用于fret的新化合物及與其相關的方法【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及用于分子內熒光共振能量轉移（FRET)的化合物及與其相關的方法、試劑盒和組合物，所述化合物包含基于碳代NADH(carbaNADH)的第一熒光團的氧化形式和可在約445至約540nm的波長激發(fā)且最大發(fā)射大于約560nm的第二焚光團?！?br>背景技術：
】[0002]許多生物分析方法基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)的氧化狀態(tài)。NAD具有多個環(huán)形結構，其經歷了煙酰胺環(huán)內的氧化還原反應。密切相關的NADP分子是在腺苷核糖環(huán)的2'位上磷酸化的。[0003]NAD和NADP可通過正式加入氫負離子可逆地還原，并且這兩種分子在可逆反應中作為輔酶起作用。因此，基于NAD和NADH的酶反應適于進行熒光分析。[0004]許多氧化還原酶可使用這些輔因子在分子之間轉移氫基團。因為這些分子的還原形式在其吸收光的能力上不同于它們的氧化形式，所以基于在340nm的光吸收或通過在445nm光的熒光發(fā)射已經定量反應。[0005]酶的脫氫酶反應可采用如下特性：NAD和NADP的還原形式吸收波長為340nm的光，而氧化形式則不能。類似地，當在340nm激發(fā)時，還原形式能夠在445nm發(fā)射焚光，而氧化形式則不能。這些特性使得定量直接涉及這些輔因子的氧化狀態(tài)變化的反應成為可能。例如，當在三磷酸腺苷（ATP)存在下，將磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶用于催化由NADH形成NAD時，三磷酸腺苷的濃度可以熒光強度降低進行測量（美國專利4,446,231和4,735,897)。[0006]氧化還原酶在血糖水平的定量測量中也相當普及，參見例如EP0293732A2、US2005/0214891A1和US2006/0003397。所有這些公開均描述了用于測量葡萄糖的類似的測試方案，其中使用含有酶-輔酶對葡萄糖脫氫酶（GlucDH)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)的試劑系統(tǒng)。GlucDH起作用后，氫負離子從葡萄糖轉移至NAD，從而形成NADH。所得NADH的量與葡萄糖的濃度直接相關。NADH為強熒光團，其濃度可以通過測量熒光強度來測定。樣品中的分析物濃度通常是通過使測量的熒光強度與用已知分析物濃度得到的校正曲線相關聯(lián)來確定。[0007]顯然，基于酶的測量系統(tǒng)用于生化分析是臨床相關分析方法的重要組成部分。這主要是涉及分析物（例如代謝物或底物）的測量，其直接或間接借助酶進行測定。借助酶-輔酶復合物將分析物轉化并隨后進行定量。在該過程中，待測定的分析物與合適的酶和輔酶接觸，其中酶通常以催化量使用。輔酶是變化的，例如通過酶反應進行氧化或還原。該過程可例如光度測定進行檢測。校正提供測量值與待測定的分析物濃度之間的直接關聯(lián)。[0008]輔酶是與酶共價或非共價結合且通過轉化分析物而變化的有機分子。輔酶的突出實例是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由此通過還原分別形成NADH和NADPH。[0009]現(xiàn)有技術已知的許多基于氧化還原酶的測量系統(tǒng)具有有限的保質期且需要謹慎處理，諸如冷卻或干燥貯存，以達到足夠的貯存壽命。因此，可發(fā)生不正確、未察覺的貯存不良引起的結果。特別是由基本包裝開口和長時間使用周期引起的干燥劑的耗竭可導致測量誤差。[0010]上述基于酶的測量系統(tǒng)的基本組成部分，即酶和輔酶，均可獨立地有助于這種有限的穩(wěn)定性。例如，已知輔酶諸如NAD和NADP相當不穩(wěn)定。[0011]NAD和NADP是文獻中描述的降解途徑的堿不穩(wěn)定性分子（參見例如N.J.OppenheimerinThePyridineNucleotideCoenzymesAcademicPress,NewYork,London1982,J.Everese,B.Anderson,K.Yon,Editors,chapter3,pages56_65)〇ADP-核糖基本上是在通過裂解核糖和吡啶單元之間的糖基鍵而降解NAD或NADP過程中形成的。NADH和NADPH的還原形式是酸不穩(wěn)定的；例如差向異構化是已知的降解途徑。[0012]NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩(wěn)定性是由于核糖和吡啶單元之間的糖基鍵的不穩(wěn)定性。但是，即使在不激烈的條件下諸如在水溶液中，輔酶NAD和NADP可能僅僅由于環(huán)境濕度就已經被水解。[0013]碳代NAD類似于NAD，其中核糖被碳環(huán)糖單元替代。碳代NAD(或碳-NAD)具有下列結構（I):[00141123456然而，即使當使用更穩(wěn)定的輔酶碳代NAD時，仍有一系列相當根本的問題與熒光強度的測量有關，其包括以下：2基于熒光強度測量的測量誤差的一個重要來源來自非特異性光，其到達來自環(huán)境的探測器且可引起非特異性信號。3所測量的熒光的強度不僅僅是熒光團的量的函數(shù)。相反，它也明顯受其樣品中分子環(huán)境的影響。具體而言，在術語熒光猝滅下概述的方法導致測量誤差。4分子的位置和定位可在吸收與發(fā)射之間變化，因為在統(tǒng)計學方法中呈納秒量級的時間在分子的激發(fā)和光量子的發(fā)射之間經過。由此導致的干擾影響涉及熒光強度，具體為溫度依賴性。5熒光一般由紫外線激發(fā)。電子激發(fā)態(tài)的光化學反應可引起熒光團的漂白。這是另一個誤差源。6在此基礎上，本發(fā)明的一個目的是提出一種方法，其允許具體涉及所述穩(wěn)定性問題、測量誤差和干擾的改進的測量?！?br/>發(fā)明內容】[0021]本發(fā)明涉及一種化合物，其包含[0022](1)基于碳代NADH的第一熒光團的氧化形式，和[0023](2)可用波長為445至540nm的光激發(fā)且最大發(fā)射大于560nm的第二焚光團，[0024]具體地其中基于碳代NADH的第一熒光團和第二熒光團共價連接。[0025]在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于測定樣品中分析物濃度或量的基于熒光的方法?！揪唧w實施方式】[0026]本發(fā)明涉及一種化合物，其包含[0027](1)基于碳代NADH的第一熒光團的氧化形式，和[0028](2)可用波長為445至540nm的光激發(fā)且最大發(fā)射大于560nm的第二焚光團，[0029]具體地其中基于碳代NADH的第一熒光團和第二熒光團共價連接。[0030]本發(fā)明化合物具體用于分子內熒光共振能量轉移（FRET)方法，例如，如本說明書中詳述的方法。[0031]在優(yōu)選的實施方案中，第二熒光團的最大發(fā)射為560至750nm。[0032]在另一個優(yōu)選實施方案中，第二熒光團可用波長為445至475nm的光激發(fā)。[0033]基于碳代NADH的第一焚光團優(yōu)選可用波長為300至400nm，優(yōu)選360至380nm，更優(yōu)選365至385nm，最優(yōu)選370至380nm的光激發(fā)。[0034]碳代NADH最大可用波長為360nm的光激發(fā)。[0035]碳代NADH的最大發(fā)射為465nm。[0036]使用這種用于FRET的化合物克服了基于熒光的方法中NAD衍生的化合物的上述缺陷。如實施例中所述，化合物N6-[N-(6-"Cy3"氨基己基）氨甲?；谆鵠碳代NADH被證明可用于FRET方法。"Cy3"定義如圖2所示的一類化合物并且也被稱為2-[3-[1-(己-5-?；?1，3-二氫-3,3-二甲基-5-硫代-2H-吲哚-2-亞基]-1-丙烯-1-基]-3,3-二甲基-5-硫代-1-(3-磺基苯基）-3H-吲哚鑰實體，其中己酰基的羰基與氨基己基的氨基連接）。[0037]術語"基于碳代NADH的第一熒光團"僅用于指基于在400至570nm發(fā)熒光的碳代NAD/碳代NADH氧化還原系統(tǒng)的化合物的還原形式。酶底物通常是呈其氧化形式（碳代NAD)(也稱為基于碳代NADH的第一熒光團的氧化形式）的本發(fā)明化合物或熒光輔酶。[0038]本發(fā)明化合物包含碳代NAD部分，并且由此分別包含煙酰胺實體和腺苷實體。煙酰胺實體可被還原成1，4-二氫煙酰胺實體，其作為熒光團起作用。煙酰胺實體通常是未取代的。腺苷實體的其余原子可為經取代的。對本領域技術人員顯而易見的是，這種取代必須與感興趣的酶反應相容。這種取代列于Thepyridinenucleotidecoenzymes·NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.91-134中。優(yōu)選的取代基為腺苷酸實體中2'OH上的磷酸酯基團，形成碳代NADP部分。取代基優(yōu)選在腺苷酸核堿基上（Thepyridinenucleotidecoenzymes.NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.103_104tableIItemIIA)。取代的最優(yōu)選位置為腺苷酸核堿基的N6和C8。N6和C8處的合適取代基獨立地為(^至C12烷基、烯基或炔基(alkinyl)，其任選地被一個或多個0、N和/或S原子中斷，并且其中所述(^至C12烷基、烯基或炔基任選地取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，所述烷基任選地被一個或多個〇、N或S原子取代或中斷，并且其中N6或C8中的一個優(yōu)選經長度為25個原子或更少的連接基分子與第二熒光團連接。將基于碳代NAD的部分理解為碳代NAD部分，其如上文所定義任選取代。[0039]碳代NADH的氧化形式，即碳代NAD，具有上述式（I)的結構。[0040]在一個優(yōu)選的實施方案中，基于碳代NADH的第一熒光團的氧化形式為具有式II的基于碳代NADH的第一熒光團[0041][0042]其中[0043]Q為冊況，其中&和R2獨立地選自H、C連C12烷基、C連C12烯基和C連C12炔基，任選地其中烷基、烯基和炔基的一個或多個碳原子用0、N或S代替，和/或[0044]任選地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=0、-0H、-SH、=S或C1至C4烷基，其中烷基的一個或多個碳原子任選地用〇、N或S代替，且[0045]J選自烷基、(^至(：12烯基和(^至(：12炔基，任選地其中烷基、烯基和炔基的一個或多個碳原子用〇、N或S代替和/或任選地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，其中烷基的一個或多個碳原子任選地用0、N或S代替，具體地其中J和Q中的一個經由長度為25個原子或更少的連接基分子與第二熒光團連接，且[0046]T為氫原子或磷酸酯基團，尤其當前第1頁1 2 3 4