新型核酸分子的制作方法
【專利說明】新型核酸分子 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明尤其涉及新型核酸分子、含有它們的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì) 胞和宿主細(xì)胞系以及它們在蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其是含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中的用 途。
[0002] II直
[0003] 已觀察到，在古細(xì)菌的一個(gè)亞組（代謝甲基胺的產(chǎn)甲烷古細(xì)菌）中天然進(jìn)化的一 個(gè)正交RS/tRNA對對于氨基酸吡咯賴氨酸具有特異性。吡咯賴氨酸使用天然進(jìn)化成正交于 所有其他氨基酸和tRNA的第21氨基酰-tRNA合成酶。
[0004] 吡咯賴氨酸是由琥珀密碼子可靠地指定的唯一一種天然氨基酸。布萊特（Blight) 等人，2004表明PylRS和tRNApyl在大腸桿菌（E. coli)中可在琥珀密碼子處摻入吡咯賴氨 酸。他們還表明wt PyLRS是天然混雜的并且可摻入賴氨酸的類似物。
[0005] 橫山（Yokoyama)等人（EP1911840)展示，PylRS/tRNA系統(tǒng)在真核細(xì)胞中是正交 的，并且顯示出在細(xì)菌細(xì)胞中將若干nnAA摻入到由琥珀密碼子編碼的靶蛋白中。這些作者 還鑒定了 PylRS中形成氨基酸結(jié)合口袋且起到相對于其他典型氨基酸選擇吡咯賴氨酸的 作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。此位點(diǎn)處的突變產(chǎn)生能夠識別tRNApyl并且用AzZ-lys將tRNApyl 氨基?；耐蛔凅w（柳澤（Yanagisawa)2008)。
[0006] 這種正交性延伸至細(xì)菌和真核細(xì)胞。
[0007] PylRS是天然混雜的合成酶，其天然進(jìn)化成不包括賴氨酸，但是將在不突變的情況 下?lián)饺胭嚢彼犷愃莆?，包括疊氮化物、炔烴和烯烴（柳澤等人，2008;諾伊曼（Neumann)等 人，2008;向井（Mukai)等人，2008;阮（Nguyen)等人，2009)。這種特異性的基礎(chǔ)取決于 在pylRS結(jié)合口袋的氨基酸殘基與吡咯賴氨酸的吡咯環(huán)之間的疏水性相互作用，其使該氨 基酸穩(wěn)定并且將該氨基酸正確地定位在該合成酶的活性位點(diǎn)中（卡佛蘭（Kavran)等人， 2007)。此RS/tRNA對已通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入到細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中并且已顯示出對 于將多個(gè)非天然氨基酸摻入靶蛋白中是有效的。
[0008] 例如，EP 1911840展示了在大腸桿菌細(xì)胞中將Ν-ε-boc-賴氨酸摻入靶蛋白中。
[0009] tRNA在真核細(xì)胞中的表達(dá)通過RNA聚合酶III( "PolIII"）來進(jìn)行，需要2型基 因內(nèi)啟動子，該2型基因內(nèi)啟動子含有二分結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，通過一個(gè)可變序列將已知為 A-盒和B-盒的兩個(gè)短的保守序列元件分開。與哺乳動物tRNA基因相反，原核tRNA基因由 基因外啟動子元件調(diào)控。因此，許多原核tRNA不含在哺乳動物細(xì)胞中充當(dāng)啟動子的A-盒 和B-盒元件。對于甲燒八疊球菌（Methanosarcina)來源的tRNApyl來說即是如此。
[0010] 將tRNApyl編碼序列連同PylRS -起引入哺乳動物細(xì)胞中不導(dǎo)致報(bào)告基因構(gòu)建體 的琥珀型抑制，推測是由于保守性A-盒和B-盒元件的缺乏（向井等人，2008)。
[0011] 漢考克（Hancock)等人（漢考克等人，2010,美國化學(xué)學(xué)會期刊（JACS))嘗試在來 自巴氏甲燒八疊球菌（Methanosarcina barkeri)的tRNApyl基因內(nèi)重新構(gòu)建功能性A-盒 和B-盒，并且未能證實(shí)突變型tRNA基因在酵母中的功能性琥珀型抑制，表明將A-盒和 B-盒元件引入tRNA序列中的任何修飾改變了 tRNA架構(gòu)，從而阻礙其總體功能。Mm tRNApyl 的序列分析顯示B-盒與共有B-盒具有顯著的同源性，但是A-盒顯示出顯著的多樣性。
[0012] 尋找在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)抑制型tRNA的最優(yōu)條件的嘗試追溯至1982年（胡德 齊亞克（Hudziak)等人，1982,拉斯基（Laski)等人，1982)，在產(chǎn)生用于遺傳疾病的基因治 療的無義抑制型tRNA的背景下，其中終止密碼子導(dǎo)致關(guān)鍵蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的提前終止。
[0013]弓丨入細(xì)胞中的DNA的量、tRNA基因的拷貝數(shù)以及驅(qū)動其表達(dá)的啟動子元件已經(jīng)被 鑒定為達(dá)到最優(yōu)tRNA水平，例如，以允許有效活性而不導(dǎo)致對細(xì)胞的毒性的關(guān)鍵元件。
[0014] 通過加工雙順反子構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)的tRNA的表達(dá)已經(jīng)顯示存在于真核細(xì)胞中。 tRNAarg-tRNAasp 的基因組編碼基因?qū)Γ╣enomically encoded gene pair)已在酵母細(xì) 胞中有所描述（施密特（Schmidt)等人，1980)。此基因表達(dá)為單個(gè)前體RNA，該單個(gè)前體 RNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾，以在體內(nèi)和在卵母細(xì)胞提取物中產(chǎn)生兩個(gè)成熟tRNA(施密特等人， 1980)。在這種情況下，tRNA基因通過由CTTTGTTTCT(SEQ ID No. 68)組成的短間隔區(qū)分 開。這種基因排列還已經(jīng)用于表達(dá)在酵母中正常不表達(dá)的tRNA (弗朗西斯（Francis)等人， 1990)。此處，含有共有A-盒和B-盒元件，但是在酵母中不轉(zhuǎn)錄的人tRNAmet基因當(dāng)置于 tRNAarg元件下游時(shí)在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)。諸位作者表明，兩個(gè)RNA基因的距離影響轉(zhuǎn) 錄效率。當(dāng)兩個(gè)tRNA通過在酵母Arg-Asp tRNA對之間存在的短的10bp富含胸腺嘧啶核 苷的間隔子分開時(shí)，實(shí)現(xiàn)了外源tRNA的表達(dá)。當(dāng)居間序列的這種間隔子長度增加（最多至 92bp)時(shí)，也觀察到tRNAmet基因的表達(dá)，但是效率較低（弗朗西斯等人，1990)。在另一個(gè) 例子中，斯特羅比（Straby) (1988)利用雙順反子酵母Arg-Asp tRNA基因?qū)肀磉_(dá)正常地 轉(zhuǎn)錄沉默抑制型tRNAsup(tyr)。在一個(gè)構(gòu)建體中，tRNAsup替代tRNAasp基因并且保留存 在于酵母Arg-Asp tRNA對之間的短的10 bp的富含胸腺嘧啶核苷的間隔子并且顯示出有 效的tRNAsup表達(dá)。
[0015] tRNA還已經(jīng)在外部啟動子如U6啟動子（庫昆特拉（Koukuntla)等人，2013 ;向 井等人，2008)、T7RNA聚合酶啟動子（向井等人，2008)、SNR52(王（Wang)和王，2012)下 表達(dá)，并且表達(dá)為由上游tRNA基因調(diào)控的雙順反子構(gòu)建體的組分（漢考克等人，2010 ;弗 朗西斯等人，1990 ;斯特羅比，1988 ;施密特等人，1980 ;向井等人，2008);表達(dá)為多聚體如 tRNAser (布沃里等人，2000)。
[0016] 向井等人（也參見US 8, 168, 407)以及漢考克等人針對tRNApyl的表達(dá)對多 種基因外啟動子進(jìn)行了檢驗(yàn)。這些包括作為雙順反子構(gòu)建體的人tRNA，例如tRNAval或 tRNAarg。雖然雙順反子系統(tǒng)在酵母細(xì)胞中是有功能的（參見漢考克等人），但是向井等 人（2008)報(bào)道，在真核細(xì)胞中，將tRNApyl基因置于真核tRNA(tRNAval)基因下游導(dǎo)致 tRNApyl的次優(yōu)表達(dá)，這并不理想，因?yàn)楸磉_(dá)水平過低而不能在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行最優(yōu)琥 珀型抑制。
[0017] 此外，向井等人（2008)和漢考克等人（2010)針對tRNApyl的表達(dá)測試了 PolII 依賴性CMV啟動子以及噬菌體T7聚合酶啟動子，并且針對小的核RNA U6測試了該基因的 PolIII/3型啟動子。具體地，諸位作者表明，連接至tRNApyl的編碼序列5'端的U6啟動子 當(dāng)連同PylRS、nnAA以及包括琥珀密碼子的靶標(biāo)一起引入真核細(xì)胞中時(shí)尤其有效地導(dǎo)致琥 珀型抑制。
[0018] snRNA基因的啟動子U6和H1已廣泛地用于哺乳動物細(xì)胞中RNA種類的表達(dá)。鑒 于這些啟動子作為基因外啟動子的功能，它們尤其適用作表達(dá)工具。此外，它們允許置于這 些元件下游的基因的非常高的表達(dá)。
[0019] 然而，U6和H1啟動子近期已表明在用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中具有導(dǎo)致細(xì)胞毒 性的有害作用，據(jù)認(rèn)為這是因?yàn)榇藛幼拥母咿D(zhuǎn)錄需求而發(fā)生的（埃勒特（Ehlert)等人， 2010)(捷林（Giering)等人，2008)(斯蒂格邁耶（Stegmeier)等人，2005)。此外，U6啟動 子尤其顯示出影響RNA產(chǎn)物的定位，從而導(dǎo)致其在核中的普遍積累，因此產(chǎn)生其被細(xì)胞質(zhì) 機(jī)器利用的問題（保羅（Paul)等人，2003)。
[0020] 雖然上述基因外啟動子的使用導(dǎo)致tRNApyl的高水平表達(dá)，但是可能的是，所表 達(dá)的大部分tRNA錯(cuò)誤定位在細(xì)胞核區(qū)室中并且不可用于細(xì)胞溶膠中的氨基?；饔?。雖 然觀察到有效的琥珀型抑制，但是可能的是，這是由逸出核的相對少部分的tRNA造成的。
[0021] 因此，希望將替代性tRNA啟動子工程化，以允許tRNA的更好定位及其對于翻譯機(jī) 器的可用性。
[0022] 還希望將消除了已針對外部啟動子如U6和H1啟動子元件所報(bào)道的細(xì)胞毒性作用 的tRNA啟動子工程化，這些外部啟動子在穩(wěn)定表達(dá)所述tRNA構(gòu)建體的細(xì)胞系中可有利于 低水平的蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力的喪失。
[0023] RNA聚合酶III(有時(shí)在此稱為"polIII"）轉(zhuǎn)錄機(jī)器專用于在真核生物中產(chǎn)生小 尺寸的非蛋白編碼RNA(ncRNA)(由帝爾奇（Dieci)等人，2013綜述）。
[0024] PolIII轉(zhuǎn)錄基因結(jié)合由此聚合酶選擇性識別的轉(zhuǎn)錄因子并且通過這些轉(zhuǎn)錄因子 激活。這些因子以幾種不同的組合作用，如同通過對應(yīng)地不同的啟動子架構(gòu)所指定的。這 些已分成三大種類：1型啟動子（如5SrRNA所用的啟動子）含有基因內(nèi)元件（啟動子存在 于該基因的編碼序列內(nèi)）并且由再分成A-盒、C-盒和中間元件（IE)的內(nèi)部控制區(qū)組成。 這些元件是轉(zhuǎn)錄所必需的，因?yàn)樗鼈儽换A(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFIIIC和TFIIIA結(jié)合。2型啟動子 由tRNA基因使用并且含有由已知為A-盒和B-盒的保守元件組成的基因內(nèi)啟動子。這些 是轉(zhuǎn)錄因子TFIIIC的結(jié)合位點(diǎn)，該轉(zhuǎn)錄因子TFIIIC繼而募集相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)延伸直 到-40位的上游區(qū)域上的起始因子TFIIIB。3型啟動子是基因外的上游定位的啟動子并且 由遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)序列元件以及TATA-盒組成。用于U6snRNA和RNA酶P(HI)RNA的啟動子是 這個(gè)啟動子種類的成員。這些啟動子通過轉(zhuǎn)錄因子SNAPc(PBP或PTF)唯一識別，該轉(zhuǎn)錄因 子SNAPc繼而募集TFIIIB的特異性變體。有趣的是，PolIII/3型啟動子已適于在真核細(xì) 胞中表達(dá)抑制性RNA和表達(dá)缺乏A-盒和B-盒元件的tRNA，例如哺乳動物細(xì)胞中的U6啟動 子（向井等人，2008)和酵母中使用的SNR52啟動子（王和王，2012)。
[0025] 若干ncRNA基因的表達(dá)通過置于轉(zhuǎn)錄區(qū)域上游的啟動子元件，類似于3型啟動子， 結(jié)合基因內(nèi)啟動子，例如tRNA基因所用的A-盒和B-盒進(jìn)行調(diào)控。這些可視為雜合啟動 子-稱為"4型"啟動子，這是由于既存在基因外控制元件，又存在基因內(nèi)控制元件。由這些 啟動子調(diào)控的基因包括7SL(SRP)RNA基因、穹窿體RNA基因、以及EB病毒（EpsteinBarr virus)編碼的小RNA(EBER)。
[0026] 7SLRNA是信號識別顆粒（SRP)的RNA組分，該信號識別顆粒介導(dǎo)分泌蛋白共翻譯 插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔中。其啟動子元件尤其表征于恩格勒特（Englert)等人，2004。
[0027] 穹窿體RNA是包含在參與大分子組裝和運(yùn)輸?shù)拇蟮募?xì)胞質(zhì)核糖核蛋白顆粒中的 小RNA。其啟動子元件尤其表征于莫辛克（Mossink)等人，2002。
[0028] EBER基因是具有未知功能的小RNA。EBER由在哺乳動物細(xì)胞中有效表達(dá)且其調(diào)控 啟動子元件被良好表征的EB病毒基因組編碼（豪（Howe)和舒（Shu)，細(xì)胞（Cell)，1989)。EBER具有兩種已知變體-EBER1和EBER2,EBER2以較高水平表達(dá)。
[0029]發(fā)明概沐
[0030] 發(fā)明人已將新型DNA構(gòu)建體工程化，以用于在新的且改進(jìn)的啟動子系統(tǒng)下，在真 核細(xì)胞，尤其是哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)tRNApyl基因。
[0031] tRNApyl基因序列具有兩個(gè)類似于真核A盒和B盒的內(nèi)部區(qū)域，其中B盒樣區(qū)域更 加類似功能性B盒。
[0032] 盡管先前重構(gòu)共有A-盒和B-盒的嘗試是不成功的，如漢考克等人（2010)和向井 等人（US8, 168, 407)所報(bào)道，但是發(fā)明人現(xiàn)已驚訝地發(fā)現(xiàn)，可更改tRNApyl序列以實(shí)現(xiàn)功 能化基因內(nèi)啟動子并且獲得能夠與WTpylRS結(jié)合介導(dǎo)有效的琥珀型抑制的tRNApyl。
[0033] 這種新tRNApyl基因可用于產(chǎn)生高活性且穩(wěn)定的細(xì)胞系，以用于將nnAA摻入到細(xì) 胞中。
[0034] 發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含有功能性基因內(nèi)啟動子元件的新的修飾的tRNApyl基因可 進(jìn)一步改進(jìn)，這通過將它們置于在4型啟動子下表達(dá)的基因的5'調(diào)控元件的下游，從而重 構(gòu)含有基因外和基因內(nèi)元件二者的功能性4型啟動子元件來實(shí)現(xiàn)。
[0035] 發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述tRNAglu基因和/或tRNAasp基因置于tRNApyl基 因上游且被更改成缺乏轉(zhuǎn)錄終止序列以便有效地形成雙順反子信息時(shí)，WT tRNApyl基因可 在tRNAglu基因和/或tRNAasp基因的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)。
[0036] 攜帶本發(fā)明的新型tRNApyl基因的串聯(lián)重復(fù)序列的DNA構(gòu)建體已顯示出導(dǎo)致增大 的琥珀型抑制。
[0037] 附圖簡要說明：
[0038] 圖 1.本發(fā)明的DNA構(gòu)建體（SEQIDNo:69-71)。
[0039] 圖2.來自馬氏甲燒八疊球菌（Methanosarcinamazei)的野生型tRNApyl的推測 性A-盒和B-盒區(qū)域（SEQIDNo: 3)。
[0040] 圖3.野生型和突變型馬氏甲烷八疊球菌（M.mazei)和巴氏甲烷八疊球菌 (M.barkeri)tRNApyl基因（分別為SEQIDNo:72、3、73、以及74)之間的序列比對。
[0041] 圖4.當(dāng)通過H1啟動子表達(dá)時(shí)，tRNA突變體保留功能，如通過琥珀型抑制依賴性 GFP表達(dá)所證明的。
[0042] 圖5.由包括基因內(nèi)polIII啟動子的突變型tRNApyl的使用所顯示的功能性tRNA 表達(dá)，如通過增大的琥珀型抑制依賴性GFP表達(dá)所證明的。
[0043] 圖6.tRNA突變體在哺乳動物細(xì)胞中是功能性的并且保留正交性。
[0044] 圖7.通過增加同一個(gè)構(gòu)建體中的基因數(shù)增加基因劑量導(dǎo)致增大的琥珀型抑制依 賴性GFP表達(dá)。
[0045] 圖8. 4型5'啟動子元件允許含有功能性B-盒的tRNA的表達(dá)，如通過琥珀型抑制 依賴性GFP表達(dá)所確定的。
[0046] 圖9. 4型5'啟動子元件和僅tRNAB突變體實(shí)現(xiàn)比野生型tRNA更高水平的tRNA 功能。
[0047] 圖10.通過增加同一個(gè)構(gòu)建體中的基因數(shù)增加基因劑量導(dǎo)致增大的琥珀型抑制 依賴性GFP表達(dá)。
[0048] 圖11.由上游tRNAglu和tRNAasp基因驅(qū)動的tRNApyl表達(dá)。
[0049] 序列表簡沭:
[0050]SEQIDNo 1 :tRNApyl 巴氏甲燒八疊球菌（Methanosarcinabarkeri)，WT
[0051]SEQIDNo 2 :tRNApyl 乙酸甲燒八疊球菌（Methanosarcinaacetivorans)，WT
[0052] SEQIDNo 3 :tRNApyl 馬氏甲燒八疊球菌（Methanosarcinamazei)，WT
[0053] SEQIDNo 4 :tRNApyl 布氏甲燒八疊球菌（Methanococcoidesburtonii)，WT
[0054] SEQIDNo 5 :tRNApyl 哈氏脫硫桿菌（Desulfobacteriumhafniense)，WT
[0055] SEQIDNo6 :用于野生型和突變型A-盒和/或B-盒tRNApyl構(gòu)建體的終止子序 列
[0056] SEQIDNo 7 :tRNApyl 馬氏甲烷八疊球菌 A10G突變，tRNA-Al
[0057] SEQIDNo 8 :tRNApyl 馬氏甲烷八疊球菌 A10G、A52C突變，tRNA-AB
[0058] SEQIDNo 9 :tRNApyl 馬氏甲烷八疊球菌 A52C突變，tRNA-B
[0059] SEQIDNo 10 :tRNApyl馬氏甲烷八疊球菌A10G、T14A、A52C突變，tRNA-A2B
[0060] SEQIDNo 11 :tRNApyl馬氏甲烷八疊球菌A10G、T14A突變，tRNA-A2
[0061] SEQIDNo 12 :7SL啟動子5'區(qū)域序列
[0062]SEQIDNo 13 :7SL構(gòu)建體中使用的間隔子
[0063] SEQIDNo 14 :7SLtRNA-WT構(gòu)建體
[0064] SEQIDNo 15 :7SLtRNA-B構(gòu)建體
[0065] SEQIDNo 16 :7SLtRNA-Al構(gòu)建體
[0066] SEQIDNo 17 :7SLtRNA-AB構(gòu)建體
[0067] SEQIDNo 18 :7SLtRNA-A2B構(gòu)建體
[0068] SEQ ID No 19 :7SL、穹窿體、EBER構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0069] SEQIDNo 20 :穹窿體啟動子5'區(qū)域序列
[0070] SEQ ID No 21 :用于穹窿體構(gòu)建體的間隔子
[0071] SEQIDNo 22 :穹窿體tRNA-WT構(gòu)建體
[0072]SEQIDNo 23 :穹窿體tRNA-B構(gòu)建體
[0073] SEQIDNo 24 :穹窿體tRNA-AB構(gòu)建體
[0074] SEQIDNo 25 :穹窿體tRNA_A2B構(gòu)建體
[0075] SEQIDNo 26 :EBER2 啟動子 5' 區(qū)序列
[0076] SEQIDNo27 :EBER構(gòu)建體中使用的間隔子
[0077] SEQIDNo 28 :EBER2tRNA-WT構(gòu)建體
[0078] SEQIDNo 29 :EBER2tRNA-B構(gòu)建體
[0079] SEQIDNo 30 :EBER2tRNA-Al構(gòu)建體
[0080] SEQIDNo 31 :EBER2tRNA-AB構(gòu)建體
[0081] SEQIDNo32 :EBER2tRNA-A2B構(gòu)建體
[0082]SEQIDNo 33 :H1 啟動子序列
[0083] SEQIDNo 34 :H1tRNA-WT構(gòu)建體
[0084] SEQIDNo 35 :H1tRNA-B構(gòu)建體
[0085] SEQIDNo 36 :H1tRNA-Al構(gòu)建體
[0086] SEQIDNo 37 :H1tRNA-A2 構(gòu)建體
[0087] SEQIDNo 38 :H1tRNA-A2B構(gòu)建體
[0088] SEQIDNo 39 :l-tRNA構(gòu)建體中使用的終止子序列：
[0089] SEQIDNo 40 :小家鼠（M.Musculus)tRNAglu編碼序列
[0090] SEQ ID No 41 :具有上游和下游區(qū)域的小家鼠tRNAglu編碼序列
[0091] SEQIDNo 42 :tRNAglu-tRNApylDNA構(gòu)建體
[0092] SEQIDNo 43 :3XtRNAglu-tRNApyl:包括雙順反子構(gòu)建體的3個(gè)重復(fù)序列的DNA 構(gòu)建體。
[0093] SEQIDNo 44 :用于tRNAglu-pyl構(gòu)建體的前導(dǎo)序列
[0094] SEQIDNo 45 :tRNAglu_pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0095] SEQIDNo 46 :tRNAglu_pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0096] SEQIDNo 47 :tRNAglu_pyl構(gòu)建體中使用的基因間序列
[0097] SEQIDNo 48 :小家鼠tRNAasp編碼序列
[0098] SEQIDNo 49 :具有上游和下游區(qū)域的小家鼠tRNAasp編碼序列
[0099] SEQIDNo5〇:tRNAasp_pylDNA構(gòu)建體
[0100] SEQIDNo 51 :2XtRNAasp-pyl:包括雙順反子構(gòu)建體的2個(gè)重復(fù)序列的DNA構(gòu)建 體
[0101] SEQIDNo 52 :tRNAasp-pyl構(gòu)建體中使用的前導(dǎo)序列
[0102] SEQIDNo 53 :tRNAasp_pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0103] SEQIDNo 54 :tRNAasp_pyl構(gòu)建體中使用的基因間序列
[0104] SEQIDNo 55 :人tRNAglu編碼序列
[0105] SEQIDNo 56 :人tRNAasp編碼序列
[0106] SEQIDNo 57 :7SL啟動子變體：7SL-1
[0107] SEQIDNo 58 :7SL啟動子變體：7SL-2
[0108] SEQIDNo 59 :7SL啟動子變體：SL28
[0109] SEQIDNo 60 :7SL啟動子變體：7L63
[0110] SEQIDNo 61 :7SL啟動子變體：7L23
[0111] SEQIDNo 62 :7SL啟動子變體：7L7
[0112] SEQIDNo 63:EBER啟動子變體：EBER1
[0113] SEQIDNo 64 :穹窿體啟動子變體：Hvg3
[0114] SEQIDNo 65 :穹窿體啟動子變體：Hvg2
[0115] SEQIDNo 66 :馬氏甲烷八疊球菌pylRS氨基酸序列
[0116] SEQIDNo 67 :馬氏甲烷八疊球菌pylRS核苷酸序列
[0117] SEQIDNo 68 :短間隔區(qū)
[0118] SEQIDNo 69 :圖1中所示的DNA構(gòu)建體
[0119] SEQIDNo 70 :圖1中所示的DNA構(gòu)建體
[0120] SEQIDNo 71 :圖1中所示的DNA構(gòu)建體
[0121] SEQIDNo 72 :圖3中所示的DNA序列
[0122] SEQIDNo 73 :圖3中所示的DNA序列
[0123] SEQIDNo 74 :圖3中所示的DNA序列
[0124] SEQ ID No 75 :穹窿體啟動子的近側(cè)序列元件
[0125] SEQID No 76 :EBER啟動子的SP1結(jié)合位點(diǎn)
[0126] SEQID No 77 :EBER啟動子的ATF結(jié)合序列
[0127] 本發(fā)明的實(shí)施方式
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含tRNApyl編碼序列 和RNA聚合酶III啟動子序列，該構(gòu)建體能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)中起作用以表達(dá)足以支持無 義抑制（尤其是琥珀型抑制）的功能性tRNAPyl。
[0129] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的tRNApyl編碼序列缺乏最終的三個(gè)核苷酸CCA，這三個(gè)核苷酸在 真核細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄后添加。
[0130] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含在tRNApyl編碼序列下游的終止子序列。適當(dāng) 地，終止子序列由tRNA編碼序列3'的充當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止信號的4個(gè)或更多個(gè)胸腺嘧啶核苷核 苷酸的群組成。
[0131] 本發(fā)明的優(yōu)選終止子序列鑒定為SEQIDNo6、19、39、45、46以及53,尤其是SEQ IDNo. 6。
[0132] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含tRNApyl基因的2至60個(gè)重復(fù)序列。 優(yōu)選地，該DNA構(gòu)建體包含2至30個(gè)重復(fù)序列，更優(yōu)選地8個(gè)重復(fù)序列。
[0133] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含tRNApyl基因，該基因包含tRNApyl編碼序列， 以及功能性基因內(nèi)RNA聚合酶III啟動子。所述基因內(nèi)RNA聚合酶III啟動子包含兩個(gè)組 分-A盒和B盒。
[0134] 適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明提供一種DNA構(gòu)建體，其中tRNApyl基因含有在基因內(nèi)RNA聚合酶 III啟動子的A盒和/或B盒中的1或2個(gè)核苷酸位置上的突變。
[0135] 例如，本發(fā)明提供一種DNA構(gòu)建體，其中tRNApyl基因含有在B盒中的1或2 (例 如1)個(gè)核苷酸中的突變。
[0136] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該DNA構(gòu)建體包含tRNApyl基因，該基因包含基因內(nèi) PolIII啟動子，例如如圖1