫苗由 0VA蛋白或者不同肽抗原(在各實驗中指明）、TPCS 24P不同的疫苗佐劑組成。疫苗保持避光，并在制備后60分鐘內使用。該疫苗在腹部中線的左側和右側分兩次注射施用，每次50iU。抗原和TPCS 2a&不同劑量使用(在各實驗中指明）。在疫苗注射后的特定時刻(通常為18小時，但在一些實驗中不同），通過腹膜內注射氯胺酮(25mg/kg體重)和賽拉嗪(425mg/kg)的混合物將小鼠麻醉，并根據(jù)各實驗所述進行照射。
[0351] 在免疫小鼠后第7天(或者在一些情況下為第6天），小鼠經尾放血采血，并通過裂解去除紅細胞，之后通過流式細胞術分析抗原特異性CD8+T細胞。在一些實驗中，小鼠在各實驗所規(guī)定的時間點接受多次(2或3次)免疫。在這些情況下，在免疫后6或7天取血樣，并通過如下所述的流式細胞術進行分析。
[0352] 經免疫小鼠的照射
[0353] 在一些實驗中，通過以LumiSource?(PCI Biotech)照射活化TPCS2a。通常，在免疫后18小時以LumiSource照射6分鐘，但在一些實驗中有如下所述的改變。在其他實驗中，如下所述使用基于LED的發(fā)藍光照射明設備(PCI Biotech AS)，并且在一些實驗中，采用PCI 652nm激光系統(tǒng)SN 576003二極管激光(PCI Biotech AS)進行照射。
[0354] 通過五聚體染色進行免疫應答分析
[0355] 在以抗CD8和抗CD44抗體以及與所用抗原對應的不同的五聚體對細胞染色后，通過流式細胞術檢測抗原特異性CD8T細胞的頻率。通過流式細胞術測試CD44表達，從而分析細胞的活化狀態(tài)。細胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San Jose,美國）進行分析，并使用 FlowJo8.5.2軟件（Tree Star，Inc.，Ashland，0R)進行分析。
[0356] 通過ELISA分析免疫應答
[0357] 對于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中對2X105個脾細胞進行再刺激。72小時后，收集上清液并通過ELISA分析IFN-y (eBioscience-根據(jù)制造商的說明書進行）。
[0358] 實施例4:正常小鼠中以0VA和Poly (1C)進行PCI的效果
[0359] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS24P50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動物。在免疫后18小時以 LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0360] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0361] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA接種。它們未進行照射。
[0362] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg OVA和150yg TPCS2a混合物接種并進行照射。
[0363] 4.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg OVA和50yg poly(IC)混合物接種。它們未進行照射。
[0364] 5.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC)混合物接種并進行照射。
[0365] 圖6顯示了第1和第2次免疫后實驗組(每組5只動物）的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％)。可以看出特別是在第2次免疫后，與僅采用poly(IC)(第4組)或僅采用PCI(第3組)相比，PCI和poly(IC)的組合(第5組)得到了明顯更好的免疫。
[0366] 實施例5:正常小鼠中以311見^此和口〇17(1〇進行?(：1的效果
[0367] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以lOOyg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第15天免疫動物。在免疫后18小時以 LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0368] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0369] 2.SIIN 100:小鼠以100yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進行照射。
[0370] 3.SIIN 100/PCI :小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 100yg TPCS2J9混合物免疫并進行照射。
[0371] 4.SIIN 100/poly(IC):小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的混合物免疫。它們未進行照射。
[0372] 5.SIIN 100/poly(IC)/PCI:小鼠以lOOygde SIINFEKL肽/100yg TPCS2jP10yg的 Poly (1C)混合物免疫并進行照射。
[0373] 圖7顯示了第2次免疫后實驗中各動物的值，表明通過PCI+Poly(IC)組合(第5組），所有動物均響應于免疫，而在其他組中僅有一只微弱響應的動物(在SIIN 100/PCI組中）。
[0374] 實施例6:正常小鼠中黑色素瘤抗原肽和poly(IC)的效果
[0375] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以TRP-2肽和gp-100肽 (各50yg)、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動物。在免疫后18 小時以LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以TRP-2五聚體、CD8 和CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0376] 1.未治療的TRP-2:小鼠未免疫或照射，血樣以TRP-2五聚體染色。
[0377] 2.TRP-2/poly(IC):小鼠以TRP-2和gplOO肽和 10yg poly(IC)的混合物免疫。它們未進行照射。血樣以TRP-2五聚體染色。
[0378] 3.TRP-2/PCI:小鼠以TRP-2和gplOO肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并進行照射。血樣以TRP-2五聚體染色。
[0379] 4.TRP-2/poly(IC)/PCI:小鼠以 TRP-2 和 gplOO 肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并進行照射。血樣以TRP-2五聚體染色。
[0380]圖8顯示了第2次免疫后TRP-2五聚體染色實驗組的平均值（總⑶8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％ )。可以看出，當TRP-2抗原與單獨的poly(IC)(第2組）或與單獨的PCI (第3組)使用時，在抗原特異性細胞中沒有觀察到超過未治療動物中所觀察到的明顯響應。相比之下，poly(IC)和PCI的組合(第4組)產生了明確的協(xié)同效果，使得抗原特異性⑶8+T細胞數(shù)量顯著增加。
[0381] 實施例7:正常小鼠中提供紅光照射分析以0VA和poly(IC)進行的PCI
[0382] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以lOyg或 100yg 0VA蛋白、150yg TPCS24P10或50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動物。以PCI 652nm激光系統(tǒng)SN576003二極管激光器，通過以0.81mW/cm2光通量遞送的0.3J/cm2的光劑量進行照射（即，照射時間約6分鐘）。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8 和CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0383] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0384] 2.0VA 10:小鼠以10yg的0VA免疫。它們未進行照射。
[0385] 3.0VA 100:小鼠以100yg的0VA免疫。它們未進行照射。
[0386] 4.0VA 10/紅光PCI:小鼠以10yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并進行照射。
[0387] 5.0VA 100/紅光PCI:小鼠以100yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并進行照射。
[0388] 6.0VA 10/紅光 PCI+poly(IC):小鼠以 10yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC) (第1次疫苗接種)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次疫苗接種)混合物免疫，并進行照射。
[0389] 7.0VA 100/紅光PCI+poly(IC):小鼠以 100yg 0VA、150yg TPCS2jP50yg poly(IC) (第1次免疫)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次免疫)混合物免疫，并進行照射。
[0390] 圖9顯示了第1和第2次免疫后紅光照射以激活光敏化劑的實驗組的平均值(總⑶8 +細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)?？梢钥闯?，對于10yg的0VA抗原，需要poly(IC)和PCI (第6組)的組合來實現(xiàn)免疫應答，單獨的抗原或抗原與PCI組合(第4組)未獲得免疫效果。對于100yg的0VA抗原，單獨的抗原稍有效果(第3組），但poly(IC)+PCI組合(第7組）的效果明顯更好。
[0391] 實施例8:正常小鼠中以SIINFEKL和poly (1C)進行PCI的分析
[0392] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動物。在免疫后18小時以 LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0393] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0394] 2.SIIN 50:小鼠以50yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進行照射。
[0395] 3.SIIN 50/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并進行照射。
[0396] 4.SIIN 50/poly(IC):小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 10yg poly(IC)的混合物免疫。它們未進行照射。
[0397] 5.SIIN 50/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg TPCS24P10yg的Poly (1C)的混合物免疫并進行照射。
[0398]圖10顯示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后實驗組的平均值（總⑶8+細胞中的抗原特異性CD44+細胞％)(誤差條為平均值的標準誤差）。可以看出，poly(IC)和PCI的組合(第5組)產生了強免疫應答，而在其它任何組都沒有觀察到應答。poly(IC)+PC組合因此產生了強協(xié)同效果。
[0399] 實施例9:正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)進行PCI的分析
[0400] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以lOOiig SIINFEKL肽/ 150yg TPCS2JP50yg poly(IC)(后者僅在第1次免疫中使用）的混合物在第0天和第14天免疫動物。在免疫后18小時以LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。在第28天，處死動物，收集脾臟并以SIINFEKL肽再刺激脾細胞并按照方法中所述通過ELISA進行分析。包括以下實驗組：
[0401] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0402] 2. 2XSIIN 100:小鼠在兩次免疫中均以100yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進行照射。
[0403] 3. 2XSIIN 100/PCI:小鼠在兩次免疫中均以 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2a 免疫，并進行照射。
[0404] 4. 1XSIIN 100/poly(IC)/lXSIIN 100:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 50yg P〇ly(IC)的混合物(第1次免疫)免疫;和100yg的SIINFEKL肽(第2次免疫)免疫。它們未進行照射。
[0405] 5. 1XSIIN 100/poly(IC)/PCI;lXSIIN 100/PCI:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽、 150yg TPCS24P50yg poly(IC)的混合物(第 1次免疫)免疫;和 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2j^混合物(第2次免疫)免疫。它們在兩次免疫中均進行照射。
[0406]圖11顯示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫后實驗組的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)?？梢钥闯?，poly(IC)和PCI的組合(第5組)給出了非常好的免疫應答，即使該組合僅用于第1次免疫而第2次免疫僅使用PCI時也是如此。
[0407]圖12顯示如圖中所示以SIINFEKL肽進行再刺激或未進行再刺激的脾細胞中的平均ELISA值?？梢钥闯?，當?shù)?實驗組(第1次免疫以PCI和poly(IC)組合進行;第2次免疫僅以 PCI進行）中進行的治療引起了再刺激后干擾素-Y產生的顯著提高時，在任何其它實驗組中未觀察到此情況。
[0408] 實施例10 :MPLA或咪喹莫特效果的分析
[0409] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、lOOy g TPCS2a和50yg咪喹莫特或10yg MPLA-SM的混合物在第0天和第14天免疫動物。在免疫后 18小時以LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0410] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0411] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它抹進行照射。
[0412] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg 0VA和100yg TPCS2d^混合物免疫并進行照射。
[0413] 4.0VA 200/咪喹莫特:小鼠以200yg 0VA和50yg咪喹莫特的混合物免疫。它們未進行照射。
[0414] 5.0VA 200/咪喹莫特/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P50yg咪喹莫特的混合物免疫，并進行照射。
[0415] 6.0VA 200/MPLA:小鼠以200yg 0VA和10yg MPLA-SM的混合物免疫。它們未進行照射。
[0416] 7.0VA 200/MPLA/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P10yg MPLA-SM的混合物免疫，并進行照射。
[0417] 圖13顯示了第1和第2次免疫后實驗組(每組5只動物，誤差條是標準偏差）的平均值(總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞的％ )。可以看出，對于咪喹莫特(第5組)和MPLA 佐劑(第7組），當均使用0VA蛋白作為抗原時，與僅使用佐劑實現(xiàn)的效果(分別為第4組和第6 組)相比與PCI組合引發(fā)了明顯更好的免疫效果。
[0418] 實施例11:在正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)進行PCI、第3次免疫后的記憶應答
[0419] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2a和10yg ?〇17(1〇的混合物在第0天和第14天免疫動物。通過 poly (IC)+PCI治療在第51天以第3次免疫測試免疫記憶的產生。在免疫后18小時以 LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或第6天(第3次免疫）的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0420] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0421] 2.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它們未進行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進行照射。
[0422] 3.SIIN50Poly(IC)+PCI/SIIN 50PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL 肽、l〇〇yg的TPCSdPlOyg的poly(IC)免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100 yg的TPCS 2a免疫。小鼠在三次免疫中均接受照射。
[0423] 圖14顯示了三次免疫中每一次后實驗組的值（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+ 細胞％)?？梢钥闯?，P〇ly(IC)和PCI的組合引發(fā)了非常強的免疫應答，由第3次免疫導致應答顯著增加，即使僅以PCI進行第3次免疫時也是如此(第3組）。相反，當在前兩次免疫中僅采用poly(IC)時，實際上沒有免疫應答，并且以poly(IC)+PCI進行第3次免疫未將免疫增強至任何有效程度。將圖11和圖12中所示結果一同考慮，所示結果表明對于肽抗原，poly(IC) 和PCI的組合是必需的，并且足以引發(fā)免疫應答，但該免疫應答后續(xù)可僅以PCI進行增強。反過來，單獨的poly(IC)不能引發(fā)免疫應答，即使在以poly(IC)進行兩次免疫后也不能引發(fā) 免疫應答，并且未觀察到免疫應答，以p〇ly(IC)+PCI進行第3次疫苗接種嘗試增強該應答沒有成功，表明單獨的poly(IC)完全不能引發(fā)免疫應答。數(shù)據(jù)還顯示以poly(IC)+PCI組合產生的免疫應答是持久的，這是因為其可被在第2次免疫后的第37天給予的第3次免疫大大增強。
[0424] 實施例12:正常小鼠中以HPV肽抗原和poly (1C)進行PCI的效果
[0425] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以50yg HPV 或SIINFEKL肽抗原、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動物。動物如以下規(guī)定在第7、14和51天接受3次免疫。在免疫后18小時以LumiSource照明設備進行6 分鐘照射。各次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或第6天(第3次免疫）的血樣以HPV或SIINFEKL五聚體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0426] 1.未治療SIIN:小鼠未被免疫或照射。血樣以SIINFEKL五聚體染色。
[0427] 2.未治療HPV:小鼠未被免疫或照射。血樣以HPV五聚體染色。
[0428] 3.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它們未進行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進行照射。
[0429] 4. HPV 50:小鼠在所有三次免疫中均以50yg的HPV肽免疫。小鼠未被照射。
[0430] 5.HPV 50/PCI/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前兩次免疫中，小鼠以50yg的HPV 肽和100yg的TPCS2a免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、100yg的TPCS 24P10yg的 P〇 ly (1C)免疫。小鼠在所有三次免疫中均照射。
[0431] 6.HPV 50/Poly(IC)/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前兩次免疫中，小鼠以50yg 的HPV肽和10yg的poly(IC)免疫。它們未進行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、 100y g的TPCS2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進行照射。
[0432] 圖15顯示了三次免疫后實驗組的（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％ )?？?以看出，在第6組中，引起了HPV特異性免疫應答，其量級與在相同免疫條件下以SIINFEKL肽 (第3組)取得的免疫應答相同。這表明PCI和p 〇ly(IC)組合還可有效引起針對病毒和癌癥相關HPV E7抗原的免疫應答，并且PCI+Poly(1C)引起了針對長的肽抗原(35個氨基酸)的免疫應答，這可能需要其以MHC I類呈遞之前細胞內攝入和蛋白水解加工。與此相反的是 SIINFEKL和黑色素瘤肽抗原，它們可不經過加工就呈遞。
[0433] 實施例13:照射時機的影響
[0434] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS^PlOyg的poly(IC)在第0天和第14天免疫動物。在所有組中，TPCS2a在照射之前18 小時注射，而0VA抗原和poly (1C)或者在照射之前18小時與TPCS2Jg合注射，或者在照射前2 小時單獨注射。以L u m i S 〇 u r c e照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以 SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0435] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0436] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它們并未接受TPCS2a并且未進行照射。
[0437] 3.0VA 200 PCI(2h):小鼠在照射前18小時注射TPCS2a，并在照射前2小時以200yg 的OVA免疫。
[0438] 4.0VA 200 PCiaSh):小鼠在照射前 18小時以TPCSdPOVA免疫。
[0439] 5.0VA 200 PCI P(IC)(2h):小鼠在照射前18小時注射TPCS2a，并在照射前2小時以 200yg的0VA+10yg Poly(IC)免疫。
[0440] 圖16顯示了第1和第2次免疫后實驗組(每組5只動物，誤差條是標準偏差）的平均值（總CD8+細胞中抗原特異性CD44+細胞的％ )，可以看出，當僅在照射前2小時施用抗原+ poly(IC)時，免疫應答被poly(IC)+PCI組合增強。
[0441 ] 實施例14:正常小鼠中以SIINFEKL肽和poly(IC)進行PCI的效果(通過三次免疫比較PCI+poly(1C)和poly(1C))
[0442]如以上材料和方法中對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽和100yg TPCS2a和10yg poly(IC)的混合物在第0天、第14天和第42天免疫動物。在免疫后18小時以Lumi Source照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以 SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0443] 1.未治療SIIN:鼠未免疫或照射，血樣以SIIN五聚體染色。
[0444] 2.SIIN/poly(IC):小鼠以50yg SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的化合物免疫三次。它們未進行照射。
[0445] 3.SIIN/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并進行照射。
[0446]圖17顯示了三個實驗組中典型動物第3次免疫后的流式細胞術點狀圖，清楚表明由poly(IC)+PCI組合引起了非常強的應答。
[0447] 圖18顯示了3次免疫中每一次后的平均值（總⑶8+細胞中抗原特異性⑶44+細胞的％)?？梢钥闯?，PCI+Poly(IC)組合引發(fā)了非常強的免疫應答，導致第3次免疫后的血樣中有約30%的抗原特異性CD8T細胞。相比之下，僅以抗原和poly(IC)佐劑進行3次免疫只產生了非常小的效果(第3次免疫后0.28%陽性細胞）。
[0448] 實施例15:正常小鼠中以HPV長肽抗原和poly (1C)進行PCI的效果
[0449] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。H P V 1 6 E 7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR用作"長"肽抗原。以550yg HPV長肽抗原、100yg TPC&JPlOyg p〇ly(IC)(以下規(guī)定的p(IC))的混合物在第0天和第14天免疫動物。如以下規(guī) 定在第7和14天對動物進行2次免疫。在免疫后18小時以LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第6天的血樣以HPV五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0450] 1.2 X HPV:小鼠以50yg HPV長肽免疫兩次。小鼠未進行光照。
[0451 ] 2.2XHPV+p(IC):小鼠以50yg HPV長肽和10yg poly(IC)的混合物免疫兩次。小鼠未進行光照。
[0452] 3.2XHPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV長肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j^g 合物免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0453] 4.1:冊￥+口（1〇+卩(：1.2:冊￥+?(：1:小鼠以50噸冊￥長肽、10辟口〇17(1〇和100辟 TPCS 2a的混合物免疫(第1次免疫），并以50yg HPV長肽和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次免疫）。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0454] 5.1:HPV+PCI.2:HPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV長肽和 100yg TPCS2j^g合物免疫(第1次免疫），并以50yg HPV長肽、10yg poly(IC)和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次免疫）。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0455] 圖19顯示了兩次免疫后實驗組的（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％)?？?以看出，與未采用PCI的實驗組(第1和2組)相比，在第3組中（以PCI+p(IC)組合免疫兩次）弓丨發(fā)了強HPV特異性免疫應答，而在第4和5組中（以PCI+p(IC)組合免疫一次，以僅PCI免疫一次)觀察到了較弱但仍顯著的免疫應答。這表明PCI和poly(IC)組合可有效引起針對病毒和癌癥相關HPV E7抗原的免疫應答，并且以該組合進行兩次免疫更有效:一次該組合免疫，結合一次僅以PCI進行的免疫。還表明對于HPV長肽抗原，當不與PCI組合使用時，p(IC)佐劑無效。
[0456] 實施例16:正常小鼠中以HPV短肽抗原和poly (1C)進行PCI的效果
[0457] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進行該實驗。HPV 16 E7 CD8表位RAHYNIVTF用作 "短"肽抗原。以50yg HPV短肽抗原、100yg TPCSdPlOyg poly(IC)(以下規(guī)定的p(IC))的混合物在第〇天和第13天免疫動物。如以下規(guī)定在第7和13天對動物進行2次免疫。在免疫后18 小時以LumiSource照明設備進行6分鐘照射。每次免疫后第6天的血樣以HPV五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細胞術進行分析。包括以下實驗組：
[0458] 1.未治療:小鼠未免疫后照射。
[0459] 2. 2XHPV短:小鼠以50ygHPV短肽免疫兩次。小鼠未進行光照。
[0460] 3. 2XHPV短+p(IC):小鼠以50yg HPV短肽和10yg poly(IC)的混合物免疫兩次。小鼠未進行光照。
[0461 ] 4. 2XHPV短+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9混合物免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0462] 5. 2XHPV短+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9 混合物免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0463] 6. 1:HPV 短+p(IC)+PCI.2:HPV 短+PCI:小鼠以 50yg HPV 短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2a的混合物免疫（第1次免疫），并且以50yg HPV短肽和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次免疫）。小鼠在兩次免疫中均進行照射。
[0464] 圖20顯示了兩次免疫后實驗組的（總⑶8+細胞中的抗原特異性⑶44+細胞％+/-SEM)〇
[0465] 可以看出，在以p(IC)+PCI組合免疫的兩組(第5和6組）中引發(fā)了顯著免疫應答，在將該組合用于兩次免疫的第5組中實現(xiàn)了更好的效果。相比之下，在僅采用p(IC)或僅采用 PCI進行兩次免疫的組中，未觀察到免疫應答(與未治療組(第1組)和僅以抗原免疫的動物 (第2組)相比）。這表明PCI和poly(IC)組合可有效引起針對病毒和癌癥相關HPV E7抗原（當其作為短肽遞送時）的免疫應答，并且與單獨的P(IC)或單獨的PCI相比，以p(IC)+PCI組合進行兩次免疫產生了強協(xié)同效果。
【主權項】
1. 一種在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括使所述細胞接觸所述抗原分子、光敏化劑、和TLR配體，并用有效活化所述光敏化劑的波長的照射所述細胞，其中，所述抗原分子被釋放到所述細胞的胞漿中，且所述抗原分子或其一部分隨后呈遞在所述細胞的表面上。2. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR1配體，優(yōu)選三酰脂肽。3. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR2配體，優(yōu)選脂聚糖，優(yōu)選脂多糖，優(yōu)選來自牙齦卟啉單胞菌。4. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR3配體，優(yōu)選雙鏈RNA分子，優(yōu)選 Poly(I:C)〇5. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR4配體，優(yōu)選脂多糖、例如來自埃希氏大腸桿菌或明尼蘇達沙門氏菌的脂多糖，或單磷酰脂A(MPLA)、例如來自明尼蘇達沙門氏菌的MPLA;優(yōu)選MPLA。6. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR5配體，優(yōu)選鞭毛蛋白。7. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR6配體，優(yōu)選二酰脂肽。8. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR7配體，優(yōu)選式（1)的咪唑并喹啉化合物或其藥學可接受的鹽，其中，R:是氨基烷基，且心可選地取代有例如羥基，并且R2是烷基，且R2可選地間插有氧或氮基團，其中，優(yōu)選的是 Ri 是 N-CH2-C(CH3)2-R3; R2 是-ch2-x-ch2ch3 或氫原子； R3是0H或氫原子，并且 X是0或NH。9. 如權利要求8所述的方法，其中，所述咪挫并喹啉化合物選自雷西莫特、咪喹莫特和嘎德莫特或其藥學可接受的鹽。10. 如權利要求8所述的方法，其中，所述TLR7配體是單鏈RNA分子，優(yōu)選ssPolyU，優(yōu)選長度為20至200個核苷酸。11. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR8配體，優(yōu)選ssPolyU分子。12. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR9配體，優(yōu)選CpG寡核苷酸，CpG寡核苷酸是6個至50個堿基的單鏈寡核苷酸，其包括至少一個CpG基序和各處于所述基序的3' 和5'側的至少一個堿基。13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸包含長度為8至16個堿基的回文序列。14. 如權利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸具有以下序列： 5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-S'或57-tccatgacgttcctgacgtt_3〇15. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR11配體或TLR12配體，優(yōu)選抑制蛋白。16. 如權利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR13配體，優(yōu)選長度為5至30個核苷酸的RNA分子，其中，優(yōu)選的是RNA分子包括序列CGGAAAGACC。17. 如權利要求1至16中任一項所述的方法，其中，所述抗原分子是能夠刺激免疫應答的分子，優(yōu)選疫苗抗原或疫苗組分。18. 如權利要求17所述的方法，其中，所述抗原呈遞引起對免疫應答的刺激。19. 如權利要求1至18中任一項所述的方法，其中，所述方法在體外或離體進行。20. 如權利要求1至19中任一項所述的方法，其中，所述光敏化劑選自TPCS2a、AlPcS2a、 TPPS4 和 TPBS2a、優(yōu)選 TPCS2a。21. 如權利要求1至20中任一項所述的方法，其中，所述抗原分子是肽，優(yōu)選黑色素瘤肽或人乳頭瘤病毒(HPV)肽。22. 如權利要求1至21中任一項所述的方法，其中，所述細胞是抗原呈遞細胞，優(yōu)選樹突細胞。23. 如權利要求1至22中任一項所述的方法，其中，所述細胞同時、分別或依次地接觸所述抗原分子、光敏化劑和TLR配體。24. -種在受試者中產生免疫應答的方法，所述方法包括對所述受試者施用權利要求 1、17或21所述的抗原分子、權利要求1或20所述的光敏化劑、和權利要求1至16中任一項所述的TLR配體，并用有效活化所述光敏化劑的波長的照射所述受試者，其中，產生了免疫應答。25. 如權利要求24所述的方法，其中，所述方法是疫苗接種方法。26. 如權利要求24或25所述的方法，所述方法用于治療或預防疾病、病癥或感染，優(yōu)選癌癥，優(yōu)選黑色素瘤或與乳頭瘤病毒相關的癌癥。27. 如權利要求24至26中任一項所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動物，優(yōu)選貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，最優(yōu)選的是受試者是人。28. 如權利要求24至27中任一項所述的方法，其中，所述抗原分子、光敏化劑和TLR配體同時、分別或依次地施用于所述受試者。29. -種藥物組合物，其包括權利要求1、17或21所述的抗原分子、權利要求1或20所述的光敏化劑、和權利要求1至16中任一項所述的TLR配體，以及一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。30. -種在表面上表達抗原分子或其一部分的細胞或細胞群，所述細胞可通過權利要求1至23中任一項所述的方法獲得，其中，優(yōu)選的是所述細胞是樹突細胞。31. -種藥物組合物，其包括權利要求30所述的細胞或細胞群，以及一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。32. 用于預防或治療應用的權利要求30所述的細胞或細胞群、或權利要求29或31所述的組合物。33. 用于刺激受試者體內免疫應答的權利要求30所述的細胞或細胞群、或權利要求29 或31所述的組合物，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥。34. 權利要求30所述的細胞群、或權利要求29或31所述的組合物在制備藥物中的應用，所述藥物用于刺激受試者體內免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥。35. 如權利要求34所述的應用，其中，所述刺激、治療或預防包括施用所述藥物給所述受試者。36. 用于預防或治療應用的權利要求1、17或21所述的抗原分子、權利要求1或20所述的光敏化劑、和權利要求1至16中任一項所述的TLR配體。37. 用于權利要求36所述應用的抗原分子、光敏化劑和TLR配體，其用于刺激受試者體內免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/ 或用于治療或預防癌癥，其中，優(yōu)選的是所述應用包括權利要求1至28中任一項所述的方法。38. 用于權利要求36或37所述應用的抗原分子、光敏化劑和權利要求1至16中任一項所述的TLR配體，其中，所述應用包括權利要求1至23中任一項所述的方法以制備細胞群，其中，優(yōu)選的是所述細胞是樹突細胞。39. 用于權利要求38所述應用的抗原分子、光敏化劑和試劑，其中，所述細胞群將施用給所述受試者。40. 權利要求1、17或21所述的抗原分子、和/或權利要求1或20所述的光敏化劑、和/或權利要求1至16中任一項所述的TLR配體在制備藥物中的應用，所述藥物用于刺激受試者體內免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/ 或用于治療或預防癌癥，其中，優(yōu)選的是所述免疫應答通過權利要求24至28中任一項所述的方法來刺激。41. 如權利要求40所述的應用，其中，所述藥物包括能通過權利要求1至23中任一項所述的方法獲得的在所述細胞的表面上表達抗原分子或其一部分的細胞群，用于施用給所述受試者。42. 如權利要求41所述的應用，其中，將所述抗原分子和/或光敏化劑和/或TLR配體用于權利要求1至23中任一項所述的方法中，以獲得用于制備所述藥物的所述細胞群。43. -種產品，其包括權利要求1、17或21所述的抗原分子、權利要求1或20所述的光敏化劑、和權利要求1至16中任一項所述的TLR配體作為組合制劑，以同時、分別或依次使用來刺激受試者體內免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥，或用于根據(jù)權利要求1至28中任一項所述的方法在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分。44. 一種試劑盒，其用于刺激受試者體內免疫應答，優(yōu)選用于治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥，或用于根據(jù)權利要求1至 28中任一項所述的方法在細胞的表面上表達抗原分子或其一部分，所述試劑盒包括：第一容器，其包含權利要求1或20所述的光敏化劑；第二容器，其包含權利要求1、17或21所述的所述抗原分子;和第三容器，其包含權利要求1至16中任一項所述的TLR配體。45. -種用于在受試者體內產生免疫應答、優(yōu)選治療或預防所述受試者的疾病、病癥或感染、優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預防癌癥的方法，所述方法包括根據(jù)權利要求1 至23中任一項所述的方法制備細胞群，并隨后將所述細胞施用給所述受試者。
【文檔編號】C12N5/0784GK105873585SQ201480057929
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年8月28日
【發(fā)明人】A·霍格賽特, P·約翰森
【申請人】Pci生物技術公司

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