專利名稱：利用大小分離技術(shù)分析核酸分子的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及分析核酸分子的方法和組合物，特別是涉及可在各種核酸反應(yīng)中利用的標(biāo)記物，其中需要按大小分離核酸分子。
檢測(cè)和分析核酸分子是生物學(xué)中最重要的技術(shù)之一。這些技術(shù)是分子生物學(xué)的核心并在其他生物學(xué)領(lǐng)域中的作用迅速擴(kuò)展。
總地說(shuō)來(lái)，一類分析核酸反應(yīng)的技術(shù)涉及按長(zhǎng)度分離核酸分子。例如，一項(xiàng)廣泛使用的技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(參見美國(guó)專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)已變成鑒定存在于樣品中的序列和為進(jìn)一步操作合成DNA分子的廣泛應(yīng)用的技術(shù)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，在PCR中，利用以幾何和線性方式合成新DNA鏈的酶促反應(yīng)擴(kuò)增DNA序列。擴(kuò)增后，必須檢測(cè)并鑒定DNA序列。因?yàn)槭欠翘禺愋詳U(kuò)增(否則擾亂分析)或須純化，所以須在檢測(cè)前分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物?；诋a(chǎn)物的大小(即長(zhǎng)度)分離時(shí)可得到最有用的信息。給出核酸分子的最高分率的方法是電泳分離。在該方法中，對(duì)適當(dāng)?shù)哪z加載各個(gè)PCR反應(yīng)物并經(jīng)受電壓?？杀惶幚淼臉悠窋?shù)目受凝膠中孔數(shù)的限制。在大多數(shù)凝膠裝置上，可在單一凝膠中分離大約10至64個(gè)樣品。因此，處理大數(shù)目的樣品是很麻煩和消耗材料的。
為了獲得數(shù)據(jù)，必須將電泳分離與某些檢測(cè)系統(tǒng)聯(lián)合起來(lái)。常用和幾乎唯一的核酸檢測(cè)系統(tǒng)是利用嵌入染料或放射活性標(biāo)記，在較少情況下用非放射活性標(biāo)記。嵌入染料如溴乙錠使用較簡(jiǎn)單。在電泳期間使染料包含在凝膠基質(zhì)中，或者在電泳之后將凝膠浸漬在含染料溶液中。某些情況下染料可直接顯示，但在更多情況下，特別是對(duì)溴乙錠來(lái)說(shuō)，則用光(如紫外光)激發(fā)出產(chǎn)生熒光。盡管這種標(biāo)記看來(lái)容易使用，但染料有很大的缺點(diǎn)。首先，染料不敏感，而且須使用大量核酸分子才能顯示產(chǎn)物。其次，染料是可引起突變或致癌的。
比染料更敏感的檢測(cè)技術(shù)是使用放射活性(或非放射活性)標(biāo)記。一般在PCR反應(yīng)中包括放射標(biāo)記的核苷酸或放射標(biāo)記的引物。分離后，以放射自顯影法“顯示”放射標(biāo)記。雖然更敏感，但檢測(cè)中有膠片限制的問(wèn)題，例如相關(guān)性喪失和非線性。可用磷影像分析來(lái)檢測(cè)標(biāo)記來(lái)克服這些限制。然而，放射標(biāo)記有安全要求，增加資源利用和必需專門化設(shè)備及人員訓(xùn)練。為此，使用非放射活性標(biāo)記已越來(lái)越普通。在這樣的系統(tǒng)中，核苷酸含有標(biāo)記，如熒光團(tuán)、生物素或洋地黃毒苷，其可用與生色底物有反應(yīng)性的酶標(biāo)記的抗體或其他分子(如配體對(duì)的另一成員)檢測(cè)。如上所述，這些系統(tǒng)并沒(méi)有上述安全性問(wèn)題，但使用不穩(wěn)定的成分并可產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致高的本底(即低信-噪比)。
本發(fā)明提供可用于多種核酸反應(yīng)的新的組合物及方法，并進(jìn)一步提供其他相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明提供可應(yīng)用于多種配體對(duì)反應(yīng)的組合物及方法，其中要求基于大小分離感興趣的分子，如核酸分子。在本文提供的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上可提高的代表性方法的例子包括，PCR、差異展示法、RNA指紋法、PCR-SSCP、寡聚物連接檢測(cè)法、核酸酶消化法(如基于外切和內(nèi)切核酸酶的檢測(cè)法)及雙脫氧指紋法?？稍诤軓V泛的領(lǐng)域里利用本文公開的方法，例如用于臨床或研究的診斷、多態(tài)性測(cè)定及遺傳圖譜的建立。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了鑒定核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)從一個(gè)或多個(gè)選擇的核酸分子產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定的核酸片段相互關(guān)聯(lián)的；并且是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按大小分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法和電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而鑒定核酸分子。
在本發(fā)明的相關(guān)方面內(nèi)，提供了檢測(cè)選定的核酸分子的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標(biāo)記的核酸探針與互補(bǔ)的所選靶核酸序列雜交的條件下使標(biāo)記的核酸探針與標(biāo)記的核酸分子結(jié)合足夠長(zhǎng)時(shí)間，其中標(biāo)記的核酸探針是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)改變雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子，或探針靶雜交體的大小；(c)按大小分離標(biāo)記的探針；(d)從標(biāo)記的探針上切掉標(biāo)記；以及(e)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定檢測(cè)選擇的核酸分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面內(nèi)，提供了對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定(genotyping)的方法，其包括以下步驟(a)從選擇的靶分子中產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定片段相互關(guān)聯(lián)的并可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)；(b)按序列長(zhǎng)度分離標(biāo)記的分子；(c)從標(biāo)記的分子上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定所說(shuō)生物體的基因型。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標(biāo)記分子與靶分子雜交的條件和時(shí)間下使標(biāo)記的核酸分子與選擇的靶分子結(jié)合，其中標(biāo)記是與特定的片段相互關(guān)聯(lián)并且可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按序列的長(zhǎng)度分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定生物體的基因型。
從本發(fā)明的上下文中應(yīng)理解到，“生物學(xué)樣品”不僅包括得自活生物體(例如哺乳動(dòng)物、魚、細(xì)菌、寄生蟲、病毒、真菌等)或環(huán)境(如空氣、水或固體樣品)的樣品，而且包括可人工或合成產(chǎn)生的生物學(xué)材料(例如噬菌體文庫(kù)、有機(jī)分子文庫(kù)、基因組克隆的集合體、cDNA克隆、RNA克隆等)。生物學(xué)樣品的代表性例子包括生物學(xué)液體(如血液、血清、腦脊液、尿液)、生物細(xì)胞(如干細(xì)胞、B或T細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)，以及生物組織。最后，可進(jìn)行基因型鑒定的生物體的代表性例子包括基本上任何單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，如溫血?jiǎng)游铩⒉溉閯?dòng)物或脊椎動(dòng)物(如人、黑猩猩、恒河猴、馬、牛、豬、羊、狗、貓、大鼠和小鼠以及它們的細(xì)胞)、細(xì)菌、寄生蟲、病毒、真菌及植物。
在上述方法的各個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)連接、裂解或延伸(如PCR)反應(yīng)產(chǎn)生本發(fā)明的核酸探針和/或分子。在其他相關(guān)方面，可用非3′標(biāo)記的寡核苷酸引物(例如5′標(biāo)記的寡核苷酸引物)或二脫氧核苷酸終止子標(biāo)記核酸探針或分子。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可在給定的反應(yīng)內(nèi)同時(shí)利用4、5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450或多于500個(gè)不同的和獨(dú)特標(biāo)記的分子。其中各個(gè)標(biāo)記對(duì)于選擇的核酸分子或片段或探針都是特有的，并可分別鑒定的。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，可用熒光法、質(zhì)譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恒電勢(shì)電流測(cè)定法(如利用庫(kù)侖檢測(cè)器或電流檢測(cè)器)檢測(cè)標(biāo)記。適當(dāng)?shù)墓庾V檢測(cè)技術(shù)的例子包括飛行時(shí)間質(zhì)譜法、四極質(zhì)譜法、磁扇形場(chǎng)質(zhì)譜、電扇形場(chǎng)質(zhì)譜法。這些技術(shù)的特定實(shí)例包括離子俘獲質(zhì)譜法、電噴射離子化質(zhì)譜法、離子噴射質(zhì)譜法、液體電離質(zhì)譜法、大氣壓流電離質(zhì)譜法、電子電離質(zhì)譜法、快原子轟擊電離質(zhì)譜法、MALDI質(zhì)譜法、光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法、激光小滴質(zhì)譜法、MALDI-TOF質(zhì)譜法、APCI質(zhì)譜法、納米噴射質(zhì)譜法、霧化噴射電離質(zhì)譜法、化學(xué)電離質(zhì)譜法、共振電離質(zhì)譜法、次級(jí)電離質(zhì)譜法和熱噴射質(zhì)譜法。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可利用區(qū)別分子大小(真正的線性大小或三維結(jié)構(gòu)大小)的方法將靶分子、雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子、探針靶雜交體，或標(biāo)記的核酸探針或分子與其他分子分離開。這些方法的代表性例子包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析、過(guò)濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳、液相層析、反向大小排阻層析、離子交換層析、反向液相層析、脈沖場(chǎng)電泳、倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)電泳、透析和熒光活化的液體小滴分選。另外，也可將靶分子、雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子、探針靶雜交體，或標(biāo)記的核酸探針或分子結(jié)合到固相載體(例如孔心纖維(Amicon Corporation,Danvers,Mass.)、小珠(Polysciences,Warrington,Pa.)、磁性小珠(Robbin Scientific,MaintainView,Calif.)、平板、平皿和燒瓶(Corning Glass Works,Corning,NY)、篩網(wǎng)(Becton,Dickinson,Mountain View,Calif.)、屏和固體纖維(參見Edelman等人的美國(guó)專利No.3,843,324；Kurode等人，美國(guó)專利No.4,416,777)、膜(Millipore Corp.,Bedford,Mass.)及浸量尺)上。在本發(fā)明的某些實(shí)例中，如果第一或第二個(gè)成員，或暴露的核酸被結(jié)合到固載體上，則本文公開的發(fā)明可進(jìn)一步包括洗滌未結(jié)合材料的固相載體的步驟。
在其他實(shí)施方案中，可用化學(xué)、氧化、還原、酸敏感性、堿敏感性、酶促、電化學(xué)、熱及光敏感性方法裂解標(biāo)記的核酸分子或探針。在其他實(shí)施方案中，可以連續(xù)的方式，例如在可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的單一裝置上完成分離、裂解和檢測(cè)步驟。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可用選自下列一組中的方法改變雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子，或探針靶雜交體的大小聚合酶延伸、連接、核酸外切酶消化、核酸內(nèi)切酶消化、限制性酶消化、位點(diǎn)特異性重組酶消化、連接、錯(cuò)配特異性核酸酶消化、甲基化性核酸酶消化、將探針共價(jià)連接到靶分子上以及雜交。
本文公開的方法和組合物可有多方面的應(yīng)用，例如包括鑒定PCR擴(kuò)增子、RNA指紋法、差異展示、單鏈構(gòu)型多態(tài)性檢測(cè)、二脫氧指紋法、限制性酶譜和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、DNA指紋法、基因型鑒定、突變檢測(cè)、寡核苷酸連接檢測(cè)、序列特異性擴(kuò)增，用于診斷、法醫(yī)、身份鑒定、發(fā)育生物學(xué)、生物學(xué)、分子醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、動(dòng)物育種。
參見下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些及其他方面將變得明顯。此外，下面列出的更詳細(xì)地描述某些方法步驟或物質(zhì)(例如質(zhì)粒等)的各種參考文獻(xiàn)被全文列入本文作為參考。


圖1顯示合成可化學(xué)裂解的質(zhì)譜檢測(cè)標(biāo)記物的五氟苯基酯(以釋放出帶羧基酰胺末端的標(biāo)記)的流程。
圖2顯示合成可化學(xué)裂解的質(zhì)譜檢測(cè)標(biāo)記物的五氟苯基酯(以釋放帶羧酸末端之標(biāo)記)的流程。
圖3-6和8顯示合成一組36個(gè)光化學(xué)可裂解之質(zhì)譜標(biāo)記的四氟苯基酯的流程。
圖7顯示合成一組36個(gè)末端為胺的光化學(xué)可裂解之質(zhì)譜標(biāo)記物的流程。
圖9顯示從相應(yīng)的一組36個(gè)光化學(xué)可裂解之質(zhì)譜標(biāo)記酸的四氟苯基酯制得的36個(gè)光化學(xué)可裂解的質(zhì)譜標(biāo)記的寡核苷酸的合成反應(yīng)步驟。
圖10顯示從一組36個(gè)末端為胺的光化學(xué)可裂解之質(zhì)譜標(biāo)記物制得的36個(gè)光化學(xué)可裂解的質(zhì)譜標(biāo)記寡核苷酸的合成反應(yīng)流程。
圖11舉例顯示用質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記。
圖12顯示單獨(dú)α-氰基基體的質(zhì)譜圖。
圖13顯示模式構(gòu)建的標(biāo)記的核酸片段。
如上面提到的，本發(fā)明提供分析核酸分子的方法和組合物，其中需要按大小分離核酸分子。本方法允許同時(shí)檢測(cè)包括核酸和片段、蛋白質(zhì)、肽等在內(nèi)的感興趣的分子。簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)方面提供其中感興趣的分子或其前體通過(guò)不穩(wěn)定鍵與標(biāo)記物連接的化合物。因此，本發(fā)明的化合物可用下列結(jié)構(gòu)通式表示T-L-X其中T是標(biāo)記部分，L是作為或含有不穩(wěn)定鍵的接頭部分，X是感興趣的分子(MOI)部分或可供以使MOI結(jié)合到T-L上的功能團(tuán)部分(Lh)。因此本發(fā)明的化合物可由下列更特異的通式代表T-L-MOI和T-L-Lh出于如下詳細(xì)描述的原因，可特意使幾組T-L-MOI經(jīng)受使不穩(wěn)定鍵斷裂的條件，而從化合物的其余部分上釋放出標(biāo)記部分。然后用一種或多種分析技術(shù)鑒定標(biāo)記部分的特征，從而提供有關(guān)標(biāo)記部分結(jié)構(gòu)的直接信息以及(更重要的)相應(yīng)的MOI鑒定的間接信息。
作為本發(fā)明有代表性的其中L為直接鍵的化合物的一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)例，可參見下列結(jié)構(gòu)(ⅰ)
在結(jié)構(gòu)(ⅰ)中，T是連接到羰基基團(tuán)上的合氮多環(huán)芳族殘基，X是MOI(更具體地講為以胺基團(tuán)為末端的核酸片段)，并且L是形成酰胺基團(tuán)的鍵。相對(duì)于T中的鍵來(lái)說(shuō)，如本領(lǐng)域所知，酰胺鍵是不穩(wěn)定的，酰胺鍵可受到不影響標(biāo)記部分內(nèi)鍵的酸或堿性條件的化學(xué)裂解(斷裂)。因此，可按下示方式釋放出標(biāo)記部分(即含有T的裂解產(chǎn)物)
然而，接頭L可能不只是如上實(shí)例中所示的直接鍵，在此可參見本發(fā)明的另一個(gè)具有下示構(gòu)(ⅱ)的代表性化合物
已知具有鄰位硝基芐胺殘基(見結(jié)構(gòu)(ⅱ)內(nèi)加方框的部分)是光解不穩(wěn)定的，在這些化合物暴露于特定波長(zhǎng)的光化幅射時(shí)將引起芐胺鍵的選擇性裂解(參見結(jié)構(gòu)(ⅱ)中標(biāo)有加重線的鍵)。因此，結(jié)構(gòu)(ⅱ)具有與結(jié)構(gòu)(ⅰ)相同的T和MOI基團(tuán)，但接頭基團(tuán)含有多個(gè)原子和鍵，其中有一特殊的不穩(wěn)定鍵。因此如下所示，結(jié)構(gòu)(ⅱ)的光解可從化合物的其余部分釋放出標(biāo)記部分(含T部分)。
因此本發(fā)明提供這樣的化合物，即在其遇有適當(dāng)?shù)牧呀鈼l件后經(jīng)受裂解反應(yīng)，從而從化合物的余留部分釋放出標(biāo)記部分?？捎脴?biāo)記部分、MOI(或其前體，Ln)以及將兩個(gè)基團(tuán)連接在一起的不穩(wěn)定鍵來(lái)描述本發(fā)明的化合物?；蛘?，可用形成化合物的各個(gè)組分來(lái)描述本發(fā)明的化合物。因此可將本發(fā)明的化合物描述為如下所述的標(biāo)記反應(yīng)物、接頭反應(yīng)物和MOI反應(yīng)物。
標(biāo)記反應(yīng)物由化學(xué)柄(Th)和可變部分(Tvc)組成，因而標(biāo)記反應(yīng)物可視為具有下列通式結(jié)構(gòu)Tvc-Th為了舉例說(shuō)明這一通式，可參見結(jié)構(gòu)(ⅲ)，其顯示可用于制備結(jié)構(gòu)(ⅱ)化合物的標(biāo)記反應(yīng)物。如下所示，具有結(jié)構(gòu)(ⅲ)的標(biāo)記反應(yīng)物含有標(biāo)記可變部分和標(biāo)記柄
在結(jié)構(gòu)(ⅲ)中，標(biāo)記柄(-C(=O)-A)簡(jiǎn)單地提供一個(gè)使標(biāo)記反應(yīng)物與接頭反應(yīng)物反應(yīng)形成T-L部分的通路。結(jié)構(gòu)(ⅲ)中的基團(tuán)“A”表示羧基基團(tuán)處于化學(xué)活性狀態(tài)，所以其很容易與其他柄偶聯(lián)。例如“A”可以是羥基或五氟苯氧基和許多其它基團(tuán)。如下文詳述的，本發(fā)明提供很多可與標(biāo)記可變部分結(jié)合的可能的標(biāo)記柄。因此標(biāo)記可變部分是式T-L-X中“T”的一部分，并且也將是從裂解L的反應(yīng)所形成的標(biāo)記部分的一部分。
也如下文詳細(xì)討論的，因?yàn)樵诎凑毡景l(fā)明制備各組化合物中，期望每組的成員有獨(dú)特的可變部分，所以如此命名標(biāo)記可變部分，從而得以用分析技術(shù)將個(gè)個(gè)成員彼此區(qū)分開。作為一個(gè)例子，結(jié)構(gòu)(ⅲ)的標(biāo)記可變部分可以是可根據(jù)紫外或質(zhì)譜區(qū)分開的下列一組中的成員
同樣，接頭反應(yīng)物可用其側(cè)翼連接有接頭不穩(wěn)定組分的化學(xué)柄(至少需要兩個(gè)，每個(gè)都稱為L(zhǎng)h)來(lái)描述，其中接頭不穩(wěn)定組分由要求的不穩(wěn)定部分(L2)和可能存在的不穩(wěn)定部分(L1和L3)組成，此時(shí)可能存在的不穩(wěn)定部分可有效地用于將L2與柄Lh分開，并且必要的不穩(wěn)定部分則用于在接頭不穩(wěn)定組分內(nèi)提供不穩(wěn)定鍵。因此，接頭反應(yīng)物可視為具有下列通式Lh-L1-L2-L3-Lh可就結(jié)構(gòu)(ⅳ)來(lái)舉例說(shuō)明用于描述接頭反應(yīng)物的通式，結(jié)構(gòu)(ⅳ)也是從結(jié)構(gòu)(ⅱ)的化合物得出的
如在結(jié)構(gòu)(ⅳ)中示例的那樣，原子可以起到一種以上的功能作用。因此在結(jié)構(gòu)(ⅳ)中，芐基氮在允許接頭反應(yīng)物通過(guò)酰胺形成反應(yīng)連接到標(biāo)記反應(yīng)物上的過(guò)程中發(fā)揮化學(xué)柄的功能，并且在繼后還可作為不穩(wěn)定部分L2的必要結(jié)構(gòu)部分，其中芐基碳-氮鍵對(duì)光裂解是特別敏感的。結(jié)構(gòu)(ⅳ)也說(shuō)明接頭反應(yīng)物雖沒(méi)有L1基團(tuán)，但可能有L3基團(tuán)(此處為亞甲基)。同樣，接頭反應(yīng)是可以有L1基團(tuán)但沒(méi)有L3基團(tuán)，或者可以有L1和L3基團(tuán)，或者可以沒(méi)有L1也沒(méi)有L3基團(tuán)。在結(jié)構(gòu)(ⅳ)中，存在靠近羰基基團(tuán)的基團(tuán)“P”，表明羰基基團(tuán)是受到保護(hù)不參予反應(yīng)的。給定這一構(gòu)型，標(biāo)記反應(yīng)物(ⅲ)的活化的羰基基團(tuán)即可徹底地與接頭反應(yīng)物(ⅳ)的胺基團(tuán)反應(yīng)，以形酰胺鍵并得到式T-L-Lh的化合物。
MOI反應(yīng)物是感興趣分子的適當(dāng)反應(yīng)活性形式。其中感興趣的分子是核酸片段，適當(dāng)?shù)腗OI反應(yīng)物是通過(guò)其5′羥基基團(tuán)結(jié)合到磷酸二酯基團(tuán)上，然后結(jié)合到以氨基基團(tuán)終止的亞烷基鏈上的核酸片段。然后該氨基基團(tuán)與結(jié)構(gòu)(ⅳ)的羰基基團(tuán)反應(yīng)(當(dāng)然是在使羰基去保護(hù)之后，并且最好是在繼后活化羰基基團(tuán)以有利于與胺基團(tuán)反應(yīng)之后)，從而使MOI連接到接頭上。
當(dāng)以時(shí)間先后次序考慮時(shí)，本發(fā)明可看作是用標(biāo)記反應(yīng)物(具有化學(xué)標(biāo)記柄和標(biāo)記可變部分)、接頭反應(yīng)物(具有兩個(gè)化學(xué)接頭柄、要求的不穩(wěn)定部分及0-2個(gè)可能存在的不穩(wěn)定部分)以及MOI反應(yīng)物(具有感興趣的分子組分和感興趣分子的化學(xué)柄)形成T-L-MOI。因此，為了形成T-L-MOI，首先使標(biāo)記反應(yīng)物和接頭反應(yīng)物一起反應(yīng)以提供T-L-Lh，然后使MOI反應(yīng)物與T-L-Lh反應(yīng)以提供T-L-MOI，或者(較不優(yōu)選)首先使接頭反應(yīng)物和MOI反應(yīng)物一起反應(yīng)以提供Lh-L-MOI，然后使Lh-L-MOI與標(biāo)記反應(yīng)物反應(yīng)以提供T-L-MOI。為方便起見，從可用于形成這類化合物的標(biāo)記反應(yīng)物、接頭反應(yīng)物及MOI反應(yīng)物的角度來(lái)描述式T-L-MOI的化合物。當(dāng)然，也可用其他(通常是更麻煩的)方法來(lái)制備式T-L-MOI的同樣化合物，并落入本發(fā)明T-L-MOI化合物的范圍之內(nèi)。
在任何情況下，本發(fā)明都使T-L-MOI化合物在經(jīng)受裂解條件時(shí)從化合物其余部分中釋放出標(biāo)記部分。標(biāo)記部分將至少包括標(biāo)記可變部分，并且典型地還包括來(lái)自標(biāo)記柄的某些或所有原子，來(lái)自被用于將標(biāo)記反應(yīng)物連接到接頭反應(yīng)物上的接頭柄的某些或所有原子，任選的不穩(wěn)定部分L1(如果該基團(tuán)存在于T-L-MOI中時(shí))，并將可能含有取決于L2之精確結(jié)構(gòu)和裂解化學(xué)性質(zhì)的必要不穩(wěn)定部分L2的某些部分。為方便起見，標(biāo)記部分可稱為含T部分，因?yàn)門一般將構(gòu)成標(biāo)記部分的主要部分(按質(zhì)量計(jì))。
在給出關(guān)于本發(fā)明一個(gè)方面的導(dǎo)論后，下文將詳細(xì)描述T、L和X各組分。這一描述是以某些術(shù)語(yǔ)的下述定義開始的，這些定義將在下文中用于描述T、L和X。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸片段”是指與選擇的核酸分子互補(bǔ)的(即互補(bǔ)于其全部或部分)，并可衍生于天然或合成或重組產(chǎn)生的分子，包括非天然存在的分子，有時(shí)可以是雙鏈或單鏈形式的；并包括寡核苷酸(如DNA或RNA)、引物、核酸類似物(如PNA)、借助聚合酶以5′至3′方向延伸的寡核苷酸、化學(xué)或酶促裂解的核酸、以二脫氧終止子終止的或在3′或5′末端帶帽以防止在5′或3′末端聚合的核酸，以及這些形式的組合。核酸片段與選擇的靶核酸分子互補(bǔ)一般是指在整個(gè)片段長(zhǎng)度上表現(xiàn)有至少約70％特異堿基配對(duì)。核酸片段較好表現(xiàn)有至少約80％特異性堿基配對(duì)；最好至少約90％。確定百分錯(cuò)配(從而百分特異堿基配對(duì))的方法是本領(lǐng)域已知的，并且是基于參照全堿基配對(duì)時(shí)作為Tm函數(shù)的百分錯(cuò)配。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”，無(wú)論單獨(dú)或聯(lián)合的，均指含有1-10，較好1-6個(gè)，最好1-4個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈烴殘基。這類殘基的例子包括但不只限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、癸基等。術(shù)語(yǔ)“亞烷基”是指飽和的含有1-10個(gè)，較好1-6個(gè)，最好1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴二基。這樣的殘基的例子包括但不只限于亞甲基、亞乙基(-CH2-CH2-)、亞丙基等。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”(單獨(dú)或結(jié)合的)是指在總共2-10個(gè)，較好2-6個(gè)，最好2-4個(gè)碳原子鏈中至少有1個(gè)碳-碳雙鏈的直鏈或支鏈烴基。這樣的基團(tuán)的例子包括但不只限于乙烯基、E和Z-丙烯基、異丙烯基、E-和Z-丁烯基、E-和Z-異丁烯基、E-和Z-戊烯基、癸烯基等。術(shù)語(yǔ)“亞鏈烯基”是指在總共2-10個(gè)，較好2-6個(gè)，最好2-4個(gè)碳原子鏈中至少有1個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括但不只限于次甲基(=CH2)，亞乙烯基(-CH=C-)、亞丙烯基(-CH2-CH=CH-)等。
術(shù)語(yǔ)“炔基”，無(wú)論單獨(dú)或組合使用，均指在總共2-10個(gè)，較好2-6個(gè)，最好2-4個(gè)碳原子鏈中至少有1個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴殘基。這樣的殘基的例子包括但不只限于乙炔基、丙炔基(炔丙基)、丁炔基、己炔基、癸炔基等。術(shù)語(yǔ)“亞炔基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指總共有2-10個(gè)，較好2-6個(gè)，最好2-4個(gè)碳原子的鏈中至少有1個(gè)碳一碳三鍵的直鏈或分支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括但不只限于亞乙炔基(-C≡C-)、亞丙炔基(-CH2-C≡C-)等。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”(單獨(dú)或組合的)是指含3至8個(gè)，較好3至6個(gè)碳原子的飽和的環(huán)形的碳原子排列。這樣的環(huán)烷基殘基的例子包括但不只限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。術(shù)語(yǔ)“環(huán)亞烷基”是指環(huán)烷基的雙基形式。
術(shù)語(yǔ)“芳基”是指(整個(gè)由碳和氫組成)選自苯基、萘基、茚基、2,3二氫化茚基、薁基、芴基和蒽基的碳環(huán)芳香基團(tuán)；或選自呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-噻二唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、1,3,5三噻烷基、中氮茚基、吲哚基、異吲哚基、3H-吲哚基、二氫吲哚基、苯并[b]呋喃基、2,3-二氫苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、2,3-二氮雜萘基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-二氮雜萘基、喋啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基和吩噁嗪基的雜環(huán)芳香基團(tuán)。
本申請(qǐng)中限定的“芳基”基團(tuán)可獨(dú)自含有1至4個(gè)取代基，其獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、鏈烯基、炔基、氰基、羧基、烷氧羰基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、鏈烯氧基或炔氧基、烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基、脂族或芳族酰基、烷氧羰基氨基、烷基磺酰氨基、嗎啉代羰基氨基、硫代嗎啉代羰基氨基、N-烷基胍基、芳烷氨基磺酰基；芳烷氧基烷基；N-芳烷氧基脲；N-羥基脲；N-鏈烯基脲；N,N-(烴基，羥基)脲；雜環(huán)基；硫代芳氧基取代的芳基；N,N-(芳基、烷基)肼基；Ar′取代的磺?；s環(huán)基；芳烷基取代的雜環(huán)基；環(huán)烷基和環(huán)烯基取代的雜環(huán)基；環(huán)烷基縮合的芳基；芳氧基取代的烷基；雜環(huán)基氨基；脂族或芳族?；被驶?；脂族或芳族?；〈逆溝┗?；Ar′取代的氨基羰基氧基；Ar′,Ar′-二取代的芳基；脂族或芳族?；〈孽；?；環(huán)烷基羰基烷基；環(huán)烷基取代的氨基；芳氧基羰基烷基；二氨基磷酸或酯。
“Ar”是具有1至3個(gè)取代基的如上文定義的碳環(huán)或雜環(huán)芳基，所述取代取選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、鏈烯基、炔基、1,2-二氧亞甲基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、烷氨基、鏈烯基氨基或炔基氨基、烷基羰氧基、脂族或芳族?；?、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷基磺酰氨基、N-烷基或N,N-二烷基脲。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”單獨(dú)或聯(lián)合均指烷基醚殘基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義同上。適當(dāng)?shù)耐榛褮埢睦影ǖ恢幌抻诩籽趸?、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等?br> 術(shù)語(yǔ)“鏈烯氧基”單獨(dú)或聯(lián)合均指式鏈烯基-O-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”定義同上，但條件是該殘基不是烯醇醚。適當(dāng)?shù)逆溝┭趸鶜埢睦影ǖ恢幌抻谙┍趸?、E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基等。
術(shù)語(yǔ)“炔氧基”單獨(dú)或合用均指式炔基-O-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“炔基”定義同上，但條件是該殘基不是炔醇醚。適當(dāng)?shù)娜惭趸鶜埢睦影ǖ恢幌抻谌脖趸?-丁炔氧基等。
術(shù)語(yǔ)“硫代烷氧基”是指式烷基-S-的硫醚殘基，其中烷基定義同上。
術(shù)語(yǔ)“烷基氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指單一或二烷基取代的氨基殘基(即式烷基-NH-或(烷基)2-N-的殘基)，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義同上。適當(dāng)?shù)耐榛被鶜埢睦影ǖ恢幌抻诩装被?、乙氨基、丙氨基、異丙氨基、叔丁氨基、N,N-二乙氨基等。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯氨基”單獨(dú)或聯(lián)合均使用均指式鏈烯基-NH-或(鏈烯基)2N-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”定義同上，但條件是該殘基不是烯胺。這樣的鏈烯基氨基殘基的例子是烯丙氨基殘基。
術(shù)語(yǔ)“炔氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式炔基-NH-或(炔基)2N-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“炔基”定義同上，但條件是該殘基不是炔胺。這樣的炔氨基殘基的例子是炔丙氨基殘基。
術(shù)語(yǔ)“酰胺”是指-N(R1)-C(=O)-或-C(=O)-N(R1)-，其中R1定義為包括氫及其他基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“取代的酰胺”是指其中R1不是氫的狀態(tài)，而術(shù)語(yǔ)“未取代的胺”是指其中R1是氫的狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“芳氧基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式芳基-O-的殘基，其中芳基定義同前。芳氧基殘基的例子包括但不只限于苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等。
術(shù)語(yǔ)“芳氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式芳基-NH-的殘基，其中芳基的定義同上所述。芳氨基的例子包括但不只限于苯氨基(苯胺基)、萘氨基、2-,3-和4-吡啶氨基等。
術(shù)語(yǔ)“芳基縮合的環(huán)烷基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指與芳基殘基分享兩個(gè)相鄰原子的環(huán)烷基殘基，其中術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”和“芳基”定義同上。芳基縮合的環(huán)烷基殘基的例子是與苯縮合的環(huán)丁基殘基。
術(shù)語(yǔ)“烷基羰基氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式烷基-CONH的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義同上。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基羰基氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式烷基-OCONH-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義同上。
術(shù)語(yǔ)“烷基磺酰氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式烷基-SO2NH-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義同上。
術(shù)語(yǔ)“芳磺酰氨基”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式芳基-SO2-NH-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”的定義同上所述。
術(shù)語(yǔ)“N-烷基脲”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式烷基-NH-CO-NH-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“烷基”定義如上。
術(shù)語(yǔ)“N-芳基脲”單獨(dú)或聯(lián)合使用均指式芳基-NH-CO-NH-的殘基，其中術(shù)語(yǔ)“芳基”定義同上。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”單獨(dú)或結(jié)合使用是指氟、氯、溴和碘。
術(shù)語(yǔ)“烴殘基”是指只需要一個(gè)氫原子就可以成為獨(dú)立的穩(wěn)定分子的碳和氫的排布。因此，烴殘基在一個(gè)碳原子上有一個(gè)開放化合價(jià)位點(diǎn)，通過(guò)該位點(diǎn)烴殘基可結(jié)合到其他原子上。烴基的例子有烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基等。
術(shù)語(yǔ)“烴雙基”是指只需要兩個(gè)氫原子就可以成為獨(dú)立的穩(wěn)定分子的碳和氫的排布。因此，烴雙殘基在一個(gè)或兩個(gè)碳原子上有兩個(gè)開放化合價(jià)位點(diǎn)，通過(guò)該位點(diǎn)烴殘基可結(jié)合到其他原子上。烴雙基的例子有亞烷基、亞鏈烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基等。
術(shù)語(yǔ)“烴基”是指具有單一價(jià)位點(diǎn)整個(gè)由碳和氫組成的任何穩(wěn)定排布，借助價(jià)位點(diǎn)其結(jié)合到另一個(gè)部分上，因此包括烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、芳基(沒(méi)有雜原子摻入芳環(huán)中)、芳烷基、烷芳基等。烴殘基也稱為烴基。
術(shù)語(yǔ)“亞烴基”是指具有兩個(gè)價(jià)位點(diǎn)整個(gè)由碳和氫組成的任何穩(wěn)定的排布，借助價(jià)位點(diǎn)使之結(jié)合到其他部分上的，因此該術(shù)語(yǔ)包括亞烷基、亞鏈烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基、亞環(huán)鏈烯基、亞芳基(沒(méi)有雜原子摻入到亞芳環(huán)中)、芳基亞烷基、烷基亞芳基等。烴雙基也稱為亞烴基。
術(shù)語(yǔ)“烴基-O-亞烴基”是指結(jié)合到氧原子上的烴基基團(tuán)，其中氧原子同樣也在兩個(gè)使亞烴基基團(tuán)結(jié)合到其他部分上的價(jià)位點(diǎn)之一處結(jié)合到亞烴基基團(tuán)上。術(shù)語(yǔ)“烴基-S-亞烴基”、“烴基-NH-亞烴基”和“烴基-酰胺-亞烴基”具有等同的含義，只所說(shuō)的氧分別代之以硫、-NH-或酰胺基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“N-(烴基)亞烴基”是指其中兩個(gè)價(jià)位點(diǎn)之一結(jié)合到氮原子上，并且氮原子同時(shí)結(jié)合到氫和烴基基團(tuán)上的亞烴基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“N,N-二(烴基)亞烴基”是指其中兩個(gè)價(jià)位點(diǎn)之一結(jié)合到氮原子上，并且氮原子同時(shí)結(jié)合到兩個(gè)烴基基團(tuán)上的亞烴基基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“烴酰基-亞烴基”是指通過(guò)?；?-C(=O)-)基團(tuán)結(jié)合到亞烴基基團(tuán)的兩個(gè)價(jià)位點(diǎn)之一上的烴基基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烴基”和“雜環(huán)基”是指包括碳原子和多達(dá)4個(gè)的選自氧、氮、磷和硫和原子(稱為雜原子)的穩(wěn)定的環(huán)形排布。環(huán)排布可以是3-7個(gè)原子的單環(huán)形式的，或者是8-11個(gè)原子的雙環(huán)形式的。環(huán)可以是飽和或未飽和的(包括芳香環(huán))，并且可以是或不是苯縮合的。環(huán)中的氮和硫原子可以是任何氧化形式的，包括季銨化形式的氮。雜環(huán)烴基可以在任何內(nèi)環(huán)碳或雜原子處連接從而產(chǎn)生穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的雜環(huán)烴基包括含有1或2個(gè)氮雜原子的5-7元單環(huán)雜環(huán)。
取代的雜環(huán)烴基是指上文限定的雜環(huán)烴基，其中至少其一個(gè)環(huán)原子結(jié)合到伸出環(huán)的指定的取代基上。
就烴基和亞烴基基團(tuán)而言，術(shù)語(yǔ)“任何其中一個(gè)或多個(gè)氫被相等數(shù)目的氟取代的前述基團(tuán)的衍生物”是指含有碳、氫和氟子，但不含其他原子的分子。
術(shù)語(yǔ)“活化的酯”是含有可很容易被親核試劑如胺、醇或硫醇親核試劑取代的“離去基團(tuán)”的酯。這樣的離去基團(tuán)是已知的，并包括而不限于N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑、鹵素(鹵離子)、包括四氟苯氧基在內(nèi)的烷氧基、硫代烷氧基等。術(shù)語(yǔ)“被保護(hù)的酯”是指被蔽避的或以其它方法致無(wú)反應(yīng)性的酯基(如參見Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”)。
考慮到上述定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地理解本申請(qǐng)全文中所使用的其他化學(xué)術(shù)語(yǔ)。這些術(shù)語(yǔ)可以單獨(dú)使用或以其任何組合方式使用。殘基的優(yōu)選的或更優(yōu)選的鏈長(zhǎng)度適用于所有這些組合。A．標(biāo)記的核酸片段的產(chǎn)生如上文提到的，本發(fā)明的一個(gè)方面提供用于DNA測(cè)序的一般方案，其允許在每個(gè)泳道中使用16個(gè)以上的標(biāo)記；進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，可以檢測(cè)標(biāo)記并且如基于熒光的常規(guī)測(cè)序一樣，在按大小分離時(shí)讀出序列。該方案可適用于基于標(biāo)記分子的大小分離的任何DNA技術(shù)。以下更詳細(xì)地討論用于本發(fā)明的適當(dāng)標(biāo)記和接頭，以及測(cè)定核酸序列的方法。
1．標(biāo)記本文使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”一般是指用于專門鑒定“感興趣的分子”的化學(xué)部分，特別是指標(biāo)記可變部分以及標(biāo)記反應(yīng)物、標(biāo)記組分和標(biāo)記部分的可能與之緊密結(jié)合的部分。
可用于本發(fā)明的標(biāo)記具有以下幾個(gè)特性1)其能夠與所有其他標(biāo)記分開。與其他化學(xué)部分的這種區(qū)別可能是基于標(biāo)記的色譜行為(特別是在裂解反應(yīng)之后)、其光譜或電勢(shì)性質(zhì)或其某些組合?？捎糜趨^(qū)分標(biāo)記的光譜方法包括質(zhì)譜(MS)、紅外(IR)、紫外(UV)及熒光，其中優(yōu)選的是MS、IR和UV，并且MS是最優(yōu)選的光譜法。電勢(shì)電流法是優(yōu)選的電勢(shì)檢測(cè)法。
2)當(dāng)以10-22至10-6摩爾存在時(shí)即可檢測(cè)標(biāo)記。
3)標(biāo)記具有化學(xué)柄，通過(guò)該柄其可連接到MOI上，借以專門地鑒定之。連接可以是直接連到MOI上，或通過(guò)“接頭”基團(tuán)連接到MOI上。
4)標(biāo)記對(duì)于所有其經(jīng)受的操作，包括與MOI連接或與之裂解開，以及對(duì)其所連接的MOI的任何操作都是化學(xué)上穩(wěn)定的。
5)標(biāo)記對(duì)于其所連接的MOI上進(jìn)行的操作無(wú)明顯干擾。例如，如果標(biāo)記是連接到寡核苷酸上，標(biāo)記必須是對(duì)涉及寡核苷酸的任何雜交或酶促反應(yīng)(例如PCR測(cè)序反應(yīng))都沒(méi)有明顯干擾的。同樣，如果標(biāo)記是連接到抗體上，則它必須對(duì)該抗體的抗原識(shí)別沒(méi)有明顯的干擾。
欲用某些光譜或電勢(shì)測(cè)定法檢測(cè)的標(biāo)記部分應(yīng)具有提高該方法之檢測(cè)敏感性和特異性的性質(zhì)。典型地，標(biāo)記部分將具有那些性質(zhì)，因?yàn)檫@些性質(zhì)已被設(shè)計(jì)到標(biāo)記可變部分中，其一般將構(gòu)成標(biāo)記部分的主要部分。在下面的討論中，使用“標(biāo)記”一詞一般是指標(biāo)記部分(即含有標(biāo)記可變部分的裂解產(chǎn)物)，但也可以為是指標(biāo)記可變部分本身，因?yàn)槠錇樨?fù)責(zé)提供標(biāo)記部分中特異可檢測(cè)性質(zhì)的那部分。在式T-L-X的化合物中，“T”部分將含有標(biāo)記可變部分。標(biāo)記可變部分已被設(shè)計(jì)成可用例如質(zhì)譜法鑒定的成分，這樣T-L-X的“T”部分便可稱為Tms。同樣，含有T的T-L-X的裂解則可稱為含Tms的部分?？捎孟率鲑|(zhì)譜和電勢(shì)測(cè)定法鑒定含Tms部分的性質(zhì)。
a．MS標(biāo)記的特征當(dāng)標(biāo)記可用質(zhì)譜法分析時(shí)(即為MS可讀的標(biāo)記，本文也稱之為MS標(biāo)記或“含Tms部分”)，標(biāo)記的基本特征是其能夠被離子化。因此在設(shè)計(jì)MS可讀標(biāo)記中，于其中摻入可在MS中的離子化條件下攜帶正電荷或負(fù)電荷的化學(xué)功能團(tuán)是一個(gè)優(yōu)選要素。這一特征是提供改善的離子形成效率以及檢測(cè)的更大總體靈敏度，特別是在電噴射離子化過(guò)程中。支持離子化電荷的化學(xué)功能團(tuán)可來(lái)自Tms或L或這兩者。例如Sunner,J.等人(Anal.Chem,60:1300-1307(1988))描述了可提高質(zhì)譜法檢測(cè)分析物的相對(duì)靈敏度的因素。
有利于攜帶負(fù)電荷的優(yōu)選的功能團(tuán)是有機(jī)酸，如酚式羥基、羧酸、膦酸、磷酸、三唑、磺酰脲、全氟醇和磺酸。
有利于在離子化條件下帶正電荷的優(yōu)選的功能團(tuán)是脂族或芳香胺。賦予MS標(biāo)記以提高的可檢測(cè)性的胺功能團(tuán)包括季銨類(即具有4個(gè)鍵，每個(gè)都連到碳原子上的胺，參見Aebersold，美國(guó)專利No.5,240,859)和叔胺(即有各自連到碳原子上的3個(gè)鍵的胺，其包括例如存在于吡啶中的C=N-C基團(tuán)，參見Hess等人，Anal.Biochem,224:373,1995；Bures等人，Anal.Biochem.224:364,1995)。特別優(yōu)選的是位阻季胺。叔胺和季銨可以是烷基或芳基胺。含Tms部分必須帶有至少一個(gè)可離子化基團(tuán)，但也可具有一個(gè)以上的可離子化基團(tuán)。優(yōu)選的電荷狀態(tài)是每個(gè)標(biāo)記都是單一離子化的。因此，最好是每個(gè)含Tms部分(及每個(gè)標(biāo)記可變部分)都只含有單一的位阻胺或有機(jī)酸基團(tuán)。
可形成含Tms部分之一部分的適當(dāng)?shù)陌窔埢ㄏ率净鶊F(tuán)
用質(zhì)譜法鑒定標(biāo)記較好是基于其分子質(zhì)量對(duì)電荷的比例(m/z)。MS標(biāo)記的優(yōu)選分子質(zhì)量范圍是從大約100至2000道爾頓，含Tms部分較好有至少約250道爾頓的質(zhì)量，更好至少約300道爾頓，最好至少約350道爾頓。質(zhì)譜法一般難于區(qū)分具有低于約200-250道爾頓之母離子的殘片(取決于精密設(shè)備)，因此本發(fā)明的含Tms部分最好有大于上述范圍的質(zhì)量。
如上面解釋的，含Tms部分可含有存在于標(biāo)記可變部分中的原子以外的原子，并確實(shí)不存在可Tms本身中的原子。因此，Tms本身的質(zhì)量可小于約250道爾頓，只要含Tms部分具有至少約250道爾頓的質(zhì)量即可。因此，Tms的質(zhì)量范圍可為15(即甲基)至約10,000道爾頓，較好是100至大約5,000道爾頓，最好是大約200至大約1,000道爾頓。
當(dāng)標(biāo)記摻入有一種以上具明顯豐度之同位素的原子時(shí)，用質(zhì)譜法分辨這些標(biāo)記就比較困難。因此，欲進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的優(yōu)選T基團(tuán)(Tms基團(tuán))含有碳，氫和氟中至少一種，以及可能有的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。雖然Tms中可存在其他原子，但它們的存在有時(shí)會(huì)使質(zhì)譜數(shù)據(jù)更難以分析。Tms基團(tuán)中除氫和/或氟外，最好只有碳、氮和氧原子。
氟在Tms基團(tuán)中是可能有的甚至優(yōu)選的原子。與氫相比，當(dāng)然氟要重得多。因此，氟而不是氫原子的存在使Tms基團(tuán)有更高的質(zhì)量，從而使T上SM基團(tuán)達(dá)到并超過(guò)如上文所述的預(yù)期的大于250道爾頓的質(zhì)量。此外，用氟取代氫可使含Tms部分有更大的揮發(fā)性，并且當(dāng)使用質(zhì)譜法作為檢測(cè)方法時(shí)分析物有更大的揮發(fā)性可提高檢測(cè)的靈敏度。
Tms的分子式落入C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ的范圍之內(nèi)，式中α、β和δ的總和足以飽和C、N、O、S和P原子的未飽和價(jià)。C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ是指Tms含有至少一個(gè)，并可含有從1至500任何數(shù)目的碳原子，此外還可任意地含有多至100個(gè)氮原子(“N0-”是Tms不需含有任何氮原子)、多至100個(gè)氧原子，以及多至10個(gè)硫原子和多至10個(gè)磷原子。符號(hào)α、β和δ代表Tms中氫、氟和碘原子的數(shù)目，這些數(shù)目中的任何兩個(gè)都可能是0，并且這些數(shù)目的總和等于C、N、O、S和P原子的總的未飽和的價(jià)數(shù)。Tms優(yōu)選具有落入C1-50N0-10O0-10HαFβ范圍內(nèi)的分子式，其中α和β的總和分別等于存在于該部分中的氫和氟原子的數(shù)目。
b．IR標(biāo)記的特征有機(jī)化學(xué)基團(tuán)的IR檢測(cè)有兩種基本形式隨機(jī)掃描IR和吸收IR。隨機(jī)掃描IR光譜和吸收IR光譜是互補(bǔ)的光譜法。一般說(shuō)來(lái)，喇曼激發(fā)取決于鍵極性改變，而IR吸收則取決于鍵偶極性改變。弱IR吸收線變成強(qiáng)喇曼線，且反之亦然。波數(shù)是IR光譜的特征性單位。IR標(biāo)記有3個(gè)不同應(yīng)用的光譜區(qū)在12500至4000cm-1處的近IR,4000至600cm-1處的中IR,600至30cm-1處的遠(yuǎn)IR。為了本文所述的以化合物作為鑒定MOI、探針或引物的標(biāo)記的應(yīng)用，應(yīng)優(yōu)選中紅外光譜區(qū)。例如，羧酸、羧酸酯和酰胺、碳酸烷基和芳基酯、氨基甲酸酯和酮應(yīng)檢測(cè)羰基伸縮(1850至1750cm-1)。N-H彎曲(1750至160cm-1)將用于鑒定胺、銨離子和酰胺。在1400至1250cm-1，檢測(cè)R-OH彎曲以及酰胺中的C-N伸縮。在900至690cm-1檢測(cè)芳族取代方式(ArNH2的C-H彎曲，N-H彎曲)。飽和的C-H、烯烴、芳環(huán)、雙和三鍵、酯、縮醛、縮酮、銨鹽、N-O化合物和肟、硝基、N-氧化物和硝酸酯、偶氮、腙、苯醌、羧酸、酰胺，以及內(nèi)酰胺都具有振動(dòng)紅外相關(guān)性數(shù)據(jù)(參見Pretsch et al.,有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定的光譜數(shù)據(jù)，Springer-Verlag,New York,1989)。優(yōu)選的化合物應(yīng)包括在2230至2210cm-1表現(xiàn)出很強(qiáng)的伸縮振動(dòng)的芳族腈。其他有用類型的化合物是具有在2140和2100cm-1之間產(chǎn)生尖銳吸收帶之強(qiáng)伸縮振動(dòng)的芳族炔。第三種類型的化合物是在2160至2120cm-1區(qū)表現(xiàn)有強(qiáng)吸收帶的芳族疊氮化物。硫氰酸酯是在2275至2263cm-1有強(qiáng)吸收的有代表性的化合物。
c．UV標(biāo)記的特征Scott在其著作(天然產(chǎn)物紫外光譜的解析,Permagon Press,NewYork,1962)中給出了有機(jī)發(fā)色團(tuán)類型和它們各自的紫外可見光特征的匯編。發(fā)色團(tuán)是負(fù)責(zé)特定光吸收的原子或原子群或電子群。對(duì)共軛系統(tǒng)中的π至π*最大吸收存在經(jīng)驗(yàn)規(guī)則(參見Pretsch等，有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定的光譜數(shù)據(jù)，p.B65和B70,Springer-Verlag,New York,1989)。優(yōu)選的化合物(用共軛系統(tǒng))應(yīng)具有n至π*和π至π*轉(zhuǎn)換。這樣的化合物的例子是酸性紫T、吖啶橙、吖啶黃G、亮蘭G、剛果紅、結(jié)晶紫、孔雀綠草酸鹽、間胺黃、亞甲藍(lán)、甲基橙、甲基紫B、萘酚綠B、油藍(lán)N、油紅O、4-苯偶氮酚、藏紅、溶劑綠3和蘇丹橙G，所有這些化合物都是可以市場(chǎng)上得到的(Aldrich,Milwaukee,WD。例如Jane,I.等，J.Chrom.323:191-225(1985)中列出了其他一些適用的化合物。
d．熒光標(biāo)記的特征熒光探針大多直接根據(jù)吸收度和熒光發(fā)射波長(zhǎng)及強(qiáng)度鑒定和定量分析。發(fā)射光譜(熒光和磷光)比吸收光譜更加敏感，并得以更特異的檢測(cè)。其他光物理學(xué)特征如受激狀態(tài)半壽期和熒光各向異性則使用不那么廣泛。通常最有用的強(qiáng)度參數(shù)是吸收的摩爾消光系數(shù)(ε)和熒光的量子產(chǎn)率(QY)。在單一被長(zhǎng)處ε的值是特定的(通常是探針吸收最大值)，而QY則是通過(guò)整個(gè)熒光光譜分布圖的總光電發(fā)射的度量。熒光激發(fā)(通過(guò)吸收)通常使用窄的光學(xué)帶寬(＜20nm)，而熒光檢測(cè)帶寬的可變度大得多，其最大靈敏度范圍從全譜帶到最大分辨率的窄譜帶(～20nm)。每種探針?lè)肿拥臒晒鈴?qiáng)度是與δ和QY的乘積成正比的。在同前有實(shí)際應(yīng)用重要性的熒光團(tuán)中，這些參數(shù)的范圍是δ約為10,000至100,000cm-1M-1,QY為0.1至1.0?？捎米鳠晒鈽?biāo)記的化合物是熒光素、若丹明、λ藍(lán)470、λ綠、λ紅664、λ紅665、吖啶橙和碘化Propidium，這些化合物均可從Lambda Fluorescence Co.(Pleasant Gap.PA)購(gòu)得。熒光化合物例如尼羅紅、德克薩斯紅、麗絲胺TM、BODIPYTM則可從MolecularProbe(Eugene,OR)購(gòu)得。
e．電勢(shì)標(biāo)記的特征電化學(xué)檢測(cè)(ECD)的原理是基于在某些外加電壓下化合物氧化或還原，供出或接受電子而產(chǎn)生可被檢測(cè)的電流。當(dāng)某些化合物經(jīng)受電位差時(shí)，分子在工作電極表面經(jīng)受到分子重排，丟失(氧化)或獲得(還原)電子，這樣的化合物可以說(shuō)是電活性的并經(jīng)受電化學(xué)反應(yīng)。在HPLC洗脫液通過(guò)電極流動(dòng)時(shí)，EC檢測(cè)器在電極表面施加電壓。從柱上洗脫的電活性化合物供出電子(氧化)或獲得電子(還原)同時(shí)產(chǎn)生電流峰。重要的是，所產(chǎn)生的電流量取決于分析物的濃度和所施加的電壓，每種化合物均具有其開始氧化或還原所需特異性電壓。目前最通用的電化學(xué)檢測(cè)器是電流檢測(cè)器，其中電勢(shì)保持恒定并在其后檢測(cè)由電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電流。這種類型的光譜測(cè)定法目前稱為“恒電位電流測(cè)法”。市售安培計(jì)可得自ESA，Inc.，Chelmford，MA。
當(dāng)檢測(cè)效率為100％時(shí)，特異化檢測(cè)器稱為“庫(kù)侖檢測(cè)器”。就選擇性和靈敏度來(lái)說(shuō)，庫(kù)侖檢測(cè)器具有許多實(shí)踐優(yōu)點(diǎn)，從而使此類檢測(cè)器特別適用于一個(gè)陣列中。在庫(kù)侖檢測(cè)器中，對(duì)于給定的分析物濃度，將信號(hào)電流作為對(duì)工作電極外加電勢(shì)(電壓)的函數(shù)作圖。所得到的S形曲線圖稱為電流-電壓曲線或流體動(dòng)力電壓電流圖(HDV)。HDV允許最好地選擇對(duì)工作電極施加的電勢(shì)，以使所觀察到的信息達(dá)到最大。ECD的主要優(yōu)點(diǎn)是其固有的靈敏度，檢測(cè)的電流水平在亞非摩爾(10-15摩爾)范圍。
包括許多生物化學(xué)品、藥物及殺蟲劑在內(nèi)的大量化學(xué)物質(zhì)及化合物都是有電化學(xué)活性的。即使它們的半波電勢(shì)(最大信號(hào)半數(shù)值時(shí)的電勢(shì))只有30-60mV的差異，仍可有效地分辨層析共洗脫的化合物。
最近發(fā)展的庫(kù)侖傳感器當(dāng)在基于液相層析的分離中用作檢測(cè)器時(shí)，可選擇性地鑒定和分辨共洗脫化合物。因此這些陣列化的檢測(cè)器還可補(bǔ)加在檢測(cè)器本身中完成的另一組分離。目前的儀器具有原則上只受獲得數(shù)據(jù)的速率限制的16個(gè)波道?？稍贓C陣列上分辨的化合物的數(shù)目是受層析限制的(即受板數(shù)限制)。然而，如果層析共洗脫的兩種或多種化合物的半波電位差為30-60mV，則該陣列即能夠區(qū)分之?；衔锍蔀殡娀瘜W(xué)活性化合物的能力有賴于其具有EC活性基團(tuán)(即-OH、-O、-N、-S)。
已使用庫(kù)侖檢測(cè)器成功地檢測(cè)的化合物包括5-羥基色胺、3-甲氧基-4-羥苯基乙二醇、尿黑酸、多巴胺、變腎上腺素、3-羥犬尿氨酸、乙酰米諾芬(acetominophen)、3-羥色醇、5-羥吲哚基乙酸、苯酚、鄰甲酚、焦培酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、2,4-二硝基苯酚、4,6-二硝基甲酚、3-甲基-2-硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、2,6-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、5-甲基苯酚、4-甲基-2-硝基苯酚、2-羥苯胺、4-羥苯胺、1,2-苯二胺、苯并兒茶素、巴特隆、chlortholuron、敵草隆、isoproturon、利谷隆、methohromuron、麥多隆、綠谷隆、monuron、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、4-氨基苯甲酸、4-羥苯甲酸、4-羥香豆酸、7-甲氧基香豆素、5,7,4′-三羥黃酮、黃岑苷元、咖啡酸、兒茶素、矢車菊苷、綠原酸、大豆黃素、野麻根素、洋蕪荽黃素、表兒茶素沒(méi)食子酸鹽、表加蘭兒茶素、表加藍(lán)兒茶素沒(méi)食子酸鹽、丁子香酚、半齒澤蘭素、阿魏酸、非瑟酮、高良姜精、沒(méi)食子酸、桅子寧、染料木黃酮、龍膽酸、桔皮苷、鳶尾配基、莰非醇、無(wú)色花青素、藤黃菌素、楝子素、桑色素、楊梅黃酮、柚皮苷、柚皮素-7-蕓香糖苷、花葵素、甲基花青素、根皮素、紅車軸草異丙酮、原兒茶酸、鼠李黃素、槲皮素、櫻花素、黃芩配基、莨菪亭、丁香醛、丁香酸、柑桔黃酮、troxerutin、傘形酮、香草酸、1,3-二甲基四氫異喹啉、6-羥多巴胺、r-豬毛菜醇、N-甲基-豬毛菜醇、四氫異喹啉、阿米替林、阿林嗎啡、辣椒辣素、氯氮、氯丙嗪、道諾紅菌素、地昔帕明、多塞平、氟西汀、氟西泮(氟安定)、米帕明、異丙基腎上腺素、甲氧明、嗎啡、嗎啡-3-葡糖苷酸、去甲替林、奧沙西泮(去甲羥安定)、苯福林(去氧腎上腺素)、曲米帕明、抗壞血酸、N-乙酰-5-羥色胺、3,4-二羥芐胺、3,4-二羥扁桃酸(DOMA)、3,4-二羥苯乙酸(DOPAC)、3,4-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羥苯基乙二醇(DHPG)、3-羥基氨茴酸、2-羥基苯乙酸(2HPAC)、4-羥苯甲酸(4HBAC)、5-羥吲哚-3-乙酸(5HIAA)、3-羥犬尿氨酸、3-羥偏桃酸、3-羥-4-甲氧基苯乙胺、4-羥苯乙酸(4HPAC)、4-羥苯基乳酸(4HPLA)、5-羥色氨酸(5HTP)、5-羥色醇(5HTOL)、5-羥色胺(5HT)、5-羥色胺硫酸鹽、3-甲氧基-4-羥苯基乙二醇(MHPG)、5-甲氧基色胺、5-甲氧基色氨酸、5-甲氧基色醇、3-甲氧基酪胺(3MT)、3-甲氧基酪氨酸(3-OM-DOPA)、5-甲基半胱氨酸、3-甲基鳥嘌呤、蟾毒色胺、多巴胺、多巴胺-3-葡糖苷酸、巴多胺-3-硫酸酯、多巴胺-4-硫酸酯、腎上腺素、麻黃寧、葉酸、谷胱苷肽(還原態(tài))、鳥嘌呤、鳥苷、尿黑酸(HGA)、高香草酸(HVA)、高香草醇(HVOL)、高藜蘆酸、硫酸hva、次黃嘌呤、吲哚、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、犬尿氨酸、褪黑素、變腎上腺素、N-甲基色胺、N-甲基酪胺、N,N-二甲基色胺、N,N-二甲基酪胺、去甲腎上腺腎、去甲變腎上腺素、章魚胺、吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆胺、脫氧腎上腺素、色醇、色胺、酪胺、尿酸、香草扁桃酸(vma)、黃嘌呤及黃苷。其他化合物如可參見Jane,I.等,J.Chrom.323:191-225(1985)和Musch,G.等，J.Chrom.348:99-110(1985)?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法將這些化合物摻入到式T-L-X的化合物中。例如，具有羧酸基團(tuán)的化合物可與胺、羥基等反應(yīng)以形成酰胺、酯及T和L間的其他鍵合。
除上述性質(zhì)外，無(wú)論打算使用什么檢測(cè)方法，標(biāo)記都最好具有模式化學(xué)結(jié)構(gòu)。這將有助于使用組合化學(xué)技術(shù)構(gòu)建大數(shù)目的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的標(biāo)記。例如，希望Tms有幾種性質(zhì)。期望當(dāng)以質(zhì)譜法檢測(cè)含Tms部分時(shí)，其含有支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)(更簡(jiǎn)單地稱為“質(zhì)譜靈敏度增強(qiáng)”基團(tuán)，或簡(jiǎn)稱為MSSE)。另外，希望以其作為含Tms部分的家族中的一個(gè)成員，該家族的每個(gè)成員都有不同的質(zhì)量/電荷比例，而在質(zhì)譜檢測(cè)中又有差不多同樣的靈敏度。因此，希望該家族的成員有同樣的MSSE。為了得以產(chǎn)生化合物的家族，已發(fā)現(xiàn)可通模式合成路線方便地產(chǎn)生標(biāo)記反應(yīng)物，因而可將標(biāo)記成分本身看作是含有模式的。
對(duì)于Tms基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，一個(gè)優(yōu)選的模式是Tms具有下列通式T2-(J-T3)n-其中T2是從碳和一個(gè)或多個(gè)氫、氟、碘、氧、氮、硫和磷形成的具有15至500道爾頓的質(zhì)量范圍的有機(jī)殘基；T3是從碳和一個(gè)或多個(gè)氫、氟、碘、氧、氮、硫和磷形成的具有50至1000道爾頓的質(zhì)量范圍的有機(jī)殘基；J是直接鍵，或諸如酰胺、酯、胺、硫醚、醚、硫代酯、二硫化物、硫代醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、西夫堿、還原態(tài)西夫堿、亞胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、磺酸酯、氨磺?；蛱?碳鍵的功能團(tuán)；n是1至50的整數(shù)，這樣當(dāng)n大于1時(shí)，每個(gè)T3和J都是獨(dú)立選擇的。
模式結(jié)構(gòu)T2-(J-T3)n-提供了進(jìn)入T-L-X化合物家族的方便途徑，其中家族的每個(gè)成員都有不同的T基團(tuán)。例如，當(dāng)T是Tms，并且每個(gè)家族成員都期望有同樣的MSSE時(shí)，T3基團(tuán)之一即可提供這種MSSE結(jié)構(gòu)。為了就Tms的質(zhì)量而言提供家族成員間的可變性，家族成員間的T2基團(tuán)可以是變化的。例如，一個(gè)家族成員可以有T2=甲基，而另一個(gè)有T2=乙基，再一個(gè)則有T2=丙基等。
為了提供質(zhì)量的大跳躍，可以設(shè)計(jì)T3基團(tuán)以向T-L-X上加入相當(dāng)大的(如1百至幾百個(gè))質(zhì)量單位。這樣的T3基團(tuán)可稱為分子量范圍調(diào)整基團(tuán)(“WRA”)。如果用一組具有超出限制范圍的質(zhì)量的T2基團(tuán)工作，WRA是相當(dāng)有用的。可使用單一組T2基團(tuán)，僅僅通過(guò)在Tms中摻入一個(gè)或多個(gè)WRAT3基團(tuán)來(lái)產(chǎn)生有寬質(zhì)量范圍的Tms基團(tuán)。因此，舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子，如果一組T2基團(tuán)為Tms提供250-340道爾頓的質(zhì)量范圍，加入例如作為T3基團(tuán)的100個(gè)道爾頓的WRA，則使用同一組T2基團(tuán)，就可提供350-440道爾頓的質(zhì)量范圍。同樣，加入兩個(gè)100道爾頓MWA基團(tuán)(各自作為T3基團(tuán))便提供接近450-540道爾頓的質(zhì)量范圍，可繼續(xù)這種WRA基團(tuán)的遞增加入，以為Tms基團(tuán)提供很大的質(zhì)量范圍。優(yōu)選的式T2-(J-T3)n-L-X的化合物具有通式RVWC-(RWRA)W-RMSSE-L-X，其中VWC是“T2”基團(tuán)，WRA和MSSE中的每一個(gè)都是“T3”基團(tuán)。圖13中舉例說(shuō)明了這一結(jié)構(gòu)，并代表了制備Tms的一種模式方法。
在通式T2-(J-T3-)n-中，T2和T3較好是選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-S-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-酰胺-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基、烴基?；?亞烴基、雜環(huán)基烴基，其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，取代的雜環(huán)基烴基，其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，且取代基選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-S-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基以及烴基?；?亞烴基。此外，T2和/或T3可以是前面列出的潛在T2/T3基團(tuán)中任何一個(gè)的衍生物，即一個(gè)或多個(gè)氫原子被氟原子取代。
還就通式T2-(J-T3)n-來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的T3具有式-G(R2)-，其中G是具有單一R2取代基的C1-6亞烷基鏈。因此，如果G是亞乙基(-CH2-CH2-)，則兩個(gè)亞乙基碳中的任一個(gè)可具有R2取代基，并且R2選自烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基縮合的環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、芳烷基、芳基取代的鏈烯基或炔基、環(huán)烷基取代的烷基、環(huán)烯基取代的環(huán)烷基、聯(lián)芳基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、芳基取代的鏈烯氧基或炔氧基、烷氨基、鏈烯氨基或炔氨基、芳基取代的烷氨基、芳基取代的鏈烯氨基或炔基氨基、芳氧基、芳氨基、N-烷基脲取代的烷基、N-芳基脲取代的烷基、烷基羰基氨基取代的烷基、氨基羰基取代的烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基取代的烷基、雜環(huán)基取代的氨基、羧烷基取代的芳烷基、氧代碳環(huán)縮合的芳基和雜環(huán)基烷基；環(huán)烯基、芳基取代的烷基和芳烷基、羥基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、氨基取代的烷基、(芳基取代的烷氧基羰基氨基)取代的烷基、硫羥取代的烷基、烷基磺酰取代的烷基、(羥基取代的烷硫基)取代的烷基、硫代烷氧基取代的烷基、烴基酰基氨基取代的烷基、雜環(huán)酰基氨基取代的烷基、烴基取代的雜環(huán)基?；被〈耐榛?、烷基磺酰氨基取代的烷基、芳基磺酰氨基取代的烷基、嗎啉代烷基、硫代嗎啉代烷基、嗎啉代羰基取代的烷基、硫代嗎啉代羰基取代的烷基、(N-(烷基、鏈烯基或炔基)-或N,N-[二烷基、二鏈烯基、二炔基或(烷基、鏈烯基)-氨基]羰基取代的烷基、雜環(huán)基氨基羰基、雜環(huán)基亞烷基氨基羰基、雜環(huán)基氨基羰基取代的烷基、雜環(huán)基亞烷基氨基羰基取代的烷基、N,N-[二烷基]亞烷基氨基羰基、N,N-[二烷基]亞烷基羰基取代的烷基、烷基取代的雜環(huán)基羰基、烷基取代的雜環(huán)基羰基-烷基、羧基取代的烷基、二烷基氨基取代的酰基氨基烷基，以及選自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、S-甲基半胱氨酸、蛋氨酸和其相應(yīng)的亞砜和砜衍生物、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、組氨酸、谷氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、β-氰基丙氨酸及別蘇氨酸的氨基酸側(cè)鏈；炔基和雜環(huán)基羰基、氨基羰基、酰氨基、一或二烷基氨基羰基、一或二芳基氨基羰基、烷基芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、一或二?；被驶?、芳族或脂族?；⒈贿x自氨基、羧基、羥基、巰基、一或二烷基氨基、一或二芳基氨基、烷基芳基氨基、二?；被?、一或二芳基氨基、烷氧基、鏈烯氧基、芳氧基、硫代烷氧基、硫代鏈烯氧基、硫代炔氧基、硫代芳氧基和雜環(huán)基任意取代的烷基。優(yōu)選的式T2-(J-T3-)n-L-X的化合物具有下示結(jié)構(gòu)
其中G是(CH2)1-6，其中由單一“G”代表的CH2基團(tuán)中一個(gè)并且只有一個(gè)上的氫原子被-(CH2)c-酰胺-T4所取代，T2和T4是式C1-25N0 -9HαFβ的有機(jī)殘基，其中α和β的總和足以飽和C、N和O原子可能未飽和的價(jià)；酰胺是
R1是氫或C1-10烷基；C是0至4的整數(shù)，n是1至50的整數(shù)，其中當(dāng)n大于1時(shí)，G、c、酰胺、R1和T4是獨(dú)立地選擇的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，式T2-(J-T3-)n-L-X的化合物具有下示結(jié)構(gòu)
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機(jī)殘基，其中α和β的和足以飽和C、N和C原子的可能未飽和的價(jià)；T5包括叔或季胺或有機(jī)酸；m是0-49的整數(shù)，且T2、T4、R1、L和X是如前定義的基團(tuán)。
另一個(gè)具有式T2-(J-T3-)n-L-X的優(yōu)選化合物則有以下具體結(jié)構(gòu)
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機(jī)殘基，其中α和β的總和足以飽和C、N和O原子的可能未飽和的價(jià)；T5包括叔或季胺或有機(jī)酸；m是0-49的整數(shù)，且T2、T4、c、R1、“酰胺”、L和X已在前面給出了定義。
在上面的具有T5基團(tuán)的結(jié)構(gòu)中，-酰胺-T5較好是使有機(jī)酸與從“G”延伸的游離氨基基因反應(yīng)而方便地制得的下列基團(tuán)之一
當(dāng)上述化合物具有T5基團(tuán)，并且“G”基團(tuán)具有游離羧基基團(tuán)(或其反應(yīng)性等同物)時(shí)，則優(yōu)選的-酰胺-T5基團(tuán)是如下所示的，可使適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)胺與從“G”基團(tuán)延伸的游離羧基基團(tuán)反應(yīng)而方便地制得的基團(tuán)
在本發(fā)明的三個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，T-L-MOI具有下示結(jié)構(gòu)
或者
或者
其中T2和T4是式C1-25N0-9O0-9S0-3P0-3HαFβIδ的有機(jī)殘基，其中α、β和δ的總和足以飽和C、N、O、S和P原子可能未飽和的價(jià)；G是(CH2)1-6，其中由每個(gè)G代表的CH2基團(tuán)上的一個(gè)并且只有一個(gè)氫被-(CH2)c-酰胺-T4取代；酰胺是
R1是氫或C1-10烷基；c是從0至4的整數(shù)；“C2-C10”代表具有2至10個(gè)碳原子的亞烴基基團(tuán)，“ODN-3′-OH”代表有末端3′羥基基團(tuán)的核酸片段(即在核酸片段的3′末端以外的位置連接到(C1-C10))；n是從1至50的整數(shù)，這樣當(dāng)n大于1時(shí)，獨(dú)立地選擇G、c、酰胺、R1和T4。最好沒(méi)有三個(gè)雜原子結(jié)合到同一個(gè)碳原子上。
在上面列出的含有T2-C(=0)-N(R1)-基團(tuán)的結(jié)構(gòu)中，該基團(tuán)可由式HN(R1)-的胺與選自下面例子中的有機(jī)酸反應(yīng)而生成，下面所列出的只是某些實(shí)例，但并沒(méi)有無(wú)遺漏地列出所有可能的有機(jī)酸。所說(shuō)有機(jī)酸的例子包括甲酸、乙酸、丙酸、丙炔酸、氟乙酸、2-丁炔酸、環(huán)丙烷羧酸、丁酸、甲氧乙酸、二氟己酸、4-戊炔酸、環(huán)丁烷羧酸、3,3-二甲基丙烯酸、戊酸、N,N-二甲基甘氨酸、N-甲酰-Gly-OH、乙氧基乙酸、(甲硫基)乙酸、吡咯-2-羰酸、3-糠酸、異噁唑-5-羧酸、反式-3-己烯酸、三氟乙酸、己酸、Ac-Gly-OH、2-羥-2-甲基丁酸、苯甲酸、煙酸、2-吡嗪羧酸、1-甲基-2-吡咯羧酸、2-環(huán)戊烯-1-乙酸、環(huán)戊烷乙酸、(S)-(-)-2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-甲基-L-脯氨酸、庚酸、Ac-b-Ala-OH、2-乙基-2-羥丁酸、2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸、對(duì)甲苯甲酸、6-甲基煙酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、2,5-二甲基吡咯-3-羧酸、4-氟苯甲酸、3,5-二甲基異噁唑-4-羧酸、3-環(huán)戊基丙酸、辛酸、N,N-二甲基琥珀氨酸、苯基丙炔酸、肉桂酸、4-乙基苯甲酸、對(duì)甲氧基苯甲酸、1,2,5-三甲基吡咯-3-羧酸、3-氟-4-甲基苯甲酸、Ac-DL-炔丙基甘氨酸、3-(三氟甲基)丁酸、1-哌啶丙酸、N-乙酰脯氨酸、3,5-二氟苯甲酸、Ac-L-Va-OH、吲哚-2-羧酸、2-苯并呋喃羧酸、苯并三唑-5-羧酸、4-正丙基苯甲酸、3-二甲基氨基苯甲酸、4-乙氧基苯甲酸、4-(甲硫基)苯甲酸、N-(2-糠酰)甘氨酸、2-(甲硫基)煙酸、3-氟-4-甲氧基苯甲酸、Tfa-Gly-OH、2-萘甲酸、喹哪啶酸、Ac-L-Ile-OH、3-甲基吲哚烯-2-羧酸、2-喹喔啉羧酸、1-甲基吲哚-2-羧酸、2,3,6-三氟苯甲酸、N-甲酰-L-Met-OH、2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸、4-正丁基苯甲酸、N-苯甲酰甘氨酸、5-氟吲哚-2-羧酸、4-正丙氧基苯甲酸、4-乙酰-3,5-二甲基-2-吡咯羧酸、3,5-二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基煙酸、環(huán)己烷戊酸、2-萘基乙酸、4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸、吲哚-3-丙酸、間三氟甲基苯甲酸、5-甲氧基吲哚-2-羧酸、4-戊基苯甲酸、Bz-b-Ala-OH、4二乙基氨基苯甲酸、4-正丁氧基苯甲酸、3-甲基-5-CF3-異噁唑-4-羧酸、(3,4-二甲氧基苯基)乙酸、4-聯(lián)苯基羧酸、新戊酰-Pro-OH、辛酰基-Gly-OH、(2-萘氧基)乙酸、吲哚-3-丁酸、4-(三氟甲基)苯基乙酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、4-(三氟甲氧基)苯甲酸、Ac-L-Phe-OH、4戊氧基苯甲酸、Z-Gly-OH、4-羧基-N-(呋喃-2-基甲基)吡咯烷-2-酮、3,4-二甲氧基苯甲酸、2,4-二甲基-5-CO2Et-吡咯-3-羧酸、N-(2-氟苯基)琥珀酰胺酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、N-苯基鄰氨基苯甲酸、3-苯氧基苯甲酸、壬酰-Gly-OH、2-苯氧基吡啶-3-羧酸、2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸、反式-4-(三氟甲基)肉桂酸、5-(甲基-2-苯基噁唑-4-基)乙酸、4-(2-環(huán)己烯氧基)苯甲酸、5-甲氧基-2-甲基吲哚-3-乙酸、反式-4-可塔寧羧酸、Bz-5-氨基戊酸、4-己氧基苯甲酸、N-(3-甲氧基苯基)琥珀酰胺酸、Z-Sar-OH、4-(3,4-二甲氧基苯基)丁酸、Ac-O-氟-DL-Phe-OH、N-(4-氟苯基)戊酰胺酸、4′-乙基-4-聯(lián)苯基羧酸、1,2,3,4-四氫吖啶羧酸、3-苯氧基苯基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)琥珀酰胺酸、N-癸?；?Gly-OH、(+)-6-甲氧基-a-甲基-2-萘乙酸、3-(三氟甲氧基)肉桂酸、N-甲酰-DL-Trp-OH,(R)-(+)-a-甲氧基-a-(三氟甲基)苯乙酸、Bz-DL-Leu-OH、4-(三氟甲氧基)苯氧基乙酸、4-庚氧基苯甲酸、2,3,4-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧基苯甲?；?Gly-OH、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酸、2,3,4,5,6-五氟苯氧基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)戊酰胺酸、N-十一?；?Gly-OH、2-(4-氟苯甲?；?苯甲酸、5-三氟甲氧基吲哚-2-羧酸、N-(2,4-二氟苯基)二甘醇氨酸、Ac-L-Trp-OH、Tfa-L-苯基甘氨酸-OH、3-碘代苯甲酸、3-(4-正戊基苯甲?；?丙酸、2-苯基-4-喹啉羧酸、4-辛氧基苯甲酸、Bz-L-Met-OH、3,4,5-三乙氧基苯甲酸、N-月桂酰-Gly-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯甲酸、Ac-5-甲基-DL-Trp-OH、2-碘苯基乙酸、3-碘-4-甲基苯甲酸、3-(4-正己基苯甲?；?丙酸、N-己酰-L-Phe-OH、4-壬氧基苯甲酸、4＇-(三氟甲基)-2-聯(lián)苯基羧酸、Bz-L-Phe-OH、N-三癸?；?Gly-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯基乙酸、3-(4-正庚基苯甲?；?丙酸、N-庚酰-L-Phe-OH、4-癸氧基苯甲酸、N-(α,α,α-三氟-間甲苯基)鄰氨基苯甲酸、2-[3-(三氟甲基)苯胺基]鹽酸、4-(2-羥基六氟異丙基)苯甲酸、N-肉豆蔻酰-Gly-OH、3-(4-正辛基苯甲酰基)丙酸、N-辛?；?L-Phe-OH、4-十-烷氧基苯甲酸、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酰-Gly-OH、8-碘代萘酸、N-十五酰-Gly-OH、4-十二烷氧基苯甲酸、N-棕櫚酰-Gly-OH和N-硬脂酰-Gly-OH?？蓮南铝泄举?gòu)得這些有機(jī)酸Aclvanced Chem Tech,Louisville,KY；Bachem BioscienceInc.,Torrance,CA；Caliochem-Novabiochem Corp.,San Diego,CA；Farchan Laboratories Inc.,Gainesville FL；Lancaster Synthesis,Windham NH；以及MayBridge Chemical Company(c/o Ryan Scientific),Columbia,SC。這些公司的產(chǎn)品目錄中使用上述識(shí)別這些酸的縮寫字。
f．作為制備標(biāo)記的手段的組合化學(xué)技術(shù)組合化學(xué)是導(dǎo)致生產(chǎn)大的化學(xué)文庫(kù)的一類合成策略(例如參見PCT申請(qǐng)公開號(hào)WO94/08051)?？墒褂眠@些組合文庫(kù)作為鑒定感興趣分子(MOI)的標(biāo)記。組合化學(xué)可定義為一組彼此有不同結(jié)構(gòu)的不同“結(jié)構(gòu)單元”的系統(tǒng)的和重復(fù)的共價(jià)連接，借以產(chǎn)生一大組互異的分子。結(jié)構(gòu)單元可以采取天然產(chǎn)生和合成的許多形式，例如可以是親核試劑、親電子試劑、二烯類、烷化劑或?；瘎⒍?、核苷酸、氨基酸、糖、脂、有機(jī)單體、合成纖維及其組合。用于連接結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)反應(yīng)包括烷基化、?；?、氧化、還原、水解、取代、消除、加成、環(huán)化、縮合等。該方法可產(chǎn)生化合物文庫(kù)，如寡聚合的、非寡核合的或其組合。如果是寡聚合的，化合物可以是分支的，不分支的或環(huán)化的?？捎媒M合化學(xué)方法制備的寡聚結(jié)構(gòu)的例子包括寡肽、寡核苷酸、寡糖、聚脂質(zhì)、聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚脲、聚醚、聚(磷衍生物)，例如磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、亞磷酸酯、phorsphinamide等，以及聚(硫衍生物)，如砜、磺酸酯、亞硫酸酯、氨磺酰、亞磺酰胺等。
一個(gè)通用類型的寡聚物組合文庫(kù)是肽組合文庫(kù)。當(dāng)前肽化學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)創(chuàng)新已使人們能夠制備并使用由數(shù)千萬(wàn)到數(shù)億個(gè)不同的肽序列組成的文庫(kù)?？蓪⑦@樣的文庫(kù)分成三大類。一類文庫(kù)包括化學(xué)合成可溶性非載體結(jié)合的肽文庫(kù)(如參見Houghten等，自然354:84,1991)。第二類包括化學(xué)合成呈現(xiàn)在塑料針、樹脂球或棉布上的與支持物結(jié)合的肽文庫(kù)(Geysen等,Mol.Immunol.23:709,1986；Lam等，自然354:82,1991；Eichler和Houghten，生物化學(xué)(Biochemistry)32:11035,1993)。在前兩類中，結(jié)構(gòu)單元一般是L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸或其某些混合物或組合。第三類是使用分子生物學(xué)方法在絲狀噬菌體或質(zhì)粒表面上制備肽或蛋白質(zhì)(Scott和Craig,Curr.Opinion Biotech.5:40,1994)。可溶性的非載體組和的肽文庫(kù)似乎適合于包括用作標(biāo)記在內(nèi)的許多應(yīng)用。可以用例如全甲基化步驟擴(kuò)展肽文庫(kù)中可利用的化學(xué)多樣性(Ostresh等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:11138,1994)。
可以制得肽組合文庫(kù)的大量變體，例如其中可修飾肽骨架，和/或用模擬基團(tuán)取代酰胺鍵?？梢允褂玫孽０纺M基團(tuán)包括脲、氨基甲酸酯(尿烷)及羰基亞甲基等。重新構(gòu)建骨架，以從每個(gè)氨基酸的酰胺氮而不是α碳發(fā)出側(cè)鏈，從而得到稱為類肽的化合物文庫(kù)(Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:9367,1992)。
另一個(gè)常見類型的寡聚物組和文庫(kù)是寡核苷酸組合文庫(kù)，其中結(jié)構(gòu)單元是某種形式的天然存在的或非天然的核苷酸或多糖衍生物，包括其中各種有機(jī)和無(wú)機(jī)基團(tuán)可取代磷酸酯鍵，并且氮和硫可取代醚鍵中的氧(Schneider等，生物化學(xué)34:9599,1995；Freier等，J.Med.Chem.38:344,1995；Frank，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnology)41:259,1995；Schneider等，已公開的PCT WO942052,Ecker等，核酸研究(NucleicAcids Res.)21:1853,1993)。
最近已描述了組和生產(chǎn)非寡聚的小分子化合物集群的方法(DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:690,1993；Bunin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708,1994)。適于制成小分子文庫(kù)的結(jié)構(gòu)包括各種有機(jī)分子，例如雜環(huán)、芳族、無(wú)環(huán)、脂族化合物、類固醇、抗生素、酶抑制劑、配體、激素、藥物、生物堿、阿片樣物質(zhì)、萜類、卟啉、毒素、催化劑以及其組合。
g．組合合成標(biāo)記的特異性方法以下概述制備和使用不同組的含胺MS標(biāo)記的兩種方法。在兩種方法中，利用固相合成可使人們得以用組合化學(xué)的技術(shù)同時(shí)平行地合成很大數(shù)目的標(biāo)記的接頭。在第一種方法中，最后從寡核苷酸上裂解掉標(biāo)記后得以釋放出羧酰胺。在第二種方法中，切掉標(biāo)記后產(chǎn)生羧酸。用于這些方法中的化學(xué)成分和連接元件的縮寫符號(hào)如下R =樹脂F(xiàn)MOC =芴基甲氧基羰基保護(hù)基團(tuán)All=烯丙基保護(hù)基團(tuán)CO2H =羧酸基團(tuán)CONH2=羧酰胺基團(tuán)NH2=氨基基團(tuán)OH=羥基基團(tuán)CONH =酰胺鍵COO =酯鏈NH2-Rink-CO2H=4-[(α-氨基)-2,4-二甲氧基芐基]-苯氧基苯丁酸(Rink接頭)OH-1MeO-CO2H =(4-羥甲基)苯氧基丁酸OH-2MeO-CO2H =(4-羥甲基)-3-甲氧基)苯氧基乙酸NH2-A-COOH =側(cè)鏈中有脂族或芳族胺功能團(tuán)的氨基酸X1…Xn-COOH=具獨(dú)特分子量的一組n個(gè)不同的羧酸oligo1…oligo(n) =一組n個(gè)寡核苷酸HBTU =O-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽方法1中各步驟的順序如下OH-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-Rink-CO2H；偶聯(lián)(如HBTU)FMOC-NH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-A-COOH；偶聯(lián)(例如HBTU)FMOC-NH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓分為n等份↓↓↓↓偶聯(lián)到n種不同的酸X1……Xn-COOH上X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓用1％TFA從樹脂上切下標(biāo)記的接頭X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-COOH↓↓↓↓↓偶聯(lián)到n個(gè)寡聚體上(oligo1…oligo(n))(例如通過(guò)Pfp酯)X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-CONH-oligo1…oligo(n)↓合并標(biāo)記的寡聚體↓完成測(cè)序反應(yīng)↓從測(cè)序反應(yīng)中分離不同長(zhǎng)度的片段(例如通過(guò)HPLC或CE)↓用25％-100％TFA從接頭上切下標(biāo)記X1……Xn-CONH-A-CONH↓用質(zhì)譜分析方法2中各步驟的順序如下OH-1MeO-CO2-All↓FMOC-NH-A-CO2H；偶聯(lián)(例如，HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2-All↓鈀(除去烯丙基)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2H↓OH-2MeO-CONH-R；偶聯(lián)(例如，HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓分成n個(gè)等份↓↓↓↓↓偶聯(lián)到n個(gè)不同的酸X1……Xn-CO2H上X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓用1％TFA從樹脂上切掉標(biāo)記的接頭X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-CO2H↓↓↓↓↓偶聯(lián)到n個(gè)寡聚體上(oligo1…oligo(n))(例如，通過(guò)Pfp酯)X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-CONH-oligo1…olgo(n)↓合并標(biāo)記的寡聚體↓完成測(cè)序反應(yīng)↓從測(cè)序反應(yīng)中分離不同長(zhǎng)度的片段(例如通過(guò)HPLC或CE)↓用25-100％TFA從接頭上切掉標(biāo)記X1……Xn-CONH-A-CO2H↓用質(zhì)譜法分析2．接頭本文中所說(shuō)的“接頭”成分(或L)是指用于通過(guò)共價(jià)化學(xué)鍵將“標(biāo)記”(或T)接合到“感興趣分子”(或MOI)上的直接共價(jià)鍵或有機(jī)化學(xué)基團(tuán)。此外，直接鍵本身或接頭成分內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)鍵可在允許從T-L-X化合物的其余部分(包括MOI成分)中釋放出(或者說(shuō)是裂解掉)T的條件下裂解。存在于T內(nèi)的標(biāo)記可變部分應(yīng)是對(duì)裂解條件穩(wěn)定的。最好盡快完成裂解，例如在幾分鐘內(nèi)，特別是在15秒鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
一般來(lái)說(shuō)，使用接頭使每一大組標(biāo)記連接到一相似的大組MOI上。典型的是將單個(gè)標(biāo)記-接頭組合連接到各個(gè)MOI上(得到各種各樣的T-L-MOI)，但在某些情況下，可在每個(gè)MOI上連接一個(gè)以上的標(biāo)記-接頭組合(得到各種(T-L)n-MOI)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)接頭上的多個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)將兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記結(jié)合到單一接頭上，然后將此多標(biāo)記-接頭組合連接到單個(gè)MOI上(得到各種(T)n-L-MOI)。
在對(duì)這組標(biāo)記的MOI進(jìn)行了各種操作后，使用特異的化學(xué)和/或物理?xiàng)l件裂解接頭中的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵，結(jié)果從MOI上釋出標(biāo)記。該可裂解的鍵可以是或不是某些當(dāng)標(biāo)記、接頭和MOI連接在一起時(shí)所形成的同樣鍵。接頭的設(shè)計(jì)將在很大程度上決定完成裂解所需的條件。因此，可根據(jù)它們特別敏感的裂解條件來(lái)指稱接頭。當(dāng)接頭對(duì)光不穩(wěn)定時(shí)(即傾向于通過(guò)與光化照射接觸而裂解)，則接頭可稱為L(zhǎng)hv。同樣，可用Lacid、Lbase、L[O]、Lenz、Lelc、LΔ和Lss來(lái)命名分別對(duì)酸、堿、化學(xué)氧化、化學(xué)還原、酶的催化活性(更簡(jiǎn)單地說(shuō)是對(duì)“酶”)、電化學(xué)氧化或還原、升高的溫度(“熱”)及硫醇交換特別敏感的接頭。
某些類型的接頭對(duì)每一類型的裂解條件不穩(wěn)定，而其他一些接頭則對(duì)幾種類型的裂解不穩(wěn)定。此外，在能夠結(jié)合多個(gè)標(biāo)記的接頭(得到(T)n-L-MOI型結(jié)構(gòu))中，各個(gè)標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)可以是對(duì)不同的裂解條件不穩(wěn)定的。例如，在其上結(jié)合有兩個(gè)標(biāo)記的接頭中，其中一個(gè)標(biāo)記可以是只對(duì)堿不穩(wěn)定，另一個(gè)則只對(duì)光解作用不穩(wěn)定。
可用于本發(fā)明的一種接頭具有幾個(gè)特征1)接頭具有化學(xué)柄(Lh)，通過(guò)該柄使接頭連接到MOI上。
2)接頭具有第二個(gè)分立的化學(xué)柄(Lh)，通過(guò)該柄使標(biāo)記連接到接頭上。如果多個(gè)標(biāo)記連接到單一接頭上((T)n-L-MOI型結(jié)構(gòu))，則對(duì)每個(gè)標(biāo)記存在一個(gè)分立的柄。
3)除了允許裂解，以使含T的部分從包括MOI在內(nèi)的化合物其余部分上釋放下來(lái)的條件外，接頭對(duì)其所經(jīng)受的所有操作都是穩(wěn)定的。因此，接頭在標(biāo)記連接到接頭上、接頭連接到MOI上，以及在對(duì)MOI進(jìn)行的使標(biāo)記和接頭(T-L)與之連接的任何操作期間都是穩(wěn)定的。
4)接頭在T-L連接到MOI上時(shí)并不明顯地干擾對(duì)MOI進(jìn)行的操作。如果T-L連接到寡核苷酸上，T-L一定不能對(duì)寡核苷酸所參于的任何雜交和酶促反進(jìn)(如PCR)造成以確切干擾。同樣，如果T-L連接到抗體上，則其一定不能對(duì)該抗體的抗原識(shí)別有明顯的干擾。
5)使用對(duì)標(biāo)記的可檢測(cè)性沒(méi)有不利影響的物理或化學(xué)方法，以高度控制的方法將標(biāo)記從化合物上裂解下來(lái)。
對(duì)于任何給定的接頭，最好是接頭能夠連接到寬范圍的各種MOI上，而且各種標(biāo)記可以連接到接頭上。這樣的靈活性是有利的，因?yàn)檫@樣可使T-L連接物的文庫(kù)一旦制備之后，即可與幾種不同的MOI一起使用。
如上文解釋的，一種優(yōu)選的接頭具有下列通式Lh-L1-L2-L3-Lh其中每個(gè)Lh都是一個(gè)能用于將接頭連接到標(biāo)記反應(yīng)物上和感興趣的分子反應(yīng)物上的反應(yīng)活性柄。L2是接頭的基本部分，因?yàn)長(zhǎng)2賦予接頭以不穩(wěn)定性。L1和L3是可任意存在的基團(tuán)，其可有效地用于使L2與柄Lh分離開。
L1(按照定義，其比L3更接近于T)可用于使T與必要的不穩(wěn)定部分L2分離開。如果裂解反應(yīng)產(chǎn)生可使含T部分的結(jié)構(gòu)發(fā)生隨機(jī)改變的特殊反應(yīng)性基團(tuán)(如游離基)時(shí)，則這種分離可能是有用的。當(dāng)裂解位點(diǎn)進(jìn)一步與含T部分分離開時(shí)，在此裂解位點(diǎn)形成的反應(yīng)性基團(tuán)就不太可能破壞含T部分的結(jié)構(gòu)。另外，因?yàn)長(zhǎng)1中的原子一般存在與含T部分，這些L1原子可賦予含T部分以有利的性質(zhì)。例如，當(dāng)含T部分是含Tms部分時(shí)，希望作為含Tms部分之結(jié)構(gòu)的一部分(例如作為MSSE)存在位阻胺，該位阻胺可能存在于L1不穩(wěn)定部分中。
在其他例子中，接頭成分中可能只存在L1和/或L3，這是因?yàn)榻宇^的供應(yīng)商選擇出售具這種L1和/或L3基團(tuán)形式的接頭。在這些情況下，使用具有L1和/或L3基團(tuán)的接頭，即使對(duì)摻入它們的化合物沒(méi)有帶來(lái)任何特殊的性能優(yōu)點(diǎn)，但也沒(méi)有什么損害(只要這些基因并不抑制裂解反應(yīng)即可)。因此，本發(fā)明允許在接頭成分中存在L1和/或L3基團(tuán)。
L1和/或L3基團(tuán)可以是直接鍵(在這種情況下，實(shí)際不存在該基團(tuán))、亞烴基基團(tuán)(例如亞烷基、亞芳基、亞環(huán)烷基等)、-O-亞烴基(例如-O-CH2-、O-CH2CH(CH3)4-等)或亞烴基-(O-亞烴基)w-，其中w是1到10的整數(shù)(例如-CH2-O-Ar-,-CH2-(O-CH2CH2)4-等)。
隨著固相合成的出現(xiàn)，已發(fā)表了大量關(guān)于對(duì)特異性反應(yīng)條件不穩(wěn)定的接頭的文章。在典型的固相合成中，固相載體通過(guò)不穩(wěn)定的接頭結(jié)合反應(yīng)性位點(diǎn)，并且在反應(yīng)性位點(diǎn)產(chǎn)生待合成的分子。當(dāng)該分子被完全合成之后，使固相載體-接頭-分子構(gòu)建體受從固相載體上放出所說(shuō)的分子的裂解條件。已發(fā)展的用于這一目的(或可能用于這一目的)的不穩(wěn)定性接頭也可很容易于用作本發(fā)明的接頭反應(yīng)物。
Lloyd-Williams,P等人(“會(huì)聚性固相肽合成”)，四面體報(bào)告(Tetrahedron Report)No.347,49(48):11065-11133(1993))深入地討論了對(duì)光化性照射(即光解)、酸、堿及其他裂解條件不穩(wěn)定的接頭。有關(guān)敏感性接頭的其他信息來(lái)源易于得到。
如上文所討論的，不同的接頭設(shè)計(jì)將賦予在不同的特異性物理或化學(xué)條件下的可裂解性。用于裂解各種不同設(shè)計(jì)的接頭的條件包括酸、堿、氧化、還原、氟化物、巰基交換、光解及酶促條件。
滿足上文列出的接頭一般標(biāo)準(zhǔn)的可裂解的接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括Pierce(Rockford,IL)提供的目錄中的那些。例子包括· 雙(琥珀酰亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)，為可被羥胺裂解(1M,37℃,3-6小時(shí))的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 酒石酸二琥珀酰亞氨酯(DST)和磺基-DST，其為可被0.015M過(guò)碘酸鈉裂解的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 雙[2-(琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和磺基-BSOCOES，其為可被堿(pH11.6)裂解的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫基(丙酰胺基)丁烷(DPDPB)，可經(jīng)硫羥交換或還原作用裂解的吡啶二硫醇交聯(lián)劑；· N-[4-(對(duì)疊氮基水楊酰胺基)-丁基]-3＇-(2＇-吡啶二硫基)丙酰胺(APDP)，為可經(jīng)硫羥交換或還原裂解的吡啶二硫醇交聯(lián)劑；· 雙-[β-4-(疊氮基水楊酰胺基)乙基]-二硫化物，為可經(jīng)硫羥交換或還原作用裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· N-琥珀酰亞氨基-(4-疊氮苯基)-1,3′-二硫基丙酸酯(SADP)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 硫代琥珀酰亞氨基-2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3乙酰胺)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAED)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 磺基琥珀酰亞氨基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAND)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。
可裂解接頭的其他例子和可用于釋放標(biāo)記的裂解條件如下所述?？杀环锘蛟谒嵝詶l件下裂解的甲硅烷基連接基團(tuán)?？杀还庠戳呀?光解)的3-,4-,5-，或6-取代的-2-硝基芐氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-硝基芐氧基連接基團(tuán)?？杀籆e(NH4)2(NO3)6裂解(氧化)的3-,4-,5-或6-取代的-2-烷氧基苯氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-烷氧基苯氧基連接基團(tuán)?？杀粴溲趸?堿)、酸或LiAIH4(還原)裂解的NCO2(尿烷)接頭。可被O3、OsO4/IO4-或KMnO4(氧化)裂解的3-戊烯基、2-丁烯基或1-丁烯基連接基團(tuán)?？杀籓2、Br2、MeOH或酸裂解的2-[3-,4-，或5-取代的-呋喃基]氧基連接基團(tuán)。
裂解其他不穩(wěn)定連接基團(tuán)的條件包括可用酸裂解叔烷氧基連接基團(tuán)；可用H3O+裂解的甲基(二烷基)甲氧基或4-取代的-2-烷基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基連接基團(tuán)；可用氟化物或酸裂解的2-甲硅烷基乙氧基連接基團(tuán)；可在堿性條件下裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=酮、酯、酰胺、氰基、NO2、硫醚、亞砜、砜)連接基團(tuán)；可用酸或在還原條件下裂解的2-,3-,4-,5-，或6-取代的芐氧基連接基團(tuán)；可用(Ph3P)3RhCl(H)裂解的2-丁烯氧基連接基團(tuán)；可用Li、Mg或BuLi裂解的3-,4-,5-或6-取代的-2-溴苯氧基連接基團(tuán)；可用Hg2+裂解的甲基硫代甲氧基連接基團(tuán)；可用Zn或Mg裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=鹵素)連接基團(tuán)；可經(jīng)氧化(例如用Pb(OAc)4)裂解的2-羥基乙氧基連接基團(tuán)。
優(yōu)選的接頭是被酸或光解作用裂解的接頭。在已為固相肽合成而發(fā)展的酸敏感性接頭中，有幾種可用于將標(biāo)記連接到MOI上。在Lloyd-Williams等人的綜述(四面體49:11065-11133,1993)描述了其中的某些接頭。一類有用的接頭是基于對(duì)烷氧基芐基醇，其中兩種接頭4-羥基甲基苯氧基乙酸和4-(4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸可購(gòu)自Advanced ChemTech(Louisville,KY)。這兩個(gè)接頭可通過(guò)連接到芐醇上的酯鍵連接到標(biāo)記上，并且通過(guò)連到羧酸上的酰胺鍵連接到含胺MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI裂解掉由這些分子連接的標(biāo)記。裂解這些接頭導(dǎo)致標(biāo)記上的羧酸的釋放。酸裂解通過(guò)相關(guān)接頭如2,4-二甲氧基-4＇-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(可以FMOC保護(hù)的形式購(gòu)自AdvancedChem Tech公司)連接的標(biāo)記，導(dǎo)致被釋出的標(biāo)記上的羧酰胺的釋放。
已為固相肽合成而發(fā)展的大部分光敏感性接頭也可用于本申請(qǐng)(參見Lloyd-Williams的綜述)。這些接頭通常是基于2-硝基芐酯或2-硝基芐酰胺。最近文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)過(guò)的光敏感接頭的兩個(gè)例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones,J.Org.Chem.60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸(Brown等，Molecular Diversity 1:4-12,1995)。兩接頭均可通過(guò)羧酸連接到MOI的胺上。通過(guò)在標(biāo)記上的羧酸和接頭上的胺之間形成酰胺而使標(biāo)記接到接頭上。通常用350nm波長(zhǎng)的紫外光以本領(lǐng)域已知的強(qiáng)度和時(shí)間完成對(duì)光敏感接頭的裂解。裂解接頭導(dǎo)致標(biāo)記上伯酰胺的釋放。光可裂解的接頭的例子包括硝基苯基甘氨酸酯，內(nèi)-和外-2-苯并降冰片烷基氯和甲磺酸，以及3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸。酶促裂解的例子包括可裂解酯鍵的酯酶、裂解磷酸二酯鍵的核酸酶、裂解肽鍵的蛋白酶等。
優(yōu)選的接頭成分具有如下所示的鄰硝基芐基結(jié)構(gòu)
其中位置a、b、c、d或e上的一個(gè)碳原子被-L3-X取代，L1(其較好是直接鍵)在上述結(jié)構(gòu)中存在于N(R1)的左邊。這樣的接頭成分對(duì)選擇性光誘導(dǎo)的對(duì)標(biāo)有“a的碳和N(R1)之間的鍵裂解是敏感的。R1對(duì)裂解反應(yīng)并不重要，但最好選自氫和烴基。本發(fā)明指出上述結(jié)構(gòu)中-N(R1)-可被-O-替換。另外，在上示結(jié)構(gòu)中，位置b、c、d或e中的一個(gè)或多個(gè)位置可被烷基、烷氧基、氟、氯、羥基、羥酸酯或酰胺取代，其中這些取代基在各種情形中被獨(dú)立地選擇。
另一個(gè)帶有化學(xué)柄Lh的優(yōu)選接頭成分具有下示結(jié)構(gòu)
其中位置b、c、d或e中的一個(gè)或多個(gè)位置由氫、烷基、烷氧基、氟、氯、羥基羧酸酯或酰胺取代，R1是氫或烴基，且R2是-OH或保護(hù)或活化羧酸以利于與另一個(gè)部分偶聯(lián)的基團(tuán)。氟碳和氫氟碳基團(tuán)是活化羧酸以利與另一個(gè)部分偶聯(lián)的優(yōu)選基團(tuán)。
3．感興趣的分子(MOI)MOI的例子包括核酸或核酸類似物(如PNA)、核酸的片段(即核酸片段)、合成的核酸或片段、寡核苷酸(如DNA或RNA)、蛋白質(zhì)、肽、抗體或抗體片段、受體、受體配基、配體對(duì)的成員、細(xì)胞因子、激素、寡糖、合成的有機(jī)分子、藥物及其組合。
優(yōu)選的MOI包括核酸片段。優(yōu)選的核酸片段是與存在于用來(lái)堿基測(cè)序的載體中的序列互補(bǔ)的引物序列。核酸片段較好是在片段的3′末端以外，并且最好是在片段的5′末端直接或間接連接到標(biāo)記上?？梢詮纳虡I(yè)來(lái)源(例如Promega,Madison,WI)買到或基于基因數(shù)據(jù)庫(kù)(例如Dib等，自然380:152-154,1996和GEPH Genotype Database,http://www,cephb.fr)制得。
本文使用的術(shù)語(yǔ)MOI包括MOI的衍生物，其含有使MOI連接到T-L-Lh上的功能團(tuán)。例如，在5′末端有磷酸二酯并且該磷酸二酯也結(jié)合到亞烷基胺上的核酸片段即是MOI。美國(guó)專利4,762,779中描述了這樣一種MOI。作了內(nèi)部修飾的核酸片段也是MOI。對(duì)核酸片段的內(nèi)部修飾的一個(gè)例子是將已經(jīng)過(guò)修飾的堿基(例如A、G、C、T、U)加到反應(yīng)性功能基團(tuán)上?？蓮睦鏕len Research,Herndon,VA購(gòu)得這種經(jīng)過(guò)內(nèi)部修飾的核酸片段。對(duì)核酸片段進(jìn)行內(nèi)部修飾的另一個(gè)例子是使用無(wú)堿基亞磷酸酰胺合成修飾的磷酸二酯，將后者放在核酸片段的糖和磷酸基團(tuán)之間。該無(wú)堿基亞磷酸酰胺含有一反應(yīng)性基團(tuán)，所說(shuō)的基團(tuán)允許含有該亞磷酸酰胺衍生部分的核酸片段連接到另一個(gè)部分如T-L-Lh化合物上。例如可從Clonetech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA購(gòu)得這樣的無(wú)堿基亞磷酸酰胺。
4．化學(xué)柄(Lh)化學(xué)柄是作為第一分子的一部分存在的同穩(wěn)定而具反應(yīng)性的原子排布，該柄可進(jìn)行與作為第二分子的一部分存在的互補(bǔ)化學(xué)柄的化學(xué)反應(yīng)，從而形成兩分子間的共價(jià)結(jié)合。例如，化學(xué)柄可以是羥基基團(tuán)，而互補(bǔ)化學(xué)柄則可以是羧酸基團(tuán)(或其活化的衍生物，例如氫氟芳基酯)，經(jīng)反應(yīng)后這兩個(gè)柄之間形成將兩分子連接在一起的共價(jià)鍵(特別是酯基團(tuán))。
化學(xué)柄可用于許許多多共價(jià)鍵形成反應(yīng)中，通過(guò)這些反應(yīng)使標(biāo)記連接到接頭上，并使接頭連接到MOI上。這樣的反應(yīng)包括烷基化(例如形成醚，硫醚)、酰化(如形成酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(如形成磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺)、磺?；?如形成磺酸酯、氨磺酰)、縮合(如形成亞胺、肟、腙)、甲硅烷基化、二硫化物形成，以及經(jīng)光解作用生成反應(yīng)性中間體(如氮烯或碳烯)。一般說(shuō)來(lái)，適于將標(biāo)記連接到接頭上的柄和鍵形成反應(yīng)也適于使接頭接到MOI上，反之亦然。在某些情況下，MOI可能預(yù)先進(jìn)行修飾的衍生作用，以提供連接接頭所需的柄。
一種類型的特別適用于將接頭連接到MOI上的鍵是二硫鍵。其形成需要在接頭上存在巰基基團(tuán)(“柄”)，并且在MOI上存在另一個(gè)巰基基團(tuán)。然后中度氧化條件即足以使兩個(gè)巰基結(jié)合成二硫化物。也可使用過(guò)量的適當(dāng)二硫化物交換試劑例如二硫化吡啶來(lái)誘導(dǎo)二硫鍵形式。因?yàn)槎蚧锏男纬墒呛苋菀啄孓D(zhuǎn)的，所以必要時(shí)可使用二硫鍵作為釋放標(biāo)記的可裂解鍵。一般可在相似的溫和條件下，使用過(guò)量的適當(dāng)巰基交換劑如二硫蘇糖醇來(lái)完成反應(yīng)。
為使標(biāo)記(或連有接頭的標(biāo)記)連接到寡核苷酸上，特別有利的是形成酰胺鍵。可用亞磷酰胺酯例如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺酯(可購(gòu)于Glenn Research,Sterling,VA)很容易的將伯脂族胺柄導(dǎo)入到合成的寡核苷酸上。與被導(dǎo)入的伯胺相比，見于天然核苷酸中的胺例如腺苷和鳥苷實(shí)際上是無(wú)反應(yīng)性的。反應(yīng)性的這種差異構(gòu)成與被導(dǎo)入的伯胺而不是核苷胺選擇性地形成酰胺及相關(guān)結(jié)合基團(tuán)(如脲、硫脲、氨磺酰)之能力的基礎(chǔ)。
如在分子探針供貨目錄(Molecular Probes catalog)(Eugene,OR)中所列出的，胺反應(yīng)性功能基團(tuán)的部分細(xì)目包括活化的羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磺酰鹵和二氯三氮烯?；钚怎ナ菍?duì)胺修飾的極好試劑，因?yàn)樗纬傻孽０樊a(chǎn)物是很穩(wěn)定的。另外，這些試劑與脂族胺有很好的反應(yīng)性，而與寡核苷酸的核苷酸胺則是低反應(yīng)性的?；钚怎サ睦影∟-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯及對(duì)硝基苯基酯。因?yàn)榛钚怎タ捎蓪?shí)際上任何含有羧酸的分子制得，所以它們是很有用的。Bodansky(肽化學(xué)的原理(第二版)，Springer Verlag,London,1993)列出了制造活性酯的方法。
5．接頭連接一般使用單一類型的接頭將特定組或家族的標(biāo)記連接到特定組或家族的MOI上。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可按一種統(tǒng)一的方法創(chuàng)造所有的各種T-L-MOI結(jié)構(gòu)。如果一組T-L-MOI結(jié)構(gòu)的數(shù)目多，這樣做是特別有利的，因?yàn)樗靡允褂媒M合化學(xué)或其他平行的加工技術(shù)制備這一組結(jié)構(gòu)。以相似的方式，使用單一類型的接頭可以利用某種統(tǒng)一的方法裂解所有的各種T-L-MOI結(jié)構(gòu)。另外，這對(duì)于一大組T-L-MOI結(jié)構(gòu)是有利的，因?yàn)檫@樣可以按平行的重復(fù)的和/或自動(dòng)化的方式處理該組結(jié)構(gòu)。
但也有本發(fā)明的其他實(shí)施方案，其中使用兩種或多種類型的接頭將不同亞組的標(biāo)記連接到相應(yīng)亞組的MOI上。在這種情況下，可使用選擇性裂解條件獨(dú)立地裂解各個(gè)接頭，而不裂解存在于其他亞組MOI上的接頭。
有許多共價(jià)鍵形成反應(yīng)適于將標(biāo)記連接到接頭上，并將接頭連接到MOI上。這樣的反應(yīng)包括烷基化(例如形成醚，硫醚)、酰化(如形成酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(如形成磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺)、磺?；?如形成磺酸酯、氨磺酰)、縮合(如形成亞胺、肟、腙)、甲硅烷基化、二硫化物形成，以及經(jīng)光解作用生成反應(yīng)性中間體(如氮烯或碳烯)。一般說(shuō)來(lái)，適于將標(biāo)記連接到接頭上的柄和鍵形成反應(yīng)也適于使接頭接到MOI上，反之亦然。在某些情況下，MOI可能預(yù)先進(jìn)行修飾或衍生作用，以提供連接接頭所需的柄。
一種類型的特別適用于將接頭連接到MOI上的鍵是二硫鍵。其形成需要在接頭上存在巰基基團(tuán)(“柄”)，并且在MOI上存在另一個(gè)巰基基團(tuán)。然后中度氧化條件即足以使兩個(gè)巰基結(jié)合成二硫化物。也可使用過(guò)量的適當(dāng)二硫化物交換試劑例如二硫化吡啶來(lái)誘導(dǎo)二硫鍵形式。因?yàn)槎蚧镄纬墒呛苋菀啄孓D(zhuǎn)的，所以必要時(shí)可使用二硫鍵作為釋放標(biāo)記的可裂解鍵。一般可在相似的溫和條件下，使用過(guò)量的適當(dāng)巰基交換劑如二硫蘇糖醇來(lái)完成反應(yīng)。
為使標(biāo)記連接到寡核苷酸上，特別有利的是形成酰胺鍵。可用亞磷酰胺酯例如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺酯(可購(gòu)于Glenn Research,Sterling,VA)很容易的將伯脂族胺柄導(dǎo)入到合成的寡核苷酸上。與被導(dǎo)入的伯胺相比，見于天然核苷酸中的胺例如腺苷和鳥苷實(shí)際上是無(wú)反應(yīng)性的。反應(yīng)性的這種差異構(gòu)成與被導(dǎo)入的伯胺而不是核苷胺選擇性地形成酰胺及相關(guān)結(jié)合基團(tuán)(如脲、硫脲、氨磺酰)之能力的基礎(chǔ)。
如在分子探針供貨目錄(Molecular Probes catalog)(Eugene,OR)中所列出的，胺反應(yīng)性功能基團(tuán)的部分細(xì)目包括活化的羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磺酰鹵和二氯三氮烯?；钚怎ナ菍?duì)胺修飾的極好試劑，因?yàn)樗纬傻孽０樊a(chǎn)物是很穩(wěn)定的。另外，這些試劑與脂族胺有很好的反應(yīng)性，而與寡核苷酸的核苷酸胺則是低反應(yīng)性的?；钚怎サ睦影∟-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯及對(duì)硝基苯基酯。因?yàn)榛钚怎タ捎蓪?shí)際上任何含有羧酸的分子制得，所以它們是很有用的。Bodansky(肽化學(xué)的原理(第二版)，Springer Verlag,London,1993)列出了制造活性酯的方法。
有許多可作為接頭的商品交聯(lián)劑(如參見Pierce Cross-linkers,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。其中同雙官能胺反應(yīng)性交聯(lián)劑的例子是同雙官能亞氨酸酯和N-羥基琥珀酰亞氨(NHS)酯。還存在具有兩個(gè)或多個(gè)不同反應(yīng)性基團(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑，其允許進(jìn)行系列反應(yīng)。亞氨酸酯在堿性pH條件下與胺迅速反應(yīng)。當(dāng)NHS酯與伯或仲胺反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的產(chǎn)物。馬來(lái)酰亞胺、烷基鹵和芳基鹵、α-鹵酰基和吡啶二硫化物是巰基反應(yīng)性的。在pH6.5-7.5范圍內(nèi)馬來(lái)酰亞胺是對(duì)巰基(硫氫基)基團(tuán)特異的，并在堿性pH可變成胺反應(yīng)性的。在生理?xiàng)l件下硫醚鍵是穩(wěn)定的。α-鹵乙酰基交聯(lián)劑含有碘乙?；鶊F(tuán)并且是對(duì)巰基有反應(yīng)性的。咪唑可與碘乙?；鶊F(tuán)反應(yīng)，但反應(yīng)非常緩慢。吡啶二硫化物與巰基基團(tuán)反應(yīng)形成二硫鍵。碳二亞胺將羧基化合物偶聯(lián)到酰肼的伯胺上以形成酰基-肼鍵。芳基疊氮化物是在接觸紫外或可見光之前呈化學(xué)惰性的光親和試劑。當(dāng)這樣的化合物在250-460nm光解時(shí)，形成反應(yīng)性芳基氮烯。反應(yīng)性芳基氮是烯相對(duì)非特異的。乙二醛對(duì)精氨酸的胍基部分有反應(yīng)性。
在本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方案中，首先使標(biāo)記結(jié)合到接頭上，然后再使標(biāo)記和接頭的組合體結(jié)合到MOI上，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)T-L-MOI?；蛘?，可首先使接頭結(jié)合到MOI，然后再使接頭和MOI的組合體結(jié)合到標(biāo)記上。一個(gè)例子是其中MOI為DNA引物或寡核苷酸。在這種情況下，典型的是首先使標(biāo)記與接頭結(jié)合，然后再使T-L結(jié)合到DNA引物或寡核苷酸上，所得組合體即可用于測(cè)序反應(yīng)。
一種有用的形式是其中使標(biāo)記通過(guò)化學(xué)敏感性接頭可逆性地連接到MOI(如寡核苷酸或DNA測(cè)序引物)上。接頭的一種優(yōu)選設(shè)計(jì)使接頭接觸到揮發(fā)性有機(jī)酸例如三氟乙酸(TFA)時(shí)被裂解。特別是TFA適于與包括電噴射法在內(nèi)的大多數(shù)MS離子化方法配合使用。
如下文詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供基因型鑒定的方法?？捎糜诨蛐丸b定的組合物包括有下示通式的多個(gè)化合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，至少兩個(gè)化合物具有同樣的Tms，但這些分子的MOI基團(tuán)具有不同的核酸長(zhǎng)度。
另一種用于基團(tuán)分型方法的組合物包括多個(gè)有下示通式的化合物Tms-L-MOI其Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟的至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。該組合物中，至少兩個(gè)化合物具有同樣的Tms，但那些化合物在柱層析中具有不同的洗脫時(shí)間。
可用于基因型鑒定的另一種組合物包括多個(gè)有下列通式的化合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟的至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。該組合物中，沒(méi)有兩個(gè)化合物具有同樣MOI核苷酸長(zhǎng)度且有同樣的Tms。
在上述組合物中，多個(gè)是是大于2，最好是大于4。另外，MOI中的核酸片段具有與載體的一部分互補(bǔ)的序列，其中片段能夠引導(dǎo)多核苷酸合成。多個(gè)化合物中成員的Tms基團(tuán)最好至少差2amu，并可至少差4amu。
本發(fā)明還提供包括多組化合物的組合物，每組化合物都有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟的至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，第一組化合物中的成員具有完全相同的Tms基因，但具有不同的MOI基團(tuán)，即MOI中有不同數(shù)目的核苷酸；并且第一組內(nèi)至少有10個(gè)成員，其中各組間Tms基團(tuán)至少相差2amu。多組較好是至少3組，且最好是至少5組。
本發(fā)明還提供包括多組化合物的組合物，每組化合物都下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟的至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，一組內(nèi)的化合物具有同樣的洗脫時(shí)間，但有不同的Tms基團(tuán)。
此外，本發(fā)明提供了用于基因型鑒定的試劑盒。試劑盒包括多個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)，其中至少一個(gè)引物有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟的至少一種，并可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其余部分裂解出含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自于叔胺、季胺和有機(jī)酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。并且每個(gè)引物對(duì)都與不同的位點(diǎn)結(jié)合。在試劑盒中，所說(shuō)的多個(gè)是至少3個(gè)，且最好至少5個(gè)。
如上所述，本發(fā)明提供了測(cè)定核酸分子序列的組合物及方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這樣的方法總地包括以下步驟(a)產(chǎn)生標(biāo)記的核酸片段，其互補(bǔ)于從核酸分子之第一末端到第二末端的選擇的核酸分子(如標(biāo)記的片段)，其中標(biāo)記是與特定的或選擇的核苷酸相互關(guān)聯(lián)的，并可用許多檢測(cè)方法的任一種檢測(cè)，(b)按序列長(zhǎng)度分離標(biāo)記的片段，(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記，以及(d)檢測(cè)標(biāo)記，并從而確定核酸分子的序列。下面更詳?shù)赜懻摳鱾€(gè)方面。B．診斷方法1．引言如上文指出的，本發(fā)明還提供各種可利用上述標(biāo)記和/或接頭以代替?zhèn)鹘y(tǒng)標(biāo)記(如放射活性或酶標(biāo)記)的方法，借以在給定的方法中提高特異性、靈敏度、或可同時(shí)分析的樣品數(shù)目?？商岣呱鲜鲂再|(zhì)的有代表性的方法包括RNA擴(kuò)增(參見Lizardi等，生物技術(shù)(Bio/Technology)6:1197-1202,1988；Kramer等，自然(Nature)339:401-402,1989；Lomeli等，臨床化學(xué)(Clinical Chem.)35(9):1826-1831,1989；美國(guó)專利No.4,786,600)，及利用LCR或聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)的DNA擴(kuò)增(參見美國(guó)專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了鑒定核酸分子或片段(或檢測(cè)選擇的核酸分子或片段的存在)的方法，其包括以下步驟(a)從一個(gè)或多個(gè)選擇的核酸分子產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定的核酸片段相互關(guān)聯(lián)的；并且是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按大小分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法和電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而鑒定核酸分子。
在本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了檢測(cè)選擇的核酸分子的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標(biāo)記的核酸探針與互補(bǔ)的所選靶核酸序列雜交的條件下使標(biāo)記的核酸探針與靶核酸分子結(jié)合足夠長(zhǎng)時(shí)間，其中標(biāo)記的核酸探針是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)改變雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子、或探針靶雜交體的大?。?c)按大小分離標(biāo)記的探針；(d)從標(biāo)記的探針上切掉標(biāo)記；以及(e)用非熒光光譜法和電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定選擇的核酸分子。下面更詳細(xì)地討論這些和其他相關(guān)技術(shù)。
2．PCR
PCR可在數(shù)小時(shí)內(nèi)數(shù)億次地?cái)U(kuò)增任何來(lái)源(病毒、細(xì)菌、植物或人)的所需DNA序列。因?yàn)镻CR反應(yīng)是高度特異的、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，并且能夠擴(kuò)增極小量的樣品，所以是特別有價(jià)值的。為此，PCR已對(duì)臨床醫(yī)學(xué)、遺傳性疾病的診斷、法醫(yī)科學(xué)及進(jìn)化生物學(xué)產(chǎn)生了巨大影響。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，PCR是一種基于專門化聚合酶的方法，該酶可在含有4種DNA堿基和靶序列側(cè)翼的2個(gè)DNA片段(引物，各大約20堿基長(zhǎng))的混合物中合成給定的DNA鏈的互補(bǔ)鏈。加熱混合物以分離合有靶序列之雙DNA各鏈，然后冷卻以使(1)引物找到并結(jié)合到分離的鏈上的其互補(bǔ)序列，并且(2)聚合酶將引物延伸成新的互補(bǔ)鏈。重復(fù)加熱和冷卻循環(huán)以成指數(shù)倍增靶DNA，因?yàn)槊看涡碌碾p鏈分離就變成兩個(gè)進(jìn)一步合成新鏈的模板。在1小時(shí)中，20次PCR循環(huán)可將靶序列擴(kuò)增一百萬(wàn)倍。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，提供了利用PCR技術(shù)鑒定例如生物學(xué)樣品中的核酸分子，或檢測(cè)選擇的核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法包括在PCR期間產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段，并按大小分離所得片段的步驟?？衫帽疚拿枋龅娜魏渭夹g(shù)完成大小分離步驟，其中包括凝膠電泳(如聚丙烯酰胺凝膠電泳)或更好是HPLC。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記，并用各種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)之。本文已描述了這類技術(shù)的例子，其中包括質(zhì)譜、紅外光譜、恒電勢(shì)電流測(cè)定或紫外光譜等。3．RNA指紋法和差別顯示法當(dāng)模板是RNA時(shí)，指紋法中的第一個(gè)步驟是逆轉(zhuǎn)錄。Liang和Pardee(科學(xué)(Science)257:967,1992)首先描述了一種RNA指紋方法，其中使用基于Oligo(dT)但在5′末端有兩個(gè)堿基“錨”的逆轉(zhuǎn)錄引物(如Oligo5′-(dT11)CA-3′)。引導(dǎo)主要發(fā)生在poly(A)尾的5′末端，并且主要在截至到5′-UpG-poly(rA)-3′的序列中，選擇性地接近1/12的聚脈苷酸化RNA。逆轉(zhuǎn)錄并變性之后，在所得第一條cDNA鏈上進(jìn)行隨意引導(dǎo)?，F(xiàn)在可使用PCR產(chǎn)生產(chǎn)物的指紋結(jié)構(gòu)，其最好地匹配引物并且衍生于mRNA和聚腺苷酸化異源RNA的3′末端。該方案已被稱為“差異展示”(differential display)。
或者，也可在反轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)步驟中使用隨機(jī)引物，選擇那些在與引物的3′末端有6-8堿基匹配的RNA內(nèi)部區(qū)域。在此之后用相同或不同的任意引物隨機(jī)引導(dǎo)所得到的第一條cDNA鏈，并進(jìn)行PCR。這種特殊方案適用于RNA中任何位置，包括開放讀框(Welsh等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)20:4965,1992)。另外，其可使用在未聚腺苷酸化的RNA上，例如許多細(xì)菌RNA上。這種由任意引物PCR得到的RNA指紋法的變化形式稱為RAP-PCR。
如果對(duì)已經(jīng)受了不同的實(shí)驗(yàn)處理或有不同發(fā)育歷史的細(xì)胞、組織或其他生物材料的樣品進(jìn)行RNA的任意引物PCR指紋分析，可檢測(cè)樣品間基因表達(dá)的差異。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，假設(shè)發(fā)生同樣數(shù)目的有效PCR倍增事件，并且cDNA產(chǎn)物初始濃度的差異都作為最終指紋強(qiáng)度的比率而保留。在凝膠上的單一泳道內(nèi)的帶強(qiáng)度之間沒(méi)有有意義的聯(lián)系，強(qiáng)度是匹配和長(zhǎng)度的函數(shù)。但每種上樣的RNA保持各泳道間的比例，從而得以檢測(cè)差異表達(dá)的RNA。即使在循環(huán)的次數(shù)足以使PCR反應(yīng)達(dá)到飽和時(shí)，仍保持樣品間起始材料的比例。這是因?yàn)檫_(dá)到飽和所需的倍增數(shù)幾乎完全受構(gòu)成大部分指紋的恒定產(chǎn)物的控制。在這方面，PCR指紋法不同于單一產(chǎn)物的常規(guī)PCR，在常規(guī)方法中，除非在擴(kuò)增的指數(shù)期取產(chǎn)物樣品，否則不能保持樣品間的起始材料比例。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了利用RNA指紋技術(shù)檢定例如生物樣品中的核酸分子，或檢測(cè)選擇的核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法一般包括產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段的步驟。經(jīng)PCR或相似的擴(kuò)增程序產(chǎn)生片段，然后按大小分離之。大小分離步驟例如可以是本文所描述的任何技術(shù)，例如包括凝膠電泳(如聚丙烯酰胺凝膠電泳)或優(yōu)選的HPLC。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記，并用相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)記。適用技術(shù)的代表性例子包括質(zhì)譜、紅外光譜、恒電勢(shì)電流測(cè)定法或紫外光譜法。任何給定的核酸片段的相對(duì)量并不重要，但當(dāng)參照對(duì)照樣品時(shí)帶的大小是可提供信息的。
4．基于熒光的PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)除RFLP方法外，還有幾種方法可用于分析堿基替代多態(tài)性。Orita等人已設(shè)計(jì)了一種基于變性DNA中構(gòu)象差異分析這些多態(tài)性的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用限制性酶消化或PCR產(chǎn)生相對(duì)小的DNA片段，然后變性并在非變性聚丙烯酰胺凝上電泳分辨之。堿基替代導(dǎo)致的單鏈DNA片段中構(gòu)象差異是根據(jù)電泳遷移率檢測(cè)的。鏈內(nèi)堿基配對(duì)產(chǎn)生高度序列特異性的并且電泳遷移率不同的單鏈構(gòu)象。然而，在使用常規(guī)SSCP進(jìn)行的不同研究中檢測(cè)率范圍從35％到近100％，同時(shí)最高檢測(cè)率常常需要幾種不同的條件。原則上，也可用該方法分析基于短的插入式缺失的多態(tài)性。該方法是鑒定DNA中點(diǎn)突變和缺失的最強(qiáng)有力的工具之一(SSCP-PCR,Dean等，細(xì)胞(Cell)61:863,1990)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供利用PCR-SSP的技術(shù)檢測(cè)例如生物學(xué)樣品中選擇的核酸分子或鑒定核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法一般包括產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段的步驟。然后按大小分離經(jīng)PCR產(chǎn)生的片段。大小分離步驟最好是非變性的，并且在分離方法處理之前變性處理核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或HPLC法完成大小分離步驟。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記并用相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)(如質(zhì)譜法、紅外光譜法、恒電勢(shì)電位測(cè)定法或紫外光譜法)檢測(cè)標(biāo)記。
5．雙脫氧指紋法(ddF)已描述過(guò)另一種方法(ddF,Sarkar等，基因組(Genomics)13:441,1992)，當(dāng)以回顧或前展方式試驗(yàn)時(shí)，用于檢測(cè)人IX因子基因中的100％單個(gè)堿基改變。當(dāng)分析患乙型肝炎病人的基因組DNA時(shí)，檢測(cè)到全部84個(gè)不同的序列改變。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，當(dāng)將標(biāo)記用于基因型鑒定或其他目的時(shí)，可以使用的另一種方法是雙脫氧指紋化。該方法利用Sanger測(cè)序反應(yīng)中的二脫氧終止子。該方法的原理如下將待測(cè)序的靶核酸放在具有雙脫氧終止子的反應(yīng)中，該終止子互補(bǔ)于靶核酸中已知發(fā)生了突變的堿基。例如，如果突變導(dǎo)致A→G的改變，反應(yīng)應(yīng)在C雙脫氧終止子反應(yīng)中完成。使用PCR引物定位和擴(kuò)增感興趣的靶序列。如果推測(cè)的靶序列含有A→G改變，則由于在擴(kuò)增的序列中摻入雙脫氧終止子而改變序列群體的大小。在標(biāo)記的這一特定應(yīng)用中，將產(chǎn)生一個(gè)在突變情況下具有可推測(cè)大小的片段?？蓪?biāo)記連接到PCR引物的5′末端上并提供標(biāo)示樣品類型和雙脫氧終止子類型的“圖譜”。發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)，例如可用HPLC或PAGE方法按大小分離所得到的片段。在分離步驟結(jié)束時(shí)，將DNA片段收集在一個(gè)時(shí)序參考框中，裂解標(biāo)記，由于摻入給定的雙脫氧終止子而產(chǎn)生早熟鏈，故可根據(jù)鏈長(zhǎng)度來(lái)確定有無(wú)突變。
應(yīng)特別提到的是，ddf導(dǎo)致雙脫氧終止區(qū)段的獲得或丟失，和/或獲得或一個(gè)終子區(qū)段或產(chǎn)物的遷移率變動(dòng)。因此，在該方法中是在高本底的其他分子量片段中搜索一個(gè)片段遷移率的變動(dòng)。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是預(yù)知與設(shè)定的突變相聯(lián)系的片段長(zhǎng)度。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供利用PCR-SSP技術(shù)鑒定例如生物學(xué)樣品中核酸分子或檢測(cè)選擇的核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法一般包括產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段的步驟。然后按大小分離片段。大小分離步驟最好是非變性的，并且在分離方法處理之前變性處理核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或優(yōu)選的HPLC法完成大小分離步驟。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記并用相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)(如質(zhì)譜法、紅外光譜法、恒電勢(shì)電位測(cè)定法或紫外光譜法)檢測(cè)標(biāo)記。
6．限制性圖譜和RFLP限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別短的DNA序列和在那些特異性位點(diǎn)切割DNA片段。某些限制性酶(rare-cutter)的切割位點(diǎn)很稀少，從而產(chǎn)生小數(shù)目的很大片段(幾千至百萬(wàn)bp)。大多數(shù)酶很頻繁地切割DNA，從而產(chǎn)生大量小的片段(小于一百至大于一千bp)。有4堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性酶將產(chǎn)生平均256堿基長(zhǎng)的片段，6堿基識(shí)別位點(diǎn)將產(chǎn)生4000堿基長(zhǎng)的片段，8堿基識(shí)別位點(diǎn)將產(chǎn)生64,000堿基長(zhǎng)的片段。因?yàn)橐谚b定了數(shù)百種不同的限制性酶，故可將DNA切割成許多不同的小片段。
已建立了許多分析DNA多態(tài)性的技術(shù)。最廣泛使用的方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法、聯(lián)合限制性酶消化、凝膠電泳、膜轉(zhuǎn)印跡和與克隆DNA探針雜交等。根據(jù)印跡上標(biāo)記片段長(zhǎng)度的變化檢測(cè)多態(tài)性?？墒褂肞FLP方法來(lái)分析當(dāng)序列改變落入限制性酶切點(diǎn)內(nèi)時(shí)堿基替代，或者通過(guò)選擇在重復(fù)單元以外切割的限制酶分析小衛(wèi)星/VNTR。瓊脂糖凝膠通常不能提供區(qū)分相差單一重復(fù)單元的小衛(wèi)星/VNTR等位基因所需的分率率，但許多小衛(wèi)星/VNTR是可變的，故仍可得到有高度信息價(jià)值的標(biāo)志。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供利用限制性圖譜技術(shù)或RFLP鑒定例如生物學(xué)樣品中的核酸分子，或檢測(cè)選擇的核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法一般包括產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段的步驟，其中所產(chǎn)生的片段用限制性酶消化。通過(guò)進(jìn)行標(biāo)記探針與經(jīng)過(guò)消化的靶核酸的雜交步驟產(chǎn)生標(biāo)記片段。雜交步驟可在限制性核酸酶消化之前或之后進(jìn)行。然后按大小分離所得到的消化的核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或優(yōu)選的HPLC法完成大小分離步驟。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記并用相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)(如質(zhì)譜法、紅外光譜法、恒電勢(shì)電位測(cè)定法或紫外光譜法)檢測(cè)標(biāo)記。
7．DNA指紋法DNA指紋法包括展示來(lái)自特定DNA樣品中的一組DNA片段。目前已有多種DNA指紋技術(shù)(Jeffries等，自然314:67,1985；Welsh和McClelland，核酸研究19:861,1991)，其中大多數(shù)是使用RCR產(chǎn)生片段。選用何種指紋技術(shù)要決決于應(yīng)用目的，例如DNA分型、DNA標(biāo)記作圖及研究例如原核生物、植物、動(dòng)物、人等生物體。在過(guò)去的幾年里已發(fā)展了許多適合這些需要的指紋方法，包括隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)、DNA擴(kuò)增指紋(DAF)和任意引物PCR(AP-PCR)。這些方法都是基于用任意選擇的PCR引物擴(kuò)增隨機(jī)基因組DNA片段。可在沒(méi)有序列知識(shí)的情況下產(chǎn)生任何DNA的DNA片段圖形。所產(chǎn)生的圖形取決于PCR引物的序列和模板DNA的性質(zhì)。在低退火溫度下完成PCR，以使引物退火到DNA的多個(gè)基因座上。當(dāng)引物結(jié)合位點(diǎn)是在允許擴(kuò)增的距離范圍內(nèi)時(shí)產(chǎn)生DNA片段。原則上，單個(gè)引物即足以產(chǎn)生帶型圖。
已描述了一種稱為AFLP的DNA指紋新技術(shù)(Vos等，核酸研究23:4407,1995)。AFLP技術(shù)是基于用PCR擴(kuò)增法檢測(cè)基因組限制性片段，并可用于檢測(cè)任何來(lái)源的或復(fù)合來(lái)源的DNA。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用有限的通用引物對(duì)在沒(méi)有先前的序列知識(shí)的情況下產(chǎn)生指紋?？山?jīng)選擇特定的引物組來(lái)“協(xié)調(diào)”在單一反應(yīng)中檢測(cè)的片段數(shù)目。AFLP技術(shù)是堅(jiān)定可靠的，因?yàn)槠渲幸锿嘶鹗褂昧藝?yán)格的反應(yīng)條件PFLP技術(shù)的可靠性是與PCR技術(shù)的效率相結(jié)合的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了利用DNA指紋技術(shù)鑒定例如生物學(xué)樣品中的核酸分子，或檢測(cè)選擇的核酸分子的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些方法一般包括產(chǎn)生一系列標(biāo)記的核酸片段，然后按大小分離片段的步驟。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或HPLC法完成大小分離步驟。然后從分離的片段上裂解掉標(biāo)記，并用相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)(如質(zhì)譜法、紅外光譜法、恒電勢(shì)電位測(cè)定法或紫外光譜法)檢測(cè)標(biāo)記。
8．可裂解的標(biāo)記應(yīng)用于基因型鑒定和多態(tài)性檢測(cè)a．引言雖然有少數(shù)已知的人DNA多態(tài)性是基于非重復(fù)序列的插入、缺失或其他重排，但絕大多數(shù)還是基于單個(gè)堿基取代或串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目的改變。堿基取代在人基因組中是很常見的，平均每200-500bp出現(xiàn)一次。串聯(lián)重復(fù)序列的長(zhǎng)度變化在基因組中也是常見的，數(shù)千個(gè)堿基中至少有數(shù)十個(gè)散在的多態(tài)位點(diǎn)(稱為基因座)。串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性的重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度范圍為(dA)n(dT)n序列中的1bp至α-衛(wèi)星DNA中的至少170bp。串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性可分為兩大類，其由小衛(wèi)星/可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)(典型的重復(fù)長(zhǎng)度為數(shù)十個(gè)堿基對(duì)并有數(shù)十至數(shù)千總重復(fù)單位)及微衛(wèi)星(重復(fù)長(zhǎng)度最多6bp且最大總長(zhǎng)度約為70bp)組成。迄今所鑒定的大多數(shù)微衛(wèi)星多態(tài)性是基于(dC-dA)n或(dG-dT)n二核苷酸重復(fù)序列的。微衛(wèi)星多態(tài)性的分析包括以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增含有重復(fù)段的小DNA片段，然后在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離擴(kuò)增的DNA。PCR引物互補(bǔ)于側(cè)接于重復(fù)段的獨(dú)特序列。按傳統(tǒng)使用聚丙烯酰胺凝膠，而不是瓊脂糖凝膠分離微衛(wèi)星，因?yàn)榈任换蜷g的大小常常只差一個(gè)重復(fù)段。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面提供了對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定的方法，其包括以下步驟(1)從選擇的靶分子產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定的片段相互關(guān)聯(lián)的，并且是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的，(b)按序列長(zhǎng)度分離標(biāo)記的分子，(c)從標(biāo)記的分子上裂解標(biāo)記，以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定生物體的基因型。
在另一個(gè)方面，提供了對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標(biāo)記分子與靶分子雜交的條件和時(shí)間下使標(biāo)記的核酸分子與選擇的靶分子結(jié)合，其中標(biāo)記是與特定的片段相互關(guān)聯(lián)并且可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按序列的長(zhǎng)度分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定生物體的基因型。
b．可裂解標(biāo)記應(yīng)用于基因型鑒定PCR方法鑒定限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PFLP)結(jié)合了凝膠電泳和檢測(cè)與特定PCR引物相關(guān)的標(biāo)記。一般說(shuō)來(lái)，一個(gè)PCR引物將具有一個(gè)特異的標(biāo)記。因此標(biāo)記將代表一組PCR引物并進(jìn)而代表預(yù)定的DNA片段長(zhǎng)度。根據(jù)凝膠中或凝膠洗脫物中標(biāo)記的片段長(zhǎng)度的變化測(cè)定多態(tài)性。聚丙烯酰胺凝膠電泳通常將提供區(qū)分相差單個(gè)重復(fù)單位的小衛(wèi)星/VNTR等位基因所需的分辨率。分析微衛(wèi)星多態(tài)性涉及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增含有重復(fù)片段的DNA小片段，然后在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離擴(kuò)增的DNA，或然后以HPLC法分離DNA片段。擴(kuò)增的DNA將用在引物5′末端有可裂解標(biāo)記的引物標(biāo)記。經(jīng)鏈延伸后引物被摻入到新合成的鏈中。PCR引物互補(bǔ)于側(cè)接于重復(fù)段片段的獨(dú)特序列。也可以如上述微衛(wèi)星一樣多地?cái)U(kuò)增小衛(wèi)星/VNTR多態(tài)性。
對(duì)許多類型DNA序列多態(tài)性的描述已提供了了解人類基因組結(jié)構(gòu)的根本性基礎(chǔ)(Botstein等,Am.J.Human Genetics 32:p314,1980；Donis-Keller，細(xì)胞51:319,1987；Weissenbach等，自然359:794)。使用這些DNA多態(tài)性促進(jìn)了廣泛構(gòu)架連鎖圖的構(gòu)建，并已為由連鎖定位疾病基因提供了實(shí)際可行為手段。微衛(wèi)星二核苷酸標(biāo)記正顯示為鑒定已證明含有突變并在某些情況下引起疾病的人類基因的有力工具?；蚪M二核苷酸重復(fù)是高多態(tài)性的(Weber,1990,基因組分析,Vol.1,pp.159-181,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Weber和Wong,1993,Hum.Mol.Genetics,2,p1123)并可具有多達(dá)24個(gè)等位基因。可使用與二核苷酸重復(fù)段周圍的獨(dú)特區(qū)域互補(bǔ)的引物以PCR法擴(kuò)增微衛(wèi)星二核苷酸重復(fù)。擴(kuò)增后，合并幾個(gè)擴(kuò)增的基因座(多重化)，然后按大小分離。將擴(kuò)增的微衛(wèi)星片段應(yīng)用于大小分離步驟，然后鑒定大小并進(jìn)而鑒定等位基因的方法即所謂的基因型鑒定。已報(bào)導(dǎo)了將允許高度多重復(fù)合的染色體特異性標(biāo)記用于全基因掃描以進(jìn)行連鎖分析(Davies等，1994,自然371,p130)。
可在與微衛(wèi)星有關(guān)的基因型鑒定中使用標(biāo)記來(lái)發(fā)揮作用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，構(gòu)建攜帶標(biāo)記的PCR引物并用于小心選擇的PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增二、三或四核苷酸重復(fù)序列。然后用HPLC或PAGE等方法按大小分離擴(kuò)增產(chǎn)物。以時(shí)序方式收集DNA片段，從各個(gè)DNA片段上裂解掉標(biāo)記并根據(jù)與大小分離步驟中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的比較來(lái)推測(cè)長(zhǎng)度。參考擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行等位基因鑒定。
借助可裂解標(biāo)記進(jìn)行基因型鑒定，有可能將多個(gè)樣品合并到單一分離步驟上。實(shí)現(xiàn)這一目的有兩種通用方法。用于高通過(guò)量篩選的第一種通用方法是檢測(cè)一大群個(gè)體中的單一多態(tài)性。在該方法中使用單一或重疊組的PCR引物，并且每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)用一種類型的DNA樣品進(jìn)行?？稍诜植襟E中合并的樣品數(shù)目與每種檢測(cè)技術(shù)可產(chǎn)生的可裂解標(biāo)記的數(shù)目(即用于質(zhì)譜儀的400-600個(gè)標(biāo)記)成正比。因此可同時(shí)鑒定一大群個(gè)體中的1個(gè)至幾個(gè)多態(tài)性。第二種方法是使用可對(duì)單一DNA樣品鑒定許多多態(tài)性(例如鑒定個(gè)體的基因型)的多組PCR引物。在該方法中，將PCR引物合并在產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物的單一擴(kuò)增反應(yīng)中。每個(gè)引物對(duì)或重疊的引物組均由一特異的可裂解標(biāo)記編碼，這就意味著每個(gè)PCR片段將由一特異性標(biāo)記編碼。基于單一分離步驟進(jìn)行反應(yīng)(見下文)?？稍诜植襟E中合并的樣品數(shù)目與每種檢測(cè)技術(shù)可產(chǎn)生的可裂解標(biāo)記的數(shù)目(即用于質(zhì)譜儀的400-600個(gè)標(biāo)記)成正比。
c．突變的酶檢測(cè)法和標(biāo)記的應(yīng)用在該特定應(yīng)用或方法中，經(jīng)酶促裂解給定核酸雙鏈中錯(cuò)配的堿基對(duì)來(lái)檢測(cè)異源雙鏈中的錯(cuò)配。使用一組特異性引物以PCR方法擴(kuò)增待檢查是否存在突變的DNA序列，變性處理擴(kuò)增的產(chǎn)物，與變性的參考片段混合并雜交，從而導(dǎo)致異源雙鏈的形成。然后用如果存在錯(cuò)配時(shí)可識(shí)別并裂解雙鏈的酶處理異源雙鏈。這樣的酶可以是核酸酶S1、綠豆核酸酶、“解離酶”、T4核酸內(nèi)切酶Ⅳ等?；旧峡墒褂萌魏我环N在體外識(shí)別錯(cuò)配并裂解所產(chǎn)生之錯(cuò)配的酶。用適當(dāng)?shù)拿柑幚恚缬肏PLC或PAGE方法按大小分離DNA雙鏈。按時(shí)序收集DNA片段。裂解并檢測(cè)標(biāo)記。根據(jù)片段的遷移率相對(duì)于野生型參考片段所出現(xiàn)的偏移檢測(cè)突變的存在。
d．標(biāo)記應(yīng)用于寡核苷酸連接檢測(cè)法(OLA)最初由Landegren等人(Landergren等，科學(xué)241:487,1988)描述的寡核苷酸連接檢測(cè)法是一種鑒定(已知)很大而復(fù)雜的基因組中的序列的有用技術(shù)。OLA反應(yīng)的原理是基于當(dāng)兩個(gè)診斷寡核苷酸在特定的DNA靶上彼此相鄰而雜交時(shí)，連接酶共價(jià)連接它們的能力。如果在探針接合處的序列不是完美堿基配對(duì)時(shí)，探針將不被連接酶連接。當(dāng)位于“上游”探針的3′端時(shí)，熱穩(wěn)定性連接酶區(qū)分潛在的單個(gè)堿基配對(duì)差異的能力為分辨單個(gè)堿基配對(duì)提供了機(jī)會(huì)(Barony,PNAS USA 88:189,1991)。在標(biāo)記的應(yīng)用中，標(biāo)記應(yīng)附著于被連接到擴(kuò)增產(chǎn)物上的探針上。完成OLA后，基于大小分離各片段，裂解標(biāo)記并以質(zhì)譜法檢測(cè)之。
e．序列特異性擴(kuò)增可使用有互補(bǔ)于突變體或正常寡核苷酸序列之3′末端的PCR引物選擇性地?cái)U(kuò)增一個(gè)或其他等位基因(Newton等，核酸研究，17,p2503；1989，基因組，5,p535；Okayama等，1989,J.Lab.Clin.Med.,114,p105；Sommer等,1989,Mayo Clin.Proc.,64,1361；Wu等,PNAS USA,86,p2757)。在經(jīng)PAGE擴(kuò)增后通?？娠@現(xiàn)出PCR產(chǎn)物，但序列特異性擴(kuò)增的原則可被應(yīng)用于固相程式。
f．標(biāo)記在某些基于擴(kuò)增的檢測(cè)法方面的潛在應(yīng)用病毒的基因型鑒定標(biāo)記的一個(gè)潛在應(yīng)用是通過(guò)與標(biāo)記的探針雜交對(duì)病毒進(jìn)行基因型鑒定或病毒鑒定。例如，F(xiàn)+RNA大腸桿菌噬菌體可能是腸內(nèi)病毒污染之指示劑的有用候選物。以核酸雜交方法進(jìn)行基因型鑒定是可代替血清分型的可靠、快速、簡(jiǎn)便而又便宜的方法(Kafatos等，核酸研究7:1541,1979)。擴(kuò)增技術(shù)和核酸雜交技術(shù)已被成功地就用于分類各種微生物，其中包括大腸桿菌(Feng，分子細(xì)胞探針(Mol.Cell Probes)7:151,1993)、輪狀病毒(Sethabutr等，J.Med.Virol.37:192,1992)、丙型肝炎病毒(Stuyver等，J.Gen.Virol.74:1093,1993)和單純皰疹病毒(Matsumoto等，J.Virol.Methods 40:119,1992)。
腫瘤中突變分析的預(yù)后應(yīng)用已描述了各種實(shí)驗(yàn)性哺乳動(dòng)物和人惡性病變中的基因改變，并代表了在腫瘤發(fā)生中所觀察到的先后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)(Vogelstein等，NEJM 319:525,1988)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，已對(duì)某些染色體上的等位基因丟失或腫瘤抑制基因的突變以及幾種癌基因(例如c-myc、c-jun和ras家族)作了大量研究。先前的工作(Finkelstein等，Arch.Surg.128:526,1993)已鑒定了K-ras癌基因中特定類型的點(diǎn)突變與結(jié)腸癌診斷的階段之間的相互關(guān)系。結(jié)果提示突變分析可提供有關(guān)腫瘤侵占性的重要信息，包括轉(zhuǎn)移的模式和擴(kuò)散。最近已證明了對(duì)三期結(jié)腸癌所作TP53和K-ras-2突變分析的預(yù)后價(jià)值(Pricolo等，Am.J.Surg.171:41,1996)。因此可以明顯看出，對(duì)腫瘤和癌前細(xì)胞的基因型鑒定，以及特異性突變檢測(cè)在人類腫瘤的治療中將變得越來(lái)越重要。C．DNA片段的分離需要分析的樣品常常是在復(fù)雜基質(zhì)中的許多成分的混合物。對(duì)于含有未知成分的樣品，必須將各成分彼此分離開，從而可用其他分析方法鑒定每種個(gè)別成份。在恒定條件下混合物中各成份的分離性質(zhì)是恒定的，一旦檢定后即可利用這些分離性質(zhì)去鑒定和定量每種成份。這樣的方法在層析和電泳分析性分離中是很典型的。
1．高效液相層析(HPLC)高效液相層析(HPLC)是分離溶解于溶液中之化合物的層析分離技術(shù)。HPLC裝置由流動(dòng)相儲(chǔ)存器、泵、注樣器、分離柱和檢測(cè)器組成。向柱內(nèi)注射等分的樣品混合物以分離化合物?；旌衔镏胁煌煞萦捎谒鼈?cè)诹鲃?dòng)液相和固定相之間的分配行為不同，而以不同的速率通過(guò)柱。
最近，已顯示在帶有化學(xué)結(jié)合的烷基鏈的非多孔PS/DVB顆粒上進(jìn)行IP-RO-HLPC在分析雙和單鏈核酸中可替代毛細(xì)管電泳，提供迅速分離和相似程度的分辨率(Huber等，1993,Anal.Biochem.,212,p351；Huber等，1993，核酸研究，21,p1061；Huber等,1993,生物技術(shù)(Biotechniques),16,p898)。與離子交換層析相反，其并不總是以鏈長(zhǎng)度的函數(shù)保留雙鏈DNA(因?yàn)锳T堿基對(duì)與帶正電荷的固定相相互作用比GC堿基對(duì)更強(qiáng))，IP-RP-HPLC能夠嚴(yán)格地依據(jù)大小進(jìn)行分離。
已發(fā)展了使用乙酸三乙銨作為離子配對(duì)試劑的方法，可借助高效液相層析法在烷基化非多孔2.3μM聚(苯乙烯-二乙烯基苯)顆粒上成功地分離磷酸二酯寡核苷酸(Oefner等,1994,And.Biochem,223,p39)。所描述的技術(shù)允許分離大小范圍為50到200核苷酸的長(zhǎng)度上只差4至8個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。
2．電泳電泳是基于離子(或如本文所述的DNA)在電場(chǎng)中遷移率的分離技術(shù)。帶負(fù)電荷的DNA遷移向正電極，而帶正電荷的離子則向負(fù)電極泳動(dòng)。為安全起見，一個(gè)電極通常是接地的，另一個(gè)則正或負(fù)向偏置的。帶電的離子或DNA依賴它們的總電荷、大小和形狀不同而有不同的遷移率，并因此可被分離開。電極裝置由高電壓能源、電極、緩沖液和緩沖液的載體如聚丙烯酰胺凝膠，或毛細(xì)管組成。開口毛細(xì)管用于許多類型的樣品，其他凝膠載體則通常用于蛋白質(zhì)混合物或DNA片段等生物學(xué)樣品。
3．毛細(xì)管電泳(CE)毛細(xì)管電泳(CE)正在以其各種表現(xiàn)形式(游離溶液、等速電泳、等電聚焦、聚丙烯酰胺凝膠、膠束電動(dòng)“層析”)發(fā)展為一種以高分辨率迅速分離很小樣品體積的復(fù)雜混合物的方法。與MS的固有靈敏度和選擇性結(jié)合，CE-MS是生物分析的潛在高效率技術(shù)。在本文公開的新的應(yīng)用中，將這兩種方法相對(duì)接將產(chǎn)生其速率超過(guò)目前的測(cè)序方法幾個(gè)數(shù)量級(jí)的優(yōu)越DNA測(cè)序方法。
CE和電噴射離子化(ESI)流速之間的一致性，以及兩者都因(而且主要是用于)溶液中的離子種類而得以簡(jiǎn)化這一事實(shí)提供了極具吸引力的組合基礎(chǔ)。已描述了毛細(xì)管在區(qū)帶電泳(CZE)和毛細(xì)管等速電泳與建立在ESI基礎(chǔ)上的四極質(zhì)譜儀的組合(Olivares等，Anal.Chem.59:1230,1987；Smith等，Anal.Chem.60:436,1988；Loo等，Anal.Chem.179:404,1989；Edmonds等，J.Chroma.474:21,1989；Loo等，J.MicrocolumnSep.1:223,1989；Lee等，J.Chromatog.458:313,1988；Smith等，J.Chromatog.480:211,1989；Grese等，J.Am.Chem.Soc.111:2835,1989)。小肽很容易以高敏感性(飛摩爾)經(jīng)受CZE分析。
DNA片段的最有力的分離方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，通常是板凝膠格式。但當(dāng)前技術(shù)的主要限制是完成對(duì)測(cè)序反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段的凝膠電泳需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。使用毛細(xì)管電泳(其利用超薄凝膠)可實(shí)現(xiàn)數(shù)量級(jí)增加。在游離溶液中，當(dāng)加入堿時(shí)所有DNA均以同樣遷移率遷移到第一點(diǎn)的值，從而導(dǎo)致質(zhì)量和電荷的補(bǔ)償。在聚丙烯酰胺凝膠中，DNA片段作為長(zhǎng)度的函數(shù)篩分并遷移，并且該方法現(xiàn)已被應(yīng)用于CE。用交聯(lián)聚丙烯酰胺現(xiàn)已達(dá)到每米有很大的塔板數(shù)(每米107塔板，Cohen等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:9660,1988)。如所描述的這樣CE柱也應(yīng)用于DNA測(cè)序。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序儀中，CE的方法原理上比板凝膠電泳快25倍。例如，每小時(shí)可讀出300個(gè)堿基。板凝膠電泳中分離速度受到可在不產(chǎn)生過(guò)多熱產(chǎn)生情況下施加給凝膠的電場(chǎng)大小限制。因此，所達(dá)到的CE速度越大使用的電場(chǎng)強(qiáng)度越高(CE中的300V/cm對(duì)板凝膠電泳中的10V/cm)。毛細(xì)管方法降低了電流量并因而降低了電能和熱量生成。
Smith等人(Smith等，核酸研究18:4417,1990)已提出平行使用多個(gè)毛細(xì)管以增加通過(guò)量。同樣Mathies和Huang(Mathies和Huang，自然359:167,1992)已引入了在平行陣列的毛細(xì)管上完成分離并證明有高測(cè)序通過(guò)量的毛細(xì)管電泳(Huang等，Anal.Chem.64:967,1992；Huang等，Anal.Chem.64:2149,1992)。毛細(xì)管電泳的主要缺點(diǎn)是可裝在毛細(xì)管上的樣品數(shù)量有限。在毛細(xì)管電泳開始時(shí)，分離前濃縮大量樣品可增加負(fù)載能力，而檢測(cè)水可降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在CE中最通用的預(yù)濃縮方法是樣品堆積。最近已詳述了樣品堆積(Chien和Burgi,Anal.Chem.64:489A,1992)。樣品堆積依賴于樣品緩沖液和毛細(xì)管緩沖液之間的基質(zhì)差異(pH，離子強(qiáng)度)，這樣通過(guò)樣品帶的電場(chǎng)就比毛細(xì)管區(qū)域中的電場(chǎng)大。在樣品堆積中，導(dǎo)入在低濃度緩沖液中的大體積樣品在毛細(xì)管柱的頂部預(yù)濃縮。毛細(xì)管內(nèi)充入同樣成分但有較高濃度的緩沖液。當(dāng)樣品離子達(dá)到毛細(xì)管緩沖液和較低的電場(chǎng)時(shí)，它們就堆積到濃縮帶中。樣品堆積增加可檢測(cè)性1-3個(gè)數(shù)量級(jí)。
預(yù)濃縮的另一種方法是在對(duì)分析物進(jìn)行游離區(qū)帶CE分離之前應(yīng)用等速電泳(ITP)。ITP是允許在毛細(xì)管上裝入微升體積樣品的電泳技術(shù)。該技術(shù)依賴于在分別比分析物有較高和較低遷移率的兩種緩沖液(前導(dǎo)和收尾電解質(zhì))之間插入樣品。該技術(shù)本來(lái)就是一種濃縮技術(shù)，其中分析物濃縮在以同樣速度遷移的區(qū)帶中。該技術(shù)目前不象上述的堆積方法那么通用，這是因?yàn)樗鑾状芜x擇前導(dǎo)和收尾電解質(zhì)，并且在分離進(jìn)行期間只能分離陽(yáng)離子或陰離子分析物。
DNA測(cè)序方法的要點(diǎn)是顯著地選擇性電泳分離DNA或寡核苷酸片段。該方法有顯著的選擇性是因?yàn)槊總€(gè)片段都只根據(jù)核苷酸的差異被分辨出來(lái)。已實(shí)現(xiàn)分離多達(dá)1000個(gè)片段(1000bp)。用可裂解的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序的其他優(yōu)點(diǎn)如下所述。當(dāng)在利用可裂解的標(biāo)記以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離DNA片段時(shí)，不需要使用板凝膠格式。因?yàn)楹喜⒋罅康臉悠?4到2000個(gè))，所以不必象使用現(xiàn)有的染料-引物或染料-終止方法(即AB1373測(cè)序儀)那樣平行地分離樣品。因?yàn)闆](méi)有理由進(jìn)行平行電泳，也就沒(méi)有理由使用板凝膠。因此，可在電泳分離方法中利用管凝膠格式。Grossman(Grrossman等,Genet.Anal.Tech.Appl.9:9,1992)已證明，當(dāng)使用管凝膠格式代替板凝膠格式時(shí)可得到相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)。這是由于與板凝膠相比，在管格式中散失Joule熱的能力更大。從而導(dǎo)致電泳速度更快(快50％)，而對(duì)高分子量DNA片段(大于1000nt)有更高的分辨率。在基因組測(cè)序中讀出長(zhǎng)序列是很關(guān)鍵的。因此，在測(cè)序中使用可裂解標(biāo)記，還具有允許使用者利用最有效和敏感并具有最高分辨率的DNA分離方法的優(yōu)點(diǎn)。
4．微裝配式裝置毛細(xì)管電泳(CE)是DNA測(cè)序、法醫(yī)分析、PCR產(chǎn)物分析及限制性片段大小分離的高效率方法。因?yàn)槊?xì)管凝膠可施加高得多的勢(shì)場(chǎng)，所以CE遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的板PAGE快得多。但CE具有每個(gè)凝膠只能處理一個(gè)樣品的缺點(diǎn)。本方法結(jié)合了CE的更快的分離速度和平行分離多份樣品的能力。使用微裝置式裝置的基本原理是通過(guò)使泳道大小微型化至約100微米，從而能增加電泳中的信息密度。電子工業(yè)常規(guī)使用微裝配技術(shù)制造有小于1微米特征的電路板。目前毛細(xì)管排列的密度限于毛細(xì)管的外徑。通道的微裝配產(chǎn)生高密度的排列。微裝配也允許進(jìn)行用玻璃纖維不可能實(shí)現(xiàn)的物理裝配，并使通道直接連接到電路片的其他裝置上。以前很少在微電路片上構(gòu)建過(guò)用于分離技術(shù)的裝置。已在硅芯片上裝配了氣相層析儀(Terry等，IEEE Trans.Electron Device,ED-26:1880,1979)和液相層析儀(Manz等，Sens.Actuators B1:249,1990)，但這些裝置未被廣泛使用。幾個(gè)研究小組報(bào)導(dǎo)了在微裝配裝置上分離熒光染料和氨基酸(Manz等，J.Chromatography 593:253,1992；Effenhauser等，Anal.Chem,65:2637,1993)。最近Woolley和Mathies(Woolley和Mathies,Proc.Natl.Acad.Sci.91:11348,1994)已證明，可用光刻蝕法和化學(xué)刻蝕法在玻璃基質(zhì)上制造大量的分離通道。通道內(nèi)充入羥乙基纖維素(HEC)分離基質(zhì)。已顯示可在短短兩分鐘內(nèi)分離DNA限制性片段。
D．標(biāo)記的裂解如上文所討論的，不同的接頭設(shè)計(jì)可在不同的特異性物理或化學(xué)條件下提供可裂解性(“敏感性”)。用于裂解各種接頭設(shè)計(jì)的條件包括酸、堿、氧化、還原、氟化物、琉基交換、光解及酶促條件。
可滿足上文列出的接頭的一般性標(biāo)準(zhǔn)的可裂解接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括見于Pierce(Rockord，IL)的商品目錄中的那些接頭。例子包括· 雙(琥珀酰亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)，為可被羥胺裂解(1M,37℃,3-6小時(shí))的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 酒石酸二琥珀酰亞氨酯(DST)和磺基-DST，其為可被0.015M過(guò)碘酸鈉裂解的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 雙[2-(琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和磺基
-BSOCOES，其為可被堿(pH11.6)裂解的胺反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫基(丙酰胺基)丁烷(DPDPB)，可經(jīng)硫羥交換或還原作用裂解的吡啶二硫醇交聯(lián)劑；· N-[4-(對(duì)疊氮基水楊酰胺基)-丁基]-3′-(2′-吡啶二硫基)丙酰胺(APDP)，為可經(jīng)硫羥交換或還原裂解的吡啶二硫醇交聯(lián)劑；· 雙-[β-4-(疊氮基水楊酰胺基)乙基]-二硫化物，為可經(jīng)硫羥交換或還原作用裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· N-琥珀酰亞氨基-(4-疊氮苯基)-1,3′-二硫基丙酸酯(SADP)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 硫代琥珀酰亞氨基-2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3乙酰胺)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAED)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑；· 磺基琥珀酰亞氨基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAND)，可經(jīng)硫羥交換或還原反應(yīng)裂解的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。
可裂解接頭的其他例子和可用于釋放標(biāo)記的裂解條件如下所述?？杀环锘蛟谒嵝詶l件下裂解的甲硅烷基連接基團(tuán)?？杀还庠戳呀?光解)的3-,4-,5-，或6-取代的-2-硝基芐氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-硝基芐氧基連接基團(tuán)?？杀籆e(NH4)2(NO3)6裂解(氧化)的3-,4-,5-或6-取代的-2-烷氧基苯氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-烷氧基苯氧基連接基團(tuán)?？杀粴溲趸?堿)、酸或LiAlH4(還原)裂解的NCO2(尿烷)接頭?？杀籓3、OsO4/IO4-或KMnO4(氧化)裂解的3-戊烯基、2-丁烯基或1-丁烯基連接基團(tuán)?？杀籓2、Br2、MeOH或酸裂解的2-[3-,4-，或5-取代的-呋喃基]氧基連接基團(tuán)。
裂解其他不穩(wěn)定連接基團(tuán)的條件包括可用酸裂解叔烷氧基連接基團(tuán)；可用H3O+裂解的甲基(二烷基)甲氧基或4-取代的-2-烷基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基連接基團(tuán)；可用氟化物或酸裂解的2-甲硅烷基乙氧基連接基團(tuán)；可在堿性條件下裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=酮、酯、酰胺、氰基、NO2、硫醚、亞砜、砜)連接基團(tuán)；可用酸或在還原條件下裂解的2-,3-,4-,5-，或6-取代的芐氧基連接基團(tuán)；可用(Ph3P)3RhCl(H)裂解的2-丁烯氧基連接基團(tuán)；可用Li、Mg或BuLi裂解的3-,4-,5-或6-取代的-2-溴苯氧基連接基團(tuán)；可用Hg2+裂解的甲基硫代甲氧基連接基團(tuán)；可用Zn或Mg裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=鹵素)連接基團(tuán)；可經(jīng)氧化(例如用Pb(OAc)4)裂解的2-羥基乙氧基連接基團(tuán)。
優(yōu)選的接頭是被酸或光解作用裂解的接頭。在已為固相肽合成而發(fā)展的酸敏感性接頭中，有幾種可用于將標(biāo)記連接到MOI上。在Lloyd-Williams等人的綜述(四面體49:11065-11133,1993)描述了其中的某些接頭。一類有用的接頭是基于對(duì)烷氧基芐基醇，其中兩種接頭4-羥基甲基苯氧基乙酸和4-(4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸可購(gòu)自Advanced Chem Tech(Louisville,KY)。這兩個(gè)接頭可通過(guò)連接到芐醇上的酯鍵連接到標(biāo)記上，并且通過(guò)連到羧酸上的酰胺鍵連接到含胺MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI裂解掉由這些分子連接的標(biāo)記。裂解這些接頭導(dǎo)致標(biāo)記上的羧酸的釋放。酸裂解通過(guò)相關(guān)接頭如2,4-二甲氧基-4＇-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(可以FMOC保護(hù)的形式購(gòu)自AdvancedChem Tech公司)連接的標(biāo)記，導(dǎo)致被釋出的標(biāo)記上的羧酰胺的釋放。
已為固相肽合成而發(fā)展的大部分光敏感性接頭也可用于本申請(qǐng)(參見Lloyd-Williams的綜述)。這些接頭通常是基于2-硝基芐酯或2-硝基芐酰胺。最近文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)過(guò)的光敏感接頭的兩個(gè)例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones,J.Org.Chem.60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸(Brown等，Molecular Diversity 1:4-12,1995)。兩接頭均可通過(guò)羧酸連接到MOI的胺上。通過(guò)在標(biāo)記上的羧酸和接頭上的胺之間形成酰胺而使標(biāo)記接到接頭上。通常用350nm波長(zhǎng)的紫外光以本領(lǐng)域已知的強(qiáng)度和時(shí)間完成對(duì)光敏感接頭的裂解。光化學(xué)裂解裝置的商品來(lái)源是Aura Industries Inc.(Staten Island,NY)和Agrenetics(Wilmington,MA)。裂解接頭導(dǎo)致標(biāo)記上伯酰胺的釋放。光可裂解的接頭的例子包括硝基苯基甘氨酸酯，內(nèi)-和外-2-苯并降冰片烷基氯和甲磺酸，以及3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸。酶促裂解的例子包括可裂解酯鍵的酯酶、裂解磷酸二酯鍵的核酸酶、裂解肽鍵的蛋白酶等。E．標(biāo)記的檢測(cè)檢測(cè)方法一般依賴于某些類型光譜場(chǎng)中的吸收和發(fā)射。當(dāng)原子或分子吸收光時(shí)，進(jìn)入的能量將量化結(jié)構(gòu)激發(fā)到較高能量水平。激發(fā)的類型取決于光的波長(zhǎng)。電子被紫外或可見光激發(fā)到較高軌道，紅外光激發(fā)分子振動(dòng)，并且微波激發(fā)旋轉(zhuǎn)。吸收光譜是作為波長(zhǎng)函數(shù)的光吸收。原子或分子的光譜依賴于其能量水平結(jié)構(gòu)。吸光光譜可用于鑒定化合物。具體的吸收光譜方法包括原子吸收光譜法(AA)、紅外光譜法(IR)和紫外可見光譜法(UV-Vis)。
被激到高能水平的原子或分子因發(fā)出幅射而衰變到較低水平。如果躍遷是在同一自旋狀態(tài)間進(jìn)行該光稱為熒光，如果躍遷發(fā)生在不同自旋狀態(tài)之間則是磷光。分析物的發(fā)射強(qiáng)度與濃度成線性關(guān)系(在低濃度下)，并用于定量發(fā)光物質(zhì)。具體的發(fā)射光譜方法包括原子發(fā)射光譜法(AES)、原子熒光光譜法(AFS)、分子激光誘導(dǎo)的熒光法(LIF)和X射線熒光法(XRF)。
當(dāng)電磁幅射通過(guò)物質(zhì)時(shí)，大部分幅射以其原來(lái)的方向繼續(xù)前進(jìn)，但小部分向其他方向散射。以入射光的同樣波長(zhǎng)散射的光稱為雷利散射。在透光固體中由于振動(dòng)散射的光稱為布里淵散射。布里淵散射典型的是從入射光偏移0.1到1個(gè)波數(shù)。不透明固體中由于分子中振動(dòng)或光聲子散射的光稱為喇曼散射。喇曼散射光從入射光偏移多達(dá)4000個(gè)波數(shù)。特異性散射光譜方法包括喇曼光譜法。
IR光譜法是檢測(cè)被樣品吸光的中紅外光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。中紅外光(2.5-50μm,4000-200cm-1)是足以激發(fā)分子振動(dòng)到較高能量水平的光。IR吸收帶的波長(zhǎng)是特異類型的化學(xué)鍵所特有的，并且IR光譜一般最適于鑒定有機(jī)和有機(jī)金屬分子。
近紅外吸收光譜(NIR)是檢測(cè)被樣品吸收的近紅外光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。近紅外光跨越800nm-2.5μm(12,500-4000cm-1)范圍并且是足以激泛音和分子振動(dòng)組合達(dá)到較高能量水平的光。NIR典型地被用于定量檢測(cè)有機(jī)官能基團(tuán)，特別是O-H、N-H和C=O。NIR儀的組成和設(shè)計(jì)相似于UV-VIS吸收光譜儀。光源通常是鎢燈，檢測(cè)器通常是PbS固態(tài)檢測(cè)器。樣品容器可以是玻璃或石英的，并且典型的溶劑是CCl4和CS2。NIR光譜的方便裝置使之適于聯(lián)機(jī)監(jiān)測(cè)和過(guò)程控制。
紫外和可見光吸收光譜是測(cè)量由樣品吸收的近紫外和可見光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。真空中UV吸收發(fā)生在100-100nm(105-50,000cm-1)；石英UV在200-350nm(50,000-28,570cm-1)，可見光在350-800(28,570-12,500cm-1)，并且符合Beer-Lambert-Bouguet定律。紫外和可見光是足以加速外圍電子到較高能量水平的光。UV-Vis光譜通常可應(yīng)用于溶液中的分子和無(wú)機(jī)離子或復(fù)合物。US-Vis光譜受到光譜寬度特征的限制。光源通常是氘燈(用于UV檢測(cè))和鎢燈(用于可見光檢測(cè))。用波長(zhǎng)分離器如棱鏡或光柵單色儀選擇這些連續(xù)光源的波長(zhǎng)。經(jīng)掃描波長(zhǎng)分離器得到光譜，并可根據(jù)光譜或在單一波長(zhǎng)處進(jìn)行定量檢測(cè)。
質(zhì)譜是利用離子化原子或分子的質(zhì)量對(duì)電荷比例的不同將它們彼此分離開。因此質(zhì)譜可用于原子或分子的定量，并且還用于確定分子的化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。分子具有不同的片段化特征，從而為鑒定化合物提供結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜儀的一般操作如下。造成氣相離子，基于它們的質(zhì)量對(duì)電荷比例在空間或時(shí)間上分離離子，并檢測(cè)各個(gè)質(zhì)荷比離子的量。質(zhì)譜儀的離子分離能力是由分辨率描述的，其定義為R=m/Am，其中m是離子質(zhì)量，Δm是質(zhì)譜中兩個(gè)可分辨峰之間的質(zhì)量差異。例如分辨率為1000的質(zhì)譜儀可分辨開m/z為100.0的離子與m/z為100.1的離子。
一般說(shuō)來(lái)，質(zhì)譜儀由離子源、質(zhì)量選擇分析器和離子檢測(cè)器組成。磁扇形場(chǎng)、四極和飛行時(shí)間設(shè)計(jì)也需要抽提和加速離子以將離子從來(lái)源區(qū)域轉(zhuǎn)移到質(zhì)量分析器中。下面討論幾種質(zhì)量分析器設(shè)計(jì)(磁扇形場(chǎng)質(zhì)譜、四極質(zhì)譜或飛行時(shí)間質(zhì)譜)的詳細(xì)內(nèi)容。磁扇形場(chǎng)質(zhì)譜的單聚焦分析器利用180、90或60度的顆粒束路徑。影響顆粒的各種力分離有不同質(zhì)量/電荷比例的離子。用雙聚焦分析器，在這種類型的儀器中加入靜電分析器，以分離有不同動(dòng)能的顆粒。
用于四極質(zhì)譜的四極質(zhì)量濾器由平行排列的4個(gè)金屬棒組成。施加的電壓影響在4個(gè)棒之間中心部分向下飛行之離子的軌跡。對(duì)于給定的DC和AC電壓，只有某些質(zhì)量/電荷比例的離子通過(guò)四極濾器，而所有其他的離子則被拋出它們?cè)瓉?lái)的路徑。當(dāng)改變棒上的電壓時(shí)監(jiān)測(cè)通過(guò)四級(jí)濾器的離子，以得到質(zhì)譜。
飛行時(shí)間質(zhì)譜利用通過(guò)“漂移區(qū)”的過(guò)渡時(shí)間的差異分離不同質(zhì)量的離子。其以脈沖發(fā)射模式運(yùn)行，所以離子必須在脈沖中產(chǎn)生和/或被提取。發(fā)射脈沖的電場(chǎng)將所有離子以qV的動(dòng)能加速到無(wú)場(chǎng)漂移區(qū)，其中q是離子電荷，V是施加的電壓。因?yàn)殡x子動(dòng)能是0.5mV2，所以較輕的離子比較重離子有更高的速度，并較快地到達(dá)漂移區(qū)末端的檢測(cè)器。離子檢測(cè)器的輸出作為時(shí)間的函數(shù)展示在示波器上，以得到質(zhì)譜。
離子形成過(guò)程是質(zhì)譜分析的起始點(diǎn)。化學(xué)電離是一種利用試劑離子與分析物分子(標(biāo)記)反應(yīng)以通過(guò)質(zhì)子或氫負(fù)離子轉(zhuǎn)移形成離子的方法。試劑離子是向電子碰撞(EI)離子源內(nèi)導(dǎo)入過(guò)量(相對(duì)于標(biāo)記)甲烷而產(chǎn)生的。電子碰撞產(chǎn)生CH4+和CH3+，它們進(jìn)一步與甲烷反應(yīng)形成CH5+和C2H5+。電離標(biāo)記的另一種方法是通過(guò)等離子體和輝光放電。等離子體是有效地激發(fā)并電離原子的熱的部分電離的氣體。輝先放電是保持在兩個(gè)電極之間的低壓等離子體。電子碰撞電離利用電子束，通常是由鎢絲產(chǎn)生的電子束電離氣相原子或分子。來(lái)自電子束的電子撞掉分析物原子或分子的電子以產(chǎn)生離子。電子噴射電離(ESI)利用很細(xì)的針和一系列分離器(Skimner)。樣品溶液被噴射到離子源小室中以形成小滴。當(dāng)排出毛細(xì)管時(shí)小滴攜帶電荷并且當(dāng)溶劑蒸發(fā)時(shí)小滴消失，留下高帶電分析物分子。ESI特別適用于難以蒸發(fā)或電離的生物大分子?？焖僭愚Z擊(FAB)利用沖擊固體樣品的中性原子和Xe或Ar的高能束以引起解吸附和電離。其用于難以進(jìn)入氣相的生物大分子。FAB很少引起片段化并通常給出大的分子離子峰，使之適用于分子量測(cè)定。經(jīng)加速?gòu)碾x子源通過(guò)電荷交換室的離子產(chǎn)生原子束。離子在與中性原子碰撞中吸收電子形成高能原子束。激光電離是一種激光脈沖剝落樣品表面的材料并產(chǎn)生微等離子體的方法，后者電離某些樣品成分。基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MACDI)是蒸發(fā)和電離大生物分子如蛋白質(zhì)或DNA片段的LIMS方法。將生物分子分散于固體基質(zhì)如煙酸上。UV激光脈沖將攜帶某些大分子的基質(zhì)以離子化形式剝落到氣相中，以使它們可被提取到質(zhì)譜儀內(nèi)。等離子體解吸電離(PD)利用252Cf的衰變，產(chǎn)生兩個(gè)以相反方向遷移的碎片。一個(gè)碎片沖擊樣品激發(fā)出1-10個(gè)分析物離子。另一個(gè)碎片沖擊檢測(cè)器并引發(fā)開始采集數(shù)據(jù)。該電離方法特別適用于大的生物分子。共振電離是其中將一個(gè)或多個(gè)激光束調(diào)至使氣相原子和分子共振躍遷的頻率，使之以分步方式加速到其離子化電勢(shì)以上，以產(chǎn)生離子。次級(jí)電離(SIMS)利用離子束例如3He+、16O+或40Ar+聚焦在樣品表面上并使材料濺蝕到氣相中?；鸹ㄔ词且环N穿過(guò)兩電極發(fā)出電流脈沖以電離固體樣品中分析物的方法。
標(biāo)記在從所連接的分子上裂解之前、期間或之后，可能變成帶電的?；陔x子“解吸”的電離方法，從固體或液體表面直接形成或發(fā)射離子，得以增加電離方法的應(yīng)用至非揮發(fā)性和熱敏感性化合物。這些方法不要求在電離前中性分子揮發(fā)，并且總地大大減少了分子的熱降解。這些方法包括場(chǎng)解吸(Becky，場(chǎng)電離和場(chǎng)解吸質(zhì)譜的原理，Pergamon,Oxford,1977)、等離子體解吸(Sundqvist和Macfarlane,Mass Spectrom.Rev.)、激光解吸(Karas和Hillenkange,Anal.Clem.60:2299,1998；Karas等,Angew.Chem.101:805,1989)、快粒子轟擊(如快原子轟擊、FAB和次級(jí)離子質(zhì)譜、SIMS；Barber等,Anal.Chem.54:645A,1982)及熱噴射(TS)電離(Vestal,Mass Spectrom.Rev.2:447,1983)。熱噴射廣泛應(yīng)用于與液相層析聯(lián)機(jī)組合。也已顯示連續(xù)流動(dòng)FAB方法(Caprioli等,Anal.Chem.58:2949,1986)有重要的應(yīng)用潛力。更完全的電離/質(zhì)譜法組合包括離子捕獲質(zhì)譜、電噴射電離質(zhì)譜、離子噴射質(zhì)譜、液體電離質(zhì)譜、大氣壓電離質(zhì)譜、電子電離質(zhì)譜、亞穩(wěn)定原子轟擊電離質(zhì)譜、快原子轟擊電離質(zhì)譜、MALDI質(zhì)譜、光化電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、激光小滴質(zhì)譜、MALDI-TOF質(zhì)譜、APCI質(zhì)譜、納米噴射質(zhì)譜、霧化噴射電離質(zhì)譜、化學(xué)電離質(zhì)譜、共振電離質(zhì)譜、次級(jí)離子質(zhì)譜、熱噴射質(zhì)譜。
這些電離方法適合于非揮發(fā)性生物化合物具有交迭實(shí)用范圍。電離效率主要取決基質(zhì)組合物和化合物類型。目前可得到的結(jié)果表明，TS分子量上限約為8000道爾頓(Jones和Krolik,質(zhì)譜快訊，1:67,1987)。因?yàn)門S實(shí)踐主要是用四極質(zhì)譜儀，所以在較高質(zhì)量/電荷比例(m/z)下敏感性一般都不成比例。飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜儀是可從市場(chǎng)上購(gòu)得的，并具有m/z范圍只受檢測(cè)器效率限制的優(yōu)點(diǎn)。最近，已引入了另外兩種電離方法。這兩種方法現(xiàn)在稱為基質(zhì)輔助的激光解吸(MALDI,Karas和Hilenkamp,Anal.Chem.60:2299,1988；Karas等，Angew.Chem.101:805,1989)和電噴射電離(ESI)。這兩種方法都有很高的電離效率(即很高的[產(chǎn)生的分子離子]/[消耗的分子]比例)。限定技術(shù)最終潛力的靈敏度取決于樣品大小、離子的量、流速、檢測(cè)效率及實(shí)際電離效率。
電噴射質(zhì)譜是建立在60年代首先提出的理論(Dole等,J.Chem.Phys.49:2240,1968)基礎(chǔ)上的。電噴射電離(ESI)是一種產(chǎn)生用質(zhì)譜法分析的帶電分子的手段。簡(jiǎn)單地說(shuō)，電噴射電離在強(qiáng)靜電場(chǎng)中由霧化液體產(chǎn)生高帶電小滴。一般在干浴氣體中于大氣壓下形成高帶電小滴，經(jīng)中性溶劑蒸發(fā)而收縮，直到電荷排斥力克服內(nèi)聚力，導(dǎo)致“庫(kù)侖爆炸”。電離的準(zhǔn)確機(jī)制尚有爭(zhēng)論并且已有幾個(gè)研究小組提出了假設(shè)(Blades等，Anal.Chem.63:2109-14,1991；Kebarle等，Anal.Chem.65:A972-86,1993；Fenn,J.Am.Soc.Mass.Spectram.4:524-35,1993)不管離子形成的基本過(guò)程如何，ESI總是于溫和條件下從溶液中產(chǎn)生帶電荷分子。
用小量有機(jī)分子獲得有用質(zhì)譜數(shù)據(jù)的能力有賴于離子的有效產(chǎn)生。ESI的電離效率與分子的正電荷量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)性改善電離作用通常包括使用酸性條件。改善電離的另一種方法是在可能時(shí)使用季胺(參見Aekersold等，蛋白科學(xué)(Protein Science)1:494-503,1992；Smith等，Anal.Chem.60:436-41,1988)。
以下進(jìn)一步詳細(xì)描述電噴射電離。電噴射離子的產(chǎn)生需要兩個(gè)步驟在接近大氣壓下分散高帶電小滴，然后在誘導(dǎo)蒸發(fā)條件下處理。使分析物分子的溶液通過(guò)保持在高電勢(shì)下的針。在針的尖端，溶液分散到含分析物分子的帶高電荷小滴的氣霧中。小滴迅速地蒸發(fā)并通過(guò)一個(gè)場(chǎng)解吸或殘留蒸發(fā)的過(guò)程，質(zhì)子化的蛋白質(zhì)分子被釋放到氣相中。電噴射一般是通過(guò)對(duì)來(lái)自毛細(xì)管的小的液體流(一般為1-10μL/分鐘)施加高電場(chǎng)而產(chǎn)生的。一般在毛細(xì)管和位置相距0.2-2cm的反電極之間施加3-6kV的電勢(shì)差(其中依據(jù)去溶劑化的程度，可通過(guò)小孔由MS提取電子、帶電團(tuán)、甚至帶電小滴樣品)。電場(chǎng)導(dǎo)致電荷在毛細(xì)管末端液體表面上積聚；因此液體流速、比電阻和表示張力是小滴形成中的重要因素。高電場(chǎng)導(dǎo)致液體表面的破壞和高帶電液體小滴的形成。根據(jù)毛細(xì)管偏壓可產(chǎn)生帶正電荷或負(fù)電荷小滴。負(fù)離子型需要在電子清除劑例如氧的存在以抑制放電。
可將各種液體靜電噴射到真空中，或者可借助噴霧劑噴射。只使用噴霧電場(chǎng)導(dǎo)致對(duì)液體導(dǎo)電率和介電常數(shù)的某些實(shí)際限制。室溫下以相當(dāng)于＜10-4M的含水電解質(zhì)溶液的有用液體流速進(jìn)行穩(wěn)定電噴射需要小于10-5歐姆的溶液導(dǎo)電率。發(fā)現(xiàn)該模式對(duì)ESI-MS是最有用的，適當(dāng)?shù)囊后w流速導(dǎo)致液體作為細(xì)霧分散。離毛細(xì)管的距離非常短，小滴直徑常常相當(dāng)均勻并且約為1μm。特別重要的是，對(duì)于較高液體流速，總電噴射離子電流只稍有增加。有證據(jù)表明加熱對(duì)于操縱電噴射是有用的。例如，稍微加熱可使含水溶液很容易電噴射，推測(cè)是由于降低了粘度和表面張力。熱輔助和氣體霧化輔助電噴射允許使用較高的液體流速，但增加小滴帶電的程度。分子離子的形成需要有影響初始小滴群體蒸發(fā)的條件。為此，可在較高壓力下借助于中度溫度(＜60℃)的干氣體流，在通過(guò)界面運(yùn)輸期間加熱，并且(特別是在使用離子俘獲法的情況下)經(jīng)在相對(duì)低的壓力下高能碰撞而實(shí)現(xiàn)之。
雖然構(gòu)成ESI之基礎(chǔ)的詳細(xì)過(guò)程尚不確定，但經(jīng)ESI產(chǎn)生的很小小滴似乎允許溶液中的幾乎所有各種帶電顆粒在蒸發(fā)殘留溶劑后被轉(zhuǎn)移到氣相中。然后質(zhì)譜檢測(cè)需要離子在去溶劑化后具有可檢測(cè)的m/z范圍(四極裝置要求＜4000道爾賴)，并且能以足夠的效率產(chǎn)生和傳輸。已發(fā)現(xiàn)很寬范圍的溶劑都適合于ESI-MS，而且電離效率基本上不依賴于分子量，提示其為一種高度無(wú)區(qū)別的和廣泛適用的電離方法。
電噴射離子“源”在接近大氣壓條件下起作用。電噴射“源”一般是金屬或玻璃毛細(xì)管，加上一種相對(duì)可反電極電偏離液體溶液的方法。溶液，典型的是含有分析物并常含有其他添加劑如乙酸的水-甲醇混合物，流向毛細(xì)管末端。已描述了一種ESI源(Smith等,Anal.Chem.62:885,1990)，其可容納基本上任何溶劑系統(tǒng)。ESL的典型流速為1-10μL/分鐘。對(duì)ESI-MS界面的基本要求是盡可能有效地從高壓區(qū)向MS加樣并輸送離子。
ESI的效率可以是很高的，從而為本發(fā)明有用的極敏感的裝置提供了基礎(chǔ)。對(duì)于單一帶電荷的檢測(cè)對(duì)象來(lái)說(shuō)，目前的裝置性能可提供在檢測(cè)器中的總離子電流為2×10-12A或約107計(jì)數(shù)/秒。在該裝置性能的基礎(chǔ)上，如果分析物完全被電離，濃度低到10-10M或大約10-18mol/秒的單一種帶電粒子將產(chǎn)生可檢測(cè)的離子流(大約10個(gè)計(jì)數(shù)/秒)。例如，使用與毛細(xì)管區(qū)帶電泳的ESI界面，已得到了季銨離子的10-18摩爾檢測(cè)下限(Smith等,Anal.Chem.59:1230,1988)。對(duì)于分子量為1000的化合物，電荷平均數(shù)為1，電荷狀態(tài)近似數(shù)為1，峰寬度(m/z)為1，并且最大強(qiáng)度強(qiáng)度(離子/秒)是1×1012。
在得到ESI質(zhì)譜中實(shí)際消耗相當(dāng)少的樣品(Smith等,Anal.Chem.60:1948,1988)。使用扇頁(yè)裝置的陣列檢測(cè)器(其允許同時(shí)檢測(cè)光譜的各部分)也可獲得實(shí)質(zhì)性效益。因?yàn)槟壳爸粰z測(cè)由ESI形成的約10-5的所有離子，所以關(guān)注限制裝置性能的因素可以為改善靈敏度提供基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，本發(fā)明包括并容納對(duì)電離和檢測(cè)方法的改進(jìn)。
界面最好是放在分離裝置(使用凝膠)和檢測(cè)器(例如質(zhì)譜)之間。界面最好有下列特征(1)能夠以不連續(xù)的時(shí)間間隔收集DNA片段，(2)濃縮DNA片段，(3)從電泳緩沖液和介質(zhì)中除去DNA片段，(4)從DNA片段上切掉標(biāo)記，(5)將標(biāo)記與DNA片段分離開，(6)處理DNA片段，(7)將標(biāo)記放在揮發(fā)性溶液中，(8)揮發(fā)并電離標(biāo)記，(9)將標(biāo)記放置或運(yùn)送到噴射裝置，由此將標(biāo)記導(dǎo)入質(zhì)譜儀。
當(dāng)DNA片段從凝膠的底部洗脫時(shí)，界面也有“收集”DNA片段的能力。凝膠可以包括板凝膠、管狀凝膠、毛細(xì)管凝膠等?？捎脦追N方法收集DNA片段。第一種方法是使用電場(chǎng)，其中DNA片段被收集到電極上或接近電極處。第二種方法是其中使液體流流過(guò)凝膠底部以收集DNA片段?？梢越雍蟽煞N方法的特征，其中可將DNA收集到流動(dòng)的液體流中，其后利用電場(chǎng)濃縮。最終結(jié)果是從完成分離方法的介質(zhì)中除去DNA片段。這就是說(shuō)，可以使用電場(chǎng)將DNA片段從一類溶液“拖拉”到另一類溶液中。
一旦DNA片段處在適當(dāng)?shù)娜芤?與電噴射和質(zhì)譜相容的)中，標(biāo)記即可從DNA片段上裂解下來(lái)。然后可利用電場(chǎng)將DNA片段與標(biāo)記分離開(該標(biāo)記最好帶有與DNA標(biāo)記相反的電荷)。然后再使用電場(chǎng)或流動(dòng)液體將標(biāo)記導(dǎo)入電噴射裝置內(nèi)。
根據(jù)它們的吸收和熒光發(fā)射波長(zhǎng)及強(qiáng)度最直接地鑒定并定量熒光標(biāo)記。
雖然常規(guī)熒光分光光度計(jì)是適應(yīng)性極強(qiáng)的，其可提供連續(xù)范圍的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(lEX、lS1、lS2)，但例如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和激光掃描顯微鏡等更專業(yè)化的裝置則需要可在單一的固定波長(zhǎng)激發(fā)的探針。在現(xiàn)代裝置中，這通常是氬激光的488nm光譜線。
每個(gè)探針?lè)肿拥臒晒鈴?qiáng)度都與ε和QY的乘積成正比例。在目前實(shí)踐中有重要性的熒光團(tuán)中，這些參數(shù)的范圍為ε大約10000至100,000cm-1M-1,QY為0.1至1.0。當(dāng)高強(qiáng)度光照將吸收驅(qū)向飽和時(shí)，限制熒光可檢測(cè)性的因素是被激發(fā)的熒光團(tuán)的不可逆性破壞(光漂白)。光漂白的實(shí)際影響取決于所用的熒光檢測(cè)技術(shù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，裝置(界面)可被安排在分離和檢測(cè)步驟之間，以便使大小分離和標(biāo)記檢測(cè)(在時(shí)間上)連續(xù)進(jìn)行。這樣就將分離方法和裝置與檢測(cè)方法和裝置聯(lián)合起來(lái)，構(gòu)成單一裝置。例如，將界面置于分離技術(shù)操作和以質(zhì)譜法或電勢(shì)電流測(cè)定法進(jìn)行的檢測(cè)之間。
界面的功能主要是從分析物中釋放出(如質(zhì)譜)標(biāo)記。有幾種有代表性的界面裝置。界面的設(shè)計(jì)依據(jù)于對(duì)可裂解接頭的選擇。就可光裂解的接頭來(lái)說(shuō)，需要能量或光源。對(duì)于熱不穩(wěn)性接頭、堿敏感性接頭或二硫化物接頭，需在界面內(nèi)加入試劑。對(duì)于熱敏感性接頭，需要能量或熱源。對(duì)于酶敏感性接頭(例如特異性蛋白酶)和肽接頭、核酸酶及DNA或RNA接頭、糖基化酶、HRP或磷酸酶及裂解后不穩(wěn)定的接頭(例如相似于化學(xué)發(fā)光底物)則需要加入酶。界面的其他特征包括最小帶加寬，在注入質(zhì)譜儀內(nèi)之前將DNA與標(biāo)記分離開。分離技術(shù)包括基于電泳方法的技術(shù)和親和技術(shù)、按大小保留(透析)技術(shù)、過(guò)濾等。
也有可能以俘獲電泳法濃縮標(biāo)記(或核酸-接頭-標(biāo)記構(gòu)建體)，然后釋放到與所選用的特定類型的電離方法相匹配的替代試劑流中。界面也能夠?qū)?biāo)記(或核酸-接頭-標(biāo)記構(gòu)建體)俘獲到微球上，將微球射入小室內(nèi)之后進(jìn)行激光解吸/蒸發(fā)。也可能提取到替代緩沖液中(例如從毛細(xì)管電泳緩沖液穿過(guò)可通透膜進(jìn)入疏水緩沖液中)。在某些應(yīng)用中也可能期望將標(biāo)記間歇性地傳送到質(zhì)譜儀中，這可能包括界面另外的功能。界面的另一個(gè)功能是將標(biāo)記從多個(gè)柱送入對(duì)每個(gè)柱都有一旋轉(zhuǎn)時(shí)間狹縫的質(zhì)譜儀中。另外，有可能將標(biāo)記從單個(gè)柱傳送到按時(shí)間分開的多個(gè)質(zhì)譜檢測(cè)儀中，在數(shù)毫秒時(shí)間里收集每組標(biāo)記，然后送入質(zhì)譜儀。
下面列出的是可用于本發(fā)明的分離和檢測(cè)技術(shù)設(shè)備的代表性銷售商。Hoefer Scientific Instruments(San Francisco,CA)生產(chǎn)用于測(cè)序的電泳裝置(Two StepTM,Poker FaceTMⅡ)。Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)生產(chǎn)用于DNA分離和測(cè)序的電泳裝置(PhastSystem用于PCR-SSCP分析，MacroPhor System用于DNA測(cè)序)。Rerkin Elmer/Applied Biosystems Division(ABI,FosterCity,CA)生產(chǎn)基于熒光素染料的半自動(dòng)測(cè)序儀(ABI373和ABI377)。Analytical Spectral Devices(Boulder,CO)生產(chǎn)UV分光光度計(jì)。Hitachi Instruments(日本東京)生產(chǎn)原子吸收光譜儀、熒光光譜儀、LC和GC質(zhì)譜儀、NMR光譜儀及UV-Vis光譜儀。PreSeptiveBiosystems(Framingham,MA)生產(chǎn)質(zhì)譜儀(VoyagerTMElite)。Bruker Instruments Inc.(Manning Park,MA)生產(chǎn)FTIR光譜儀(Vector22)、FF喇變光譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Reflex IITM)、離子俘獲質(zhì)譜儀(EsquireTM)和Maldi質(zhì)譜儀。Analytical Technology Inc.(ATI,Boston,MA)制造毛細(xì)管凝膠電泳裝置、UV檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)儀。Teledyne Electronic Technologies(Mountain View,CA)制造離子俘獲質(zhì)譜儀(3DQ DiscoveryTM和3DQ ApogeeTM)。Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster city,CA)制造可與電噴射匹配的Sciex質(zhì)譜儀(三聯(lián)四極LC/MS/MS,API 100/300)。Hewlett-Packard(Santa Clara,CA)生產(chǎn)質(zhì)量選擇性檢測(cè)器(HP5972A)、MALDI-TOF質(zhì)譜儀(HP G2025A)、二極管陣列檢測(cè)器、CE裝置、HPLC裝置(HP1090)及UV光譜儀。FinniganCorporation(San Jose,CA)制造質(zhì)譜儀(磁扇形場(chǎng)(MAT95STM)、四極光譜儀(MAT95SQTM)和四種其他的相關(guān)質(zhì)譜儀)。Rainin(Emevyville,CA)制造HPLC裝置。
本文描述的方法和組合使得可以使用裂解的標(biāo)記確定樣品類型和核酸鑒定的圖譜。在每個(gè)測(cè)序方法開始時(shí)，為每個(gè)特定的(選擇的)引物指定一個(gè)特殊的獨(dú)特標(biāo)記。標(biāo)記指示不同的樣品類型、雙脫氧終止子類型(就Sanger測(cè)序反應(yīng)而言)或優(yōu)選兩者。具體地說(shuō)，標(biāo)記指示引物類型，引物類型又指示載體類型，載體類型又指示樣品身份。標(biāo)記也可能指示雙脫氧終止子類型(ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddATP)，其中參考放有標(biāo)記引物的雙脫氧核苷酸反應(yīng)。然后完成測(cè)序反應(yīng)并及時(shí)按大小依次分離所得到的片段。
在時(shí)間框架中從片段上切下標(biāo)記并在時(shí)間框架內(nèi)檢測(cè)和記錄之。將標(biāo)記圖譜與時(shí)間框架相比較以構(gòu)成序列。即，在按大小分離之后及時(shí)記錄所有標(biāo)記的鑒定數(shù)據(jù)并且在數(shù)據(jù)框架中變成相互關(guān)聯(lián)的。按大小分離步驟可分離開按一個(gè)核苷酸遞增的核酸片段，因此按一個(gè)核苷酸的增量分離了相關(guān)的標(biāo)記。由于予知雙脫氧終止子或核苷酸圖譜和樣品類型，很容易以線性方式推斷出序列。
下列實(shí)施例是按舉例說(shuō)明方式，而不是以限制的方法提供的。
除另外指出者外，用于實(shí)施例中的化學(xué)品均可從Aldrich ChemicalCompany,Milwaukee,WI得到。本文使用具有所指出的含義的下列縮寫詞ANP=3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸NBA=4-(Fmoc-氨基乙基)-3-硝基苯甲酸HATU=O-7-氮雜苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽DIEA=二異丙基乙胺MCT=一氯三嗪NMN=4-甲基嗎啡啉MNP=N-甲基吡咯烷酮ACT357=ACT357肽合成儀，購(gòu)目Advanced ChomTech,Inc.LouisvilleKYACT=Advanced Chem Tech,Inc.,Louisvile,KYNovaBiochem=CalBiochem-NovaBiochem International,San diego,CATFA=三氟乙酸Tfa=三氟乙酰iNIP=N-甲基異哌啶甲酸Tfp=四氟苯基DIAEA=2-(二異丙基氨基)乙胺MCT=一氯三氮烯5’-AH-ODN=有5’-氨基己基尾的寡脫氧核苷酸。
實(shí)施例實(shí)施例1用于可裂解分子鑒定劑測(cè)序中的酸敏感性接頭的制備A可化學(xué)裂解的質(zhì)譜標(biāo)記五氟苯基酯的合成，以釋放帶羧酰胺末端的標(biāo)記圖1顯示反應(yīng)流程。步驟A．在ACTA357肽合成儀(ACT)的收集容器中用DMF懸浮TentaGel SAC樹脂(化合物Ⅱ；得自ACT；1當(dāng)量)。加入溶于DMF的化合物Ⅰ(3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和DIEA(7.5當(dāng)量)并將收集容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅰ偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅲ。步驟B．將樹脂(化合物Ⅲ)與DMF中的25％哌啶混合并振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，并直接用于步驟C。步驟C．將步驟B的去保護(hù)的樹脂懸浮于DMF中并向其中加入DMF中的FMOC保護(hù)的在其側(cè)鏈中含有胺官能團(tuán)的氨基酸(化合物Ⅳ，如α-N-FMOC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，可購(gòu)自Synthetech,Albany,OR；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和DIEA(7.5當(dāng)量)。將容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅳ偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，以得到化合物Ⅴ。步驟D．按步驟B中所述用哌啶處理樹脂(化合物Ⅴ)以除去FMOC基團(tuán)。然后用ACT357將收集容器中的去保護(hù)的樹脂等分到16個(gè)反應(yīng)容器中。步驟E．將得自步驟D的16等份的去保護(hù)樹脂懸浮于DMF中。向各反應(yīng)容器中加入溶于DMF中的適當(dāng)?shù)聂人幄?-16(R1-16CO2H3,3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和DIEA(7.5當(dāng)量)。將容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份的樹脂。將Ⅵ1-16偶聯(lián)到各等份的樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅶ1-16。步驟F．用CH2CI2(3X)洗各等份的樹脂(化合物Ⅶ1-16)。向各反應(yīng)容器內(nèi)加入在CH2CH2中的1％TFA并將容器振蕩30分鐘。將溶劑從反應(yīng)容器過(guò)濾到各個(gè)試管中。用CH2CI2(2X)和MeOH(2X)洗各等份的樹脂并將濾液合并到各個(gè)試管中。真空中蒸發(fā)各個(gè)試管。得到化合物Ⅷ1-16。步驟G．將每份游離羧酸Ⅷ1-16溶解于DMF中。向各溶液內(nèi)加入吡啶(1.05當(dāng)量)，然后再加入三氟乙酸五氟苯酯(1.1當(dāng)量)。室溫下將混合物攪拌45分鐘。用EtOAc稀釋該溶液，用1M檸檬酸水溶液(3X)和5％NaHCO3水溶液(3X)洗，在Na2SO4上干燥，過(guò)濾并真空蒸發(fā)，得到化合物Ⅸ1-16。
B．可化學(xué)裂解的質(zhì)譜標(biāo)記五氟苯基酯的合成，以釋放帶羧酸末端的標(biāo)記圖2顯示反應(yīng)流程。步驟A．將4-(羥甲基)苯氧基丁酸(化合物Ⅰ；1當(dāng)量)與DIEA(2.1當(dāng)量)和烯丙基溴(2.1當(dāng)量)合并在CHCl3中并加熱回流2小時(shí)。用EtOAc稀釋混合物，用1N HCl(2X)、pH9.5碳酸鹽緩沖液(2X)及鹽水(1X)洗，在Na2SO4上干燥，并真空蒸發(fā)得到化合物Ⅰ的烯丙酯。步驟B．將步驟A中的化合物Ⅰ的烯丙酯(1.75當(dāng)量)與FMOC保護(hù)的在其側(cè)鏈中含有胺官能團(tuán)的氨基酸(化合物Ⅱ，如α-N-FMOC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，可購(gòu)自Synthetech,Albany,OR；1當(dāng)量)、N-甲基嗎啉(2.5當(dāng)量)和HATU(1.1當(dāng)量)合并到CH2Cl2中，并室溫?cái)嚢?小時(shí)。用CH2Cl2稀釋混合物，用1M檸檬酸水溶液(2X)、水(1X)和5％NaHCl3水溶液(2X)洗，在Na2SO4上干燥并真空蒸發(fā)。經(jīng)快速層析(CH2Cl2→EtOAc)分離化合物Ⅲ。步驟C．將化合物Ⅲ溶解于CH2Cl2中，加入Pd(PPh3)4(0.07當(dāng)量)和N-甲基苯胺(2當(dāng)量)，并將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)。用CH2Cl2稀釋混合物，用1M檸檬酸水溶液(2X)和水(1×)洗，在NaSO4上干燥并真空蒸發(fā)。經(jīng)快速層析(CH2Cl2→EtOAc)分離化合物Ⅳ。步驟D．在ACT357肽合成儀(Advanced ChemTech Inc(ACT)，Louisvile,KY)的收集容器內(nèi)用DMF懸浮TentaGel S AC樹脂(化合物Ⅴ；1當(dāng)量)，加入溶于DMF中化合物Ⅳ(3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和DIEA(7.5當(dāng)量)并將收集容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。將Ⅳ偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅵ。步驟E．將樹酯(化合物Ⅵ)與DMF中的25％哌啶混合并振蕩5分鐘。過(guò)濾樹脂，然后與DMF中的25％哌啶混合并振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。然后用ACT357將去保護(hù)的樹脂從收集容器中等分到16個(gè)反應(yīng)容器中。步驟F．將步驟E的16等份去保護(hù)的樹脂懸浮于DMF中。向各反應(yīng)容器內(nèi)加入溶于DMF的適當(dāng)?shù)聂人幄?-16(R1-16CO2H；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和DIEA(7.5當(dāng)量)。將容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份樹脂。將Ⅶ1-16偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅷ1-16。步驟G．用CH2Cl2(3X)洗各等份樹脂(化合物Ⅷ1-16)。向各反應(yīng)容器內(nèi)加入在CH2Cl2中的1％TFA并將容器振蕩30分鐘。從反應(yīng)容器中將溶劑過(guò)濾到各個(gè)試管內(nèi)。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗各等份的樹脂，并將濾液合并到各個(gè)試管內(nèi)。真空蒸發(fā)各個(gè)試管，得到化合物Ⅸ1-16。步驟H．將各游離羧酸Ⅸ1-16溶解于DMF中。向各溶液內(nèi)加入吡啶(1.05當(dāng)量)，然后再加入三氟乙酸五氟苯酯(1.1當(dāng)量)．將混合物室溫?cái)嚢?5分鐘。用EtOAc稀釋溶液，用1M擰檬酸水溶液(3X)和5％NaHCO3溶液(3X)洗，在Na2SO4上干燥，過(guò)濾并真空蒸發(fā)，得到化合物Ⅹ1-16。
實(shí)施例2證明T-L-X的光裂解室溫下用近紫外光照射實(shí)施例11中制備的T-L-X化合物7分鐘。使用在350mm處有發(fā)射峰的Rayonett熒光紫外燈(Southern NewEngland Ultraviolet Co.,Middletown,CT)作為紫外光源。將燈放在離含樣品平皿15cm距離處。SDS凝膠電泳顯示在這些條件下85％以上的混合物被裂解。
實(shí)施例3制備熒光標(biāo)記的引物和證明熒光團(tuán)的裂解寡核苷酸的合成和純化使用制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)，或H-膦酸酯化學(xué)(GlennResearch Sterling,VA)在自動(dòng)DNA合成儀上制備寡核苷酸(ODN)。適當(dāng)封閉的dA、dG、dC和T亞磷酰胺是以這些形式從市場(chǎng)上購(gòu)得的，并且可很容易地將合成的寡核苷轉(zhuǎn)化成這種適當(dāng)?shù)男问?。使用由制造商提供的?biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺，或H-膦酸酯化學(xué)制備寡核苷酸。使用標(biāo)準(zhǔn)方法寡核苷酸。使用12μm 300#Rainin(Emeryville,CA)Dynamax C-84.2×250反相柱以HPLC對(duì)帶5′三苯甲基的寡核苷酸進(jìn)行層析，使用0.1N Et3NH+OAc-(pH7.0)中的15％至55％MeCN梯度洗脫20分鐘。當(dāng)完成脫三苯甲基化時(shí)，進(jìn)一步用凝膠排阻層析法純化寡核苷酸。在堿性pH條件下用PRP柱(Alltech,Deerfield,IL)并用PAGE法分析檢查寡核苷酸的質(zhì)量。
2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸的制備使10至1000μg 5′-末端胺連接的寡核苷酸與過(guò)量重結(jié)晶的氰尿酰氯在溶于堿性(最好pH8.3至8.5)緩沖液內(nèi)的10％N-甲基吡咯烷酮中于19℃至25℃下反應(yīng)30至120分鐘。終反應(yīng)混合物由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml重結(jié)晶的氰尿酰氯和500μg/ml各寡核苷酸組成。在G50Sephedex(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上經(jīng)排阻層析除去未反應(yīng)的氰尿酰氯。
然后使經(jīng)過(guò)活化的如上純化的寡核苷酸在室溫下于0.15M硼酸鈉(pH8.3)中與100倍過(guò)量的半胱胺反應(yīng)1小時(shí)。在G50 Sephadex柱上經(jīng)大小排阻層析除去未反應(yīng)的半胱胺。然后使衍生的ODN與胺反應(yīng)性熒光顏料反應(yīng)。將所得到的ODN制備物分成3份，每份各與(a)20倍摩爾過(guò)量的德克薩斯紅磺酰氯(Molecular Probes,Eugene,OR)、與(b)20倍摩爾過(guò)量的麗斯胺磺酰氯(MolecularProbes,Eugene,OR),(c)20倍摩爾過(guò)量的熒光素異硫氰酸酯反應(yīng)。終反應(yīng)條件是在0.15M硼酸鈉(pH8.3)中于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在G50Sephadex柱上經(jīng)大小排阻層析除去未反應(yīng)的熒光顏料。
為了從寡核苷酸上裂解熒光顏料，將ODN調(diào)整到1×10-5摩爾，然后在TF(TF是0.01M Tris,pH7.0,5mM EDTA)中稀釋(12,3倍稀釋)。向100μl體積的ODN中加入25μl 0.01M二硫蘇糖醇(DTT)。一組相同的對(duì)照物中不加DDT。將混合物室溫下保溫15分鐘。在黑色微滴定板中檢測(cè)熒光。從保溫管中除去溶液(150μl)并放在黑色微滴定板(Dynatek Laboratories,Chantilly,VA)中。使用FluoroskanⅡ熒光計(jì)(Flow Laboratories,McLean,VA)直接讀平板，其中使用495nm激光波長(zhǎng)并監(jiān)測(cè)520nm發(fā)射波來(lái)檢測(cè)熒光素，使用591nm激發(fā)波長(zhǎng)并監(jiān)測(cè)612nm的發(fā)射波以檢測(cè)德克薩斯紅，并使用570nm激發(fā)波長(zhǎng)并監(jiān)測(cè)590nm發(fā)射波以檢測(cè)麗絲胺。熒光團(tuán)的摩爾數(shù)未裂解的裂解的游離的RFU RFU RFU1.0×105M6.4 1200 13453.3×106M2.4 451 4561.1×106M0.9 135 1303.7×107M0.3 44481.2×107M0.1215.3 16.04.1×107M0.144.9 5.11.4×108M0.132.5 2.84.5×109M0.120.8 0.9數(shù)據(jù)表明，當(dāng)熒光團(tuán)從ODN上裂解下來(lái)時(shí)，相對(duì)熒光約增加200倍。
實(shí)施例4制備標(biāo)記的M13序列引物并證明標(biāo)記的裂解制備2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸1000μg 5′末端胺連接的寡核苷酸(5′-己胺-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)(Seq.ID No.1)與過(guò)量重結(jié)晶的氰尿酰氯在10％N-甲基吡咯烷酮堿性(較好pH8.3至8.5)緩沖液中19至25℃下反應(yīng)30至120分鐘。終反應(yīng)條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml重結(jié)晶的氰尿酰氯和500μg/ml每種寡核苷酸構(gòu)成。在G50 Sephadex柱上經(jīng)大小排阻層析除去未反應(yīng)的氰尿酰氯。
然后使活化的純化的寡核苷酸與100倍過(guò)量的半胱胺在0.15M硼酸鈉(ph8.3)中室溫反應(yīng)1小時(shí)。在G50 Sephadex柱上經(jīng)大小排阻層析除去未反應(yīng)的半胱胺。然后使衍生的ODN與各種酰胺反應(yīng)。將所得的ODN制品分成12份，每份與(25摩爾過(guò)量)下列酸的五氟苯酯反應(yīng)(1)4-甲氧基苯甲酸，(2)4-氟苯甲酸，(3)甲苯甲酸，(4)苯甲酸，(5)吲哚-3-乙酸，(6)2,6-二氟苯甲酸，(7)煙酸N-氧化物，(8)2-硝基苯甲酸，(9)5-乙酰水楊酸，(10)4-乙氧基苯甲酸，(11)肉桂酸，(12)3-氨基煙酸。反應(yīng)在0.2M硼酸鈉(pH8.3)中37℃進(jìn)行2小時(shí)。在G50 Sephadex上經(jīng)凝膠排阻層析純化衍生的ODN。
為了從寡核苷酸上裂解掉標(biāo)記，將ODN調(diào)整到1×10-5摩爾然后在TE(TE是0.01MTris,ph7.0,5mM EDTA)中用50％EtOH(VV)進(jìn)行稀釋(12,3倍稀釋)。向100μl體積ODN中加入25μl 1M二硫蘇糖醇(DTT)。一組同樣的對(duì)照物中則不加DTT。室溫下保溫30分鐘。然后加NaCl至0.1M并加入2體積EtOH以沉淀ODN。以14,000g于4℃下離心15分鐘以除去溶液中的ODN。保留上清液，徹底干燥。然后將沉淀物溶解于25μl MeOH。以質(zhì)譜檢測(cè)法檢測(cè)沉淀物中標(biāo)記的存在。
用于本研究的質(zhì)譜儀是外部離子源傅里葉變換質(zhì)譜儀(FTMS)。使為MALDI分析所制備的樣品沉積到直接探子的尖端并插入到離子源中。當(dāng)激光脈沖照射樣品時(shí)離子從該源中被抽提出來(lái)并通入長(zhǎng)的四極離子導(dǎo)槽中，由此將它們聚焦并輸送到位于超導(dǎo)磁鐵中心孔內(nèi)的FTMS分析儀小室中。
光譜產(chǎn)生如下信息。在下列分子量處強(qiáng)度從25到100相對(duì)強(qiáng)度單位變化的峰(1)指示4-甲氧基苯甲酸衍生物的212.1amu，(2)指示4-氟苯甲酸衍生物的200.1amu，(3)指示甲苯酸衍生物的196.1amu，(4)指示苯甲酸衍生物的182.1amu，(5)指示吲哚-3-乙酸衍生物的235.2amu，(6)指示2,6-二氟苯甲酸衍生物的218.1amu，(7)指示煙酸N-氧化物的199.1amu，(8)指示2-硝基苯甲酰胺的227.1amu，(9)指示5-乙酰水楊酸衍生物的179.18amu,(10)指示4-乙氧基苯甲酸衍生物的226.1amu，(11)指示肉桂酸衍生物的209.1amu，(12)指示3-氨基煙酸衍生物的198.1amu。
結(jié)果表明分子量(MV)鑒定劑從引物上被裂解下來(lái)并可用質(zhì)譜法檢測(cè)。
實(shí)施例5一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Tfp化合物的制備圖3舉例說(shuō)明平行合成一組36個(gè)T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團(tuán)，T具有其中賴氨酸的羧酸基團(tuán)已連接到L2芐胺基團(tuán)的氮原子上形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，且分子量可變成分R1-36(其中這些R基團(tuán)相當(dāng)于如本文定義的T2，并可通過(guò)本文所列出的任何一種特異性羧酸被導(dǎo)入)通過(guò)賴氨酸的α-氨基基團(tuán)連接，而質(zhì)譜靈敏度增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)N-個(gè)基異哌啶甲酸導(dǎo)入的)則通過(guò)賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)結(jié)合。
參見圖3步驟A．在ACT357的收集容器內(nèi)用DMF懸浮NovaSyn HMP樹脂(可購(gòu)自NovaBiochem；1當(dāng)量)。加入溶于DMF的化合物Ⅰ(得自ACT的ANP；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)并將收集容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅰ偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅱ。步驟B．將樹脂(化合物Ⅱ)與DMF中的25％哌啶混合并振蕩5分鐘，過(guò)濾樹脂與DMF中的25％哌啶混合并振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，并直接用于步驟C。步驟C．將步驟B的去保護(hù)的樹脂懸浮于DMF中并向其中加入DMF中的FMOC保護(hù)的在其側(cè)鏈中含有被保護(hù)官能團(tuán)的氨基酸(Fmoc-賴氨酸(Aloc)-OH，購(gòu)自BeSeptive Biosystems；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)。將容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Fmoc-Lys(Aloc)-OH偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，以得到化合物Ⅳ。步驟D．用CH2Cl2(2X)洗樹脂(化合物Ⅳ)，然后懸浮在(PPh3)4Pd(0)(0.3當(dāng)量)和PhSiH3(10當(dāng)量)在CH2Cl2中的溶液中。將混合物振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用CH2Cl2(2X)洗樹脂。重復(fù)鈀處理步驟。除去溶劑并用CH2Cl2(2X)、溶于DMF中的N,N-二異丙基乙銨二乙基二硫代氨基甲酸酯(2X)、DMF(2X)洗樹酯，得到化合物Ⅴ。步驟E．將步驟D得到的去保護(hù)的樹脂與步驟C中所述的N-甲基異哌啶甲酸偶聯(lián)，得到化合物Ⅵ。步驟F．用ACT357收集容器中的Fmoc保護(hù)的樹脂Ⅵ等分到36個(gè)反應(yīng)容器中，得到化合物Ⅵ1-36。步驟G．按步驟B中所述使樹脂(化合物Ⅵ1-36)與哌啶反應(yīng)，以除去FMOC基團(tuán)。步驟H．將步驟G的36等份去保護(hù)的樹脂懸浮于DMF中。向各反應(yīng)容器中加入溶于DMF的適當(dāng)?shù)聂人?R1-36CO2H；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)。將容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份的樹酯。將R1-36CO2H偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，以得到化合物Ⅷ1-36。步驟Ⅰ.用CH2Cl2(3X)洗各等份的樹脂(化合物Ⅷ1-36)。向各反應(yīng)容器內(nèi)加入90∶5∶5的TFA∶H2O∶CH2Cl2并將容器振蕩120分鐘。將容劑從反應(yīng)容器過(guò)濾到各個(gè)試管中。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗等分的樹脂并將濾液合并到各個(gè)試管內(nèi)。在真空中蒸發(fā)各個(gè)試管，得到化合物Ⅸ1-36。步驟J．將各游離羧酸Ⅸ1-36溶解于DMF。向各溶液內(nèi)加入吡啶(1.05當(dāng)量)，然后加入三氟乙酸四氟苯基酯(1.1當(dāng)量)。室溫下將混合物攪拌45分鐘。用EtOAc稀釋溶液，用5％NaHCO3水溶液(3X)洗，在Na2SO4上干燥，過(guò)濾和真空蒸發(fā)，得到化合物Ⅹ1-36。
實(shí)施例6一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-NBA-Tfp化合物的制備圖4舉例說(shuō)明平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)，L3是連接Lh和L2之間的直接鍵，其中Lh直接連接到L2基團(tuán)的芳環(huán)上。T具有其中賴氨酸的羧酸基團(tuán)已被連接到L2芐胺基團(tuán)氮原子上形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團(tuán)相當(dāng)于如本文定義的T2，并可通過(guò)本文所列的任何一種特異性羧酸被導(dǎo)入)是通過(guò)賴氨酸的α氨基基團(tuán)被結(jié)合的，而質(zhì)譜增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)N-甲基異哌啶甲酸被導(dǎo)入)則是通過(guò)賴氨酸的ε氨基基團(tuán)結(jié)合的。
參見圖4步驟A．按照實(shí)施例5的步驟A中所述的方法將NovaSyn HMP樹脂偶聯(lián)到化合物Ⅰ(按照Brown等，Molecular Diversity,1,4(1995))的方法制備的NBA)上，得到化合物Ⅱ。步驟B-J．按照實(shí)施例5的步驟B-J所述處理樹脂(化合物Ⅱ)，得到化合物Ⅹ1-36。
實(shí)施例7一組式1INP-LYs(ε-R1-36)-ANP-Tfp化合物的制備圖5圖解說(shuō)明平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團(tuán)，T具有其中賴氨酸的羧酸基團(tuán)已被連接到L2芐胺基團(tuán)之氮原子上形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團(tuán)相當(dāng)于如本文定義的T2，并可通過(guò)本文所列的任何一種特異性羧酸被導(dǎo)入)是通過(guò)賴氨酸的α氨基基團(tuán)結(jié)合的，而質(zhì)譜增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)N-甲基異哌啶甲酸被導(dǎo)入)則是通過(guò)賴氨酸的ε氨基基團(tuán)結(jié)合的。
參見圖5步驟A-C．同實(shí)施例5。步驟D．按實(shí)施例5的步驟B中所述用哌啶處理樹脂(化合物Ⅳ)，以除去FMOC基團(tuán)。步驟E．步驟D中樹脂上保護(hù)的α-胺與實(shí)施例5步驟C中描述的N-甲基異哌啶甲酸偶聯(lián)，得到化合物Ⅴ。步驟F．同實(shí)施例5。步驟G．按實(shí)施例5步驟D所述用鈀處理樹脂，以除去Aloc基團(tuán)。步驟H-J．按實(shí)施例7中所述的同樣方法制備化合物Ⅹ1-36。
實(shí)施例8一組式R1-36-Glu(γ-DIAEA)-ANP-Tfp化合物的制備圖6圖解說(shuō)明平行合成一組36個(gè)T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團(tuán)，T具有其中谷氨酸的羧酸基團(tuán)已被連接到L2芐胺基團(tuán)氮原子上形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團(tuán)相當(dāng)于如本文定義的T2，并可通過(guò)本文所列的任何一種特異性羧酸被導(dǎo)入)是通過(guò)谷氨酸的α氨基基團(tuán)被結(jié)合的，而質(zhì)譜增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)2-(二異丙氨基)乙胺導(dǎo)入的)則是通過(guò)谷氨酸的γ-羧酸結(jié)合的。參見圖6步驟A-B．同實(shí)施例5。步驟C．按實(shí)施例5的步驟C中所述的偶聯(lián)方法使去保護(hù)的樹脂(化合物Ⅲ)偶聯(lián)到Fmoc-Glu-(OAl)-OH上，得到化合物Ⅳ。步驟D．用CH2Cl2(2X)洗樹脂(化合物Ⅳ)上的烯丙基酯并與(PPh3)4Pd(0)(0.3當(dāng)量)和N-甲基苯胺(3當(dāng)量)在CH2Cl2中的溶液混合。將混合物振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用CH2Cl2(2X)洗樹脂。重復(fù)鈀處理步驟。除去溶劑并用CH2Cl2(2X)、溶于DMF中的N,N-二異丙基乙銨二乙基二硫代氨基甲酸酯(2X)、DMF(2X)洗樹酯，得到化合物Ⅴ。步驟E．將得自步驟D的去保護(hù)的樹脂懸浮在DMF中并經(jīng)混合HATU(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)而活化。將容器振蕩15分鐘。除去溶劑并用NMP(1X)洗樹脂。將樹脂與2-(二異丙基氨基)乙胺(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)混合。將容器振蕩1小時(shí)。將2-(二異丙基氨基)乙胺偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅵ。步驟F-J．同實(shí)施例5。
實(shí)施例9一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Lys(ε-NH2)-NH2化合物的制備圖7圖解顯示平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是胺(特別是賴氨酸衍生殘基的ε氨基基團(tuán))，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)，L3是連接Lh和L2的氨甲酰取代的亞烷基氨基?；鶃喭榛鶊F(tuán)，T具有其中賴氨酸的羧酸基團(tuán)已被連接到L2芐胺基團(tuán)氨原子上形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團(tuán)相當(dāng)于如本文定義的T2，并可通過(guò)本文所列的任何一種特異性羧酸被導(dǎo)入)是通過(guò)賴氨酸的α氨基基團(tuán)結(jié)合的，而質(zhì)譜增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)N-甲基異哌啶甲酸被導(dǎo)入)則是通過(guò)賴氨酸的ε氨基基團(tuán)結(jié)合的。參見圖7步驟A．將Fmoc-Lys(Boc)-SRAM樹脂(可得自ACT；化合物Ⅰ)與溶于DMF的25％哌啶混合并振蕩5分鐘。過(guò)濾樹脂，然后與溶于DMF的25％哌啶混合并振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，并直接用于步驟B中。步驟B．加入DMF中的樹脂(化合物Ⅱ)、ANP(可購(gòu)自ACT；3當(dāng)量)、HATU(3當(dāng)量)和NMM(7.5當(dāng)量)并將收集容器振蕩1小時(shí)。除去溶劑并用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。將Ⅰ偶聯(lián)到樹脂上并重復(fù)洗滌步驟，得到化合物Ⅲ。步驟C-J．按實(shí)施例7步驟B-Ⅰ所述方法處理樹脂(化合物Ⅲ)，得到化合物Ⅹ1-36。
實(shí)施例10一組式R1-36-Lys(ε-Tfa)-Lys(ε-IINP)-ANP-Tfp化合物的制備圖8圖解顯示平行地合成一組36個(gè)T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別是四氟苯酯)，L2是鄰硝基芐胺基團(tuán)且L3是連接Lh和L2的亞甲基，T具有其中第一個(gè)賴氨酸的羧酸基團(tuán)已連接到L2芐胺基團(tuán)氮原子上以形成酰胺鍵的模式結(jié)構(gòu)，質(zhì)譜靈敏度增強(qiáng)子基團(tuán)(通過(guò)N-甲基異哌啶甲酸導(dǎo)入的)通過(guò)第一個(gè)賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)結(jié)合，第二個(gè)賴氨酸分子已通過(guò)第一個(gè)賴氨酸的α氨基基團(tuán)被連接到第一個(gè)賴氨酸上，分子量調(diào)整基團(tuán)(具有三氟乙酰結(jié)構(gòu))則是通過(guò)第二個(gè)賴氨酸的ε氨基基團(tuán)結(jié)合的，并且分子量可變成分R1-36(這些R基團(tuán)相當(dāng)于本文定義的T2，并且可通過(guò)本文所示出的任何特異性羧酸被導(dǎo)入)通過(guò)第二個(gè)賴氨酸的α氨基基團(tuán)被結(jié)合。參見圖8步驟A-E．這些步驟與實(shí)施例5的步驟A-E完全相同。步驟F．按實(shí)施例5中步驟B所述方法用哌啶處理樹脂(化合物Ⅵ)，以除去FMOC基團(tuán)。步驟G．使用實(shí)施例5的步驟C中所述的偶聯(lián)方法將去保護(hù)的樹脂(化合物Ⅶ)偶聯(lián)到Fmoc-Lys(Tfa)-OH上，得到化合物Ⅷ。步驟H-K．按實(shí)施例5步驟F-J所述處理樹脂(化合物Ⅷ)，得到化合物Ⅸ1-36。
實(shí)施例11一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-5′-AH-ODN化合物的制備圖9舉例顯示了平行地合成一組36個(gè)T-L-X化合物(X=MOI，MOI是核酸片段，ODN)，該組化合物衍生于實(shí)施例7的酯(其中X是活化酯的其他T-L-X化合物可使用同樣方法)。MOI通過(guò)磷酸二酯-亞烷基胺基團(tuán)借MOI的5′端連接到T-L上。
參見圖9步驟A．按照Van Ness等，核酸研究，19,3345(1991)中所述的改良的生物素化方法制備化合物Ⅻ1-36。向其中一種5′氨己基寡核苷酸(化合物Ⅺ1-36,1mg)在200mM硼酸鈉(pH8.3,250ml)中的溶液內(nèi)加入一種四氟苯基酯(得自實(shí)施例7的化合物Ⅹ1-36，在250ml NMP中100倍摩爾過(guò)量)。在室溫下保溫反應(yīng)過(guò)夜。經(jīng)Sephadex G50層析從化合物Ⅻ1-36中除去未反應(yīng)的和水解的四氟苯基酯。
實(shí)施例12一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Lys(ε-(MCT-5′-AH-ODN))-NH2化合物的制備圖10舉例顯示平行地合成一組衍生于實(shí)施例11胺的36種T-L-X化合物(X=MOI,MOI是核酸片段，ODN)(可使用同樣方法制備其X是胺的其他T-L-X化合物)。MOI通過(guò)磷酸二酯-亞烷基胺基團(tuán)借MOI的5′端連接到T-L上。
參見圖10步驟A．按Van Ness等，核酸研究,19,3345(1991)中描述的方法制備5′-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基)己基]寡核苷酸Ⅻ1-36。步驟B．向5′-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基)己基]寡核苷酸(化合物Ⅻ1-36)在100mM硼酸鈉(pH8.3)中的1mg/ml濃度溶液加入100倍摩爾過(guò)量的選自R1-36-Lys(ε-iNIP)-ANP-Lys(ε-NH2)NH2的伯胺(實(shí)施例11中的化合物Ⅹ1-36)。室溫下將溶液混合過(guò)夜。使用H2O作為洗滌溶液(3X)通過(guò)300MW截留值的膜(Amicon,Beverly,MA)超濾除去未反應(yīng)的胺使體積減少到100ml以分離化合物ⅩⅢ1-36。
實(shí)施例13演示用質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記本實(shí)施例描述質(zhì)譜檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)化合物(標(biāo)記)的能力。在該特定實(shí)施例中，將31種化合物與基質(zhì)混合，沉積在固相載體上并干燥之，然后用激光解吸。將所得到的離子導(dǎo)入質(zhì)譜儀中。
等摩量混合下列化合物(購(gòu)自Aldrich,Milwaukee,WI)以達(dá)到0.002M的終濃度(每種化合物)苯甲酰胺(121.14)、煙酰胺(122.13)、吡嗪酰胺(123.12)、3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)、2-噻酚羧酰胺(127.17)、4-氨基苯甲酰胺(135.15)、甲苯酰胺(135.17)、6-甲基煙酰胺(136.15)、3-氨基煙酰胺(137.14)、煙酰胺N-氧化物(138.12)、3-羥吡啶酰胺(138.13)、4-氟苯甲酰胺(139.13)、肉桂酰胺(147.18)、4-甲氧基苯甲酰胺(151.17)、2,6-二氟苯甲酰胺(157.12)、4-氨基-5-咪唑羧酰胺(162.58)、3,4-吡啶二羧酰胺(165.16)、4-乙氧基苯甲酰胺(165.19)、2,3-吡嗪二羧酰胺(166.14)、2-硝基苯甲酰胺(166.14),3-氟-4-甲氧基苯甲酸(170.4)、吲哚-3-乙酰胺(174.2)、5-乙酰水楊酰胺(179.18)、3,5-二甲氧基苯甲酰胺(181.19)、1-萘乙酰胺(185.23)、8-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧酰胺(187.59)、4-三氟甲基苯甲酰胺(189.00)、5-氨基-5-苯基-4-吡唑-羧酰胺(202.22)、1-甲基-2-芐基-丙二酸酯(207.33)、4-氨基-2,3,5,6-四氟基甲酰胺(208.11)、2,3-萘二羧酸(212.22)。將這些化合物以上述濃度放在DMSO中。然后將1μl材料與α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(1∶10,000稀釋之后)混合并沉積到固體不銹鋼載體上。
然后使用Protein TOF質(zhì)譜儀(Bruker,Manning Park MA)用激光照射以使材料解吸，并以線性和反射操作模式檢測(cè)所得離子。觀察到下列m/z值(圖11)121.1-->苯甲酰胺(121.14)122.1-->煙酰胺(122.13)123.1-->吡嗪酰胺(123.12)124.1125.2127.3-->3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)127.2-->2-噻吩羧酰胺(127.17)135.1-->4-氨基苯甲酰胺(135.15)135.1-->甲苯酰胺(135.17)136.2-->6-甲基煙酰胺(136.15)137.1-->3-氨基煙酰胺(137.14)138.2-->煙酰胺N-氧化物(138.12)138.2-->3-羥吡啶酰胺(138.13)139.2-->4氟苯甲酰胺(139.13)140.2147.3-->肉桂酰胺(147.18)148.2149.24-甲氧基苯甲酰胺(151.17)152.22,6-二氟苯甲酰胺(157.12)158.34-氨基-5-咪唑-羧酰胺(162.58)163.3165.2-->3,4-吡啶-二羧酰胺(165.16)165.2-->4-乙氧基苯甲酰胺(165.19)166.2-->2,3-吡嗪二羧酰胺(166.14)166.2-->2-硝基苯甲酰胺(166.14)3-氟-4-甲氧苯甲酸(170.4)171.1172.2173.4吲哚-3-乙酰胺(174.2)178.3179.3-->5-乙酰水楊酰胺(179.18)181.2-->3,5-二甲氧萘苯甲酰胺(181.19)182.2-->
1-萘乙酰胺(185.23)186.2
8-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧酰胺(187.59)188.2189.2-->4-三氟甲基-苯甲酰胺(189.00)190.2191.2192.35-氨基-5-苯基-4-吡啶-羧酰胺(202.22)203.2203.41-甲基-2-苯基-丙二酸酯(207.33)4-氨基-2,3,5,6-四氟苯甲酰胺(208.11)212.2-->2,3-萘二羧酸(212.22)219.3221.2228.2234.2237.4241.4數(shù)據(jù)表明31種化合物中有21種出現(xiàn)在預(yù)期質(zhì)量的范圍中，31化合物中有9種出現(xiàn)在超出預(yù)期質(zhì)量范圍有n+H質(zhì)量(1個(gè)原子質(zhì)量單位，amu)的范圍中。后一種現(xiàn)象可能是由于化合物內(nèi)胺的質(zhì)子化作用。因此31種化合物均可用MALDI質(zhì)譜法檢測(cè)。更重要的是，該實(shí)施例證明可用質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記。
單獨(dú)α-氰基基質(zhì)(圖11)在146.2、164.1、172.1、173.1、189.1、190.1、191.1、192.1、212.1、224.1、228.0、234.3處產(chǎn)生峰。光譜中其他已鑒定的質(zhì)量是由于所購(gòu)買的化合物中因沒(méi)有進(jìn)一步純化這些化合物而帶的污染物。
實(shí)施例14微衛(wèi)星標(biāo)志PCR擴(kuò)增使用下述標(biāo)準(zhǔn)PCR條件擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)志。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在含有40ng基因組DNA、各50pmol引物、0.125mM dNTP和1單位Tag聚合酶的總體積50μl反應(yīng)混合物中完成PCR反應(yīng)。1X擴(kuò)增緩沖液含有10mMTris堿，pH9,50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％ Tr．iton X-100和0.01％明膠。使用“熱起始”程序進(jìn)行反應(yīng)在96℃5分鐘第一次變性步驟后加入Tag聚合酶。經(jīng)35次循環(huán)完成擴(kuò)增變性(94℃，40秒)和退火(55℃，30秒)。最后一次退火后以延伸步驟(72℃，2分鐘)終止擴(kuò)增過(guò)程。因?yàn)閷⒌玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物較短(90至350bp長(zhǎng))并且溫度從55℃升高到94℃(以1℃/秒的上升率達(dá)到的)的時(shí)間間隔足夠長(zhǎng)，所以沒(méi)有72℃的步驟即可完成DNA延伸。
從上文可以理解到，雖然本文已為舉例說(shuō)明的目的描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但可在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下作出各種改動(dòng)。
權(quán)利要求
1．鑒定核酸分子的方法，其包括(a)從一個(gè)或多個(gè)選擇的核酸分子產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定的核酸片段相互關(guān)聯(lián)的；并且是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按大小分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而鑒定所述核酸分子。
2．檢測(cè)選擇的核酸分子的方法，其(a)在足以使標(biāo)記的核酸探針與互補(bǔ)的選擇的靶核酸序列雜交的條件下使標(biāo)記的核酸探針與靶核酸分子結(jié)合足夠長(zhǎng)時(shí)間，其中標(biāo)記的核酸探針是可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)改變雜交的標(biāo)記探針的大小、未雜交的探針或靶分子的大小、或探針靶雜交體的大??；(c)按大小分離標(biāo)記的探針；(d)從標(biāo)記的探針上切掉標(biāo)記；以及(e)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而檢測(cè)選擇的核酸分子。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中用質(zhì)譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恒電勢(shì)電流測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生4個(gè)以上標(biāo)記的核酸片段，并且其中各個(gè)標(biāo)記對(duì)于選擇的核酸片段都是獨(dú)特的。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中利用4個(gè)以上標(biāo)記的核酸探針，并且其中各個(gè)標(biāo)記對(duì)于選擇的核酸片段都是獨(dú)特的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說(shuō)的靶核酸分子是經(jīng)引物延伸得到的。
7．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中用選自聚合酶延伸、連接、核酸外切酶消化和核酸內(nèi)切酶消化的方法改變所說(shuō)的雜交的標(biāo)記探針、未雜交的探針或靶分子、或探針靶雜交體的大小。
8．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中用選自凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析和過(guò)濾的方法分離標(biāo)記的分子。
9．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中用選自氧化、還原、酸敏感性、堿敏感性、酶促、電化學(xué)、熱和光敏感性方法裂解標(biāo)記的分子。
10．根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中用飛行時(shí)間質(zhì)譜、四極質(zhì)譜、磁扇形場(chǎng)質(zhì)譜和電扇形場(chǎng)質(zhì)譜法檢測(cè)標(biāo)記。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中利用選自庫(kù)侖檢測(cè)器和電流檢測(cè)器以恒電勢(shì)電流測(cè)定法檢測(cè)所說(shuō)的標(biāo)記。
12．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中以連續(xù)方式完成分離、裂解和檢測(cè)的步驟。
13．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在單一裝置上以連續(xù)方式完成分離、裂解和檢測(cè)步驟。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中分離、裂解和檢測(cè)的步驟是自動(dòng)化的。
15．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子或探針是從5′標(biāo)記的核苷酸終止子產(chǎn)生的。
16．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子或探針是從標(biāo)記的二脫氧核苷酸終止子產(chǎn)生的。
17．對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定的方法，其包括(a)從選擇的靶分子中產(chǎn)生標(biāo)記的核酸分子，其中標(biāo)記是與特定片段相互關(guān)聯(lián)并可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按序列長(zhǎng)度分離標(biāo)記的分子；(c)從標(biāo)記的分子上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定所說(shuō)生物體的基因型。
18．對(duì)選擇的生物體進(jìn)行基因型鑒定的方法，其包括(a)在足以使標(biāo)記分子與靶分子雜交的條件下使標(biāo)記的核酸分子與選擇的靶分子結(jié)合足夠長(zhǎng)時(shí)間，其中標(biāo)記是與特定的片段相互關(guān)聯(lián)并且可用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)的；(b)按序列的長(zhǎng)度分離標(biāo)記的片段；(c)從標(biāo)記的片段上裂解標(biāo)記；以及(d)用非熒光光譜法或電位測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記，從而確定生物體的基因型。
19．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中標(biāo)記的分子是從選自基因組克隆、cDNA克隆和RNA克隆的克隆集合體中產(chǎn)生的。
20．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子是經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的。
21．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中用質(zhì)譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恒電勢(shì)電流測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記。
22．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中產(chǎn)生4個(gè)以上標(biāo)記的核酸分子，并且其中各個(gè)標(biāo)記對(duì)于選擇的核酸片段都是獨(dú)特的。
23．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所說(shuō)的靶核酸分子是經(jīng)引物延伸得到的。
24．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中用選自凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析和過(guò)濾的方法分離標(biāo)記的分子。
25．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中用選自氧化、還原、酸敏感性、堿敏感性、酶促、電化學(xué)、熱和光敏感性方法裂解標(biāo)記的分子。
26．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中用飛行時(shí)間質(zhì)譜、四極質(zhì)譜、磁扇形場(chǎng)質(zhì)譜和電扇形場(chǎng)質(zhì)譜法檢測(cè)標(biāo)記。
27．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中利用選自庫(kù)侖檢測(cè)器和電流檢測(cè)器以恒電勢(shì)電流測(cè)定法檢測(cè)所說(shuō)的標(biāo)記。
28．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中以連續(xù)方式完成分離、裂解和檢測(cè)的步驟。
29．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中在單一裝置上以連續(xù)方式完成分離、裂解和檢測(cè)步驟。
30．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中分離、裂解和檢測(cè)的步驟是自動(dòng)化的。
31．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子是從非3′標(biāo)記的寡核苷酸引物產(chǎn)生的。
32．根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子是從標(biāo)記的二脫氧核苷酸終止子產(chǎn)生的。
33．根據(jù)權(quán)利要求1、2或17的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記的分子是從生物學(xué)樣品中得到的。
34．含有下式的多個(gè)化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且其中至少兩個(gè)化合物具有同樣的Tms，但這些分子的MOI基團(tuán)具有不同的核苷酸長(zhǎng)度。
35．包含有式多個(gè)化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且其中至少兩個(gè)化合物具有同樣的Tms，但那些化合物具有不同的柱層析洗脫時(shí)間。
36．包含有下式的多個(gè)化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且其中沒(méi)有兩個(gè)具有同樣MOI核苷酸長(zhǎng)度也具有同樣的Tms的化合物。
37．權(quán)利要求34-36中任何一項(xiàng)的組合物，其中多個(gè)是大于2個(gè)。
38．權(quán)利要求34-36中任何一項(xiàng)的組合物，其中多個(gè)是大于4個(gè)。
39．權(quán)利要求34-36中任何一項(xiàng)的組合物，其中核酸片段具有互補(bǔ)于載體之一部分的序列，其中該片段能夠引發(fā)多核苷酸合成。
40．權(quán)利要求34-36中任何一項(xiàng)的組合物，其中多個(gè)化合物之成員的Tms基團(tuán)相差至少2amu。
41．權(quán)利要求34-36中任何一項(xiàng)的組合物，其中多個(gè)化合物之成員的Tms基團(tuán)核差至少4amu。
42．包含多組化合物的組合物，每組化合物均具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且第一組化合物內(nèi)的成員具有相同的Tms基團(tuán)，但具有不同的MOI基團(tuán)，其中MOI中有不同數(shù)目的核苷酸，且第一組內(nèi)至少有10個(gè)成員，各組間Tms基團(tuán)至少相差2amu。
43．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中多組是至少3組。
44．根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中多組是至少5組。
45．包含多組化合物的組合物，各組化合物均具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且其中，一組內(nèi)的化合物具有同樣的洗脫時(shí)間，但有不同的Tms基團(tuán)。
46．包含多個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)的基因型鑒定試劑盒，其中至少一個(gè)引物具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質(zhì)譜法檢測(cè)的有機(jī)基團(tuán)，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其余部分裂解掉含Tms部分的有機(jī)基團(tuán)，其中含Tms部分包括當(dāng)化合物經(jīng)受質(zhì)譜分析時(shí)支持單一離子化帶電狀態(tài)的功能團(tuán)，并選自叔胺、季胺和有機(jī)酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，并且每個(gè)引物對(duì)與不同的基因座相結(jié)合。
47．根據(jù)權(quán)利要求46的試劑盒，其中多個(gè)是至少3個(gè)。
48．根據(jù)權(quán)利要求46的試劑盒，其中多個(gè)是至少5個(gè)。
全文摘要
公開了為各種核酸反應(yīng)而特別設(shè)計(jì)的標(biāo)記和接頭,其適合于其中需要按大小分離核酸分子的各種核酸反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1212020SQ97192555
公開日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年1月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月23日
發(fā)明者J·范尼斯, J·C·特邦, J·J·豪伯特, J·T·默利甘 申請(qǐng)人:拉普吉恩公司