一種安全編碼Cas9蛋白的核酸分子及其表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種安全編碼Cas9蛋白的核酸分子及其表 達(dá)載體。
【背景技術(shù)】
[0002] CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat ( CRISPR) -CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技術(shù)是近年出現(xiàn)的革命性的基因編輯 技術(shù)。該技術(shù)可以快速,容易的實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA序列在精確的位點(diǎn)進(jìn)行編輯,包括突變,修 改,插入等改變,使得生命的遺傳密碼可以按照人類的意愿改變,可以在細(xì)胞層面,也可以 在生命個(gè)體層面。該技術(shù)還近年還有廣泛的拓展應(yīng)用,如用于基因的激活,干擾,活細(xì)胞基 因標(biāo)記,RNA的切割等等。對于農(nóng)業(yè),工業(yè),藥業(yè),以及人類的健康都有廣泛的應(yīng)用前景(參 見文獻(xiàn):Hsu, P. D.,Lander, E. S.,and Zhang, F. (2014) · Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering. Cell 157,1262-1278)。
[0003] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)艮P成 簇規(guī)律間隔短回文重復(fù),是存在于細(xì)菌基因組中的DNA序列,Cas(CRISPR associated)即 CRISPR相關(guān)基因,有多種類型,Cas9是其中一種。CRISPR-Cas9系統(tǒng)本身是細(xì)菌的一種獲 得性免疫機(jī)制,用于切割入侵的外源DNA。將其用于基因編輯,該技術(shù)以其簡單,高效,精確 等優(yōu)勢,迅速得到廣泛應(yīng)用,該技術(shù)也被評為生物學(xué)2013年10大突破之一。
[0004] 該技術(shù)主要是通過向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入gRNA和Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的切割。gRNA 是一個(gè)經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)的向?qū)NA,可以識別并結(jié)合靶基因 DNA序列,Cas9蛋白是一個(gè)酶,可 以與gRNA以及其識別的DNA結(jié)合,將目的DNA序列切斷,再利用細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)機(jī)制以 及同源重組等機(jī)制,實(shí)現(xiàn)對DNA在斷裂位點(diǎn)及附近進(jìn)行突變,插入,替換等等修改,實(shí)現(xiàn)基因 編輯的目的(參見文獻(xiàn):Mali, P.,Yang, L.,Esvelt, K. M.,Aach, J.,Guell, M.,DiCarlo, ΙΕ. , Norville, J. E. , and Church, G. M. (2013) · RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823-826)。通常情況下,向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入Cas9蛋白是通過轉(zhuǎn)染或感染 Cas9表達(dá)載體而實(shí)現(xiàn)的,比如在細(xì)胞里轉(zhuǎn)染Cas9表達(dá)質(zhì)粒,而Cas9表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)被 轉(zhuǎn)錄為mRNA,進(jìn)而翻譯為Cas9蛋白,發(fā)揮結(jié)合gRNA,靶向切割DNA的作用。由此我們想到, Cas9的mRNA作為外源的核酸物質(zhì),會不會影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,對細(xì)胞產(chǎn)生影響?
[0005] mRNA和microRNA有廣泛的相互作用,近年不斷發(fā)現(xiàn)mRNA可以結(jié)合并吸附 與其序列部分互補(bǔ)的microRNA,從而抑制這些microRNA,使得這些microRNA所抑制 的 mRNA 表達(dá)上調(diào)(參見文獻(xiàn):Hansen, T. B.,Jensen, T. I.,Clausen, B. H.,Bramsen, J. B. , Finsen, B. , Damgaard, C. K. , and Kjems, J. (2013). Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 495,384-388)。本發(fā)明人所在的實(shí)驗(yàn)室前期 的實(shí)驗(yàn)也在胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一條長鏈非編碼RNA,IincRNA-RoR可以吸附mir-145,從而 上調(diào)mir-145的靶基因:0ct4, Nanog等干細(xì)胞多能因子,維持胚胎干細(xì)胞的多能性(參 見文獻(xiàn):Wang, Y.,Xu, Z.,Jiang, J.,Xu, C.,Kang, J.,Xiao, L.,Wu, M.,Xiong, J.,Guo, X.,a nd Liu, Η. (2013). Endogenous miRNA sponge IincRNA-RoR regulates 0ct4, Nanog, and Sox2in human embryonic stem cell self-renewal. Dev Cell 25,69-80)。因此,本發(fā)明 人深知在存在序列部分互補(bǔ)的情況下,在mRNA表達(dá)量比較高的條件下,mRNA完全可以吸附 microRNA,從而上調(diào)該microRNA的革巴基因。
[0006] 由于CRISPR-Cas9技術(shù)通常需要在細(xì)胞中表達(dá)高水平的Cas9的mRNA,因此本發(fā)明 人認(rèn)為極有必要評估這條外源mRNA是否能夠影響某些重要microRNA。
[0007] 經(jīng)檢索國內(nèi)外科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn),CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于基因工程的研宄 很多,例如中國專利申請CN201410400098. X等,也致力于研發(fā)新的攜帶Cas9蛋白的編 碼基因的重組表達(dá)載體,該專利申請涉及的是攜帶CAS9的重組腺病毒,申請公布號為 CN104178461A。
[0008] 但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道Cas9的mRNA與microRNA的相互作用,并從此方面入手改進(jìn) CRISPR-Cas9 技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種更安全的編碼Cas9蛋白的核酸分子,本發(fā)明的另一 目的在于提供攜帶上述編碼Cas9蛋白的核酸分子的重組表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明的第三目的在于提供上述的核酸分子及其重組表達(dá)載體在CRISPR-Cas9 技術(shù)中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第四目的在于提供一種減弱Cas9核酸分子與microRNA結(jié)合的方法。
[0012] 本發(fā)明人通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的Cas9表達(dá)載體所轉(zhuǎn)錄的 mRNA上存在3個(gè)microRNA let-7家族的結(jié)合位點(diǎn)(如圖1所示),而已報(bào)道的let-7家族 的靶基因大多是癌基因。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染現(xiàn)有的Cas9表達(dá)載體后,本發(fā)明人檢測發(fā)現(xiàn)一些重要 的癌基因表達(dá)水平明顯上升,如CCND2、hRAS、kRAS等(如圖2A所示)。
[0013] 因此,本發(fā)明人認(rèn)為,將現(xiàn)有的Cas9表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞有增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0014] 本發(fā)明人設(shè)想構(gòu)建一種新的Cas9表達(dá)載體,降低其mRNA與重要microRNA的結(jié)合 力,且仍能翻譯為功能完全的Cas9蛋白,將有利于提高CRISPR-Cas9技術(shù)的安全性。
[0015] 本發(fā)明的第一方面,提供一種更安全的編碼Cas9蛋白的核酸分子,所述的編碼 Cas9蛋白的核酸分子,其mRNA形式的序列選自以下任一:
[0016] a)如 SEQ ID NO :1 所示;或
[0017] b)是對SEQ ID NO :1所示的序列修改、添加、缺失或取代若干個(gè)核苷酸而得的序 列,并且所述Cas9的mRNA與microRNA let-7的結(jié)合力弱。
[0018] 所述Cas9的mRNA與microRNA let-7的結(jié)合力弱,是指不至于上調(diào)let-7抑制的 癌基因,或上調(diào)程度降低,可減低Cas9核酸分子的致癌風(fēng)險(xiǎn)。
[0019] 本發(fā)明所述的M-mir-Cas9的序列,可以是在SEQ ID N0:1所示的序列的基礎(chǔ)上 修改、添加、缺失或取代若干個(gè)核苷酸而得的核酸序列。且達(dá)到同樣的與let-7結(jié)合減弱并 能翻譯為發(fā)揮功能的Cas9蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉,要達(dá)到減低Cas9的mRNA與let-7 結(jié)合減弱,對Cas9的mRNA與let-7的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行同義突變就可以,本發(fā)明所提供的序列 只提供一種特例,本發(fā)明還包括其他能達(dá)到同義突變目的的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知曉, mRNA可以包括5 ' UTR和3 ' UTR,本發(fā)明所提供的序列只提供編碼M-mir-Cas9的⑶S區(qū),其 5' UTR和3' UTR可以有多種序列樣式。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)選的Cas9核酸分子,如SEQ ID NO :1所示。
[0021] 本發(fā)明的第二方面,提供一種攜帶上述編碼Cas9蛋白的核酸分子的重組表達(dá)載 體,所述的攜帶編碼Cas9蛋白的核酸分子的重組表達(dá)載體,本發(fā)明命名為M-mir-Cas9,其 中攜帶的編碼Cas9蛋白的核酸分子其mRNA形式的序列選自以下任一:
[0022] a)如 SEQ ID NO :1 所示;或
[0023] b)是對SEQ ID NO :1所示的序列修改、添加、缺失或取代若干個(gè)核苷酸而得的序 列,并且所述Cas9的mRNA與microRNA let-7的結(jié)合力弱。
[0024] 所述的載體可以是質(zhì)粒、病毒(如慢病毒或腺病毒等)、合成序列、人工染色體等, 也可以是RNA等。
[0025] 所述Cas9的mRNA與microRNA let-7的結(jié)合力弱,是指不至于上調(diào)let-7抑制的 癌基因或上調(diào)程度降低,可減低Cas9核酸分子的致癌風(fēng)險(xiǎn)。
[0026] 本發(fā)明優(yōu)選的Cas9核酸分子,如SEQ ID NO :1所示。
[0027] 本發(fā)明的第三方面,提供上述的核酸分子及其重組表達(dá)載體在CRISPR_Cas9技術(shù) 中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明人提供的M-mir_Cas9核酸序列,將之前的Cas9序列上3個(gè)結(jié)合let-7家 族的位點(diǎn)全部做了同義突變,因此M-mir-Cas9不具有與let-7結(jié)合的序列基礎(chǔ),本發(fā)明人 通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),將M-mir-Cas9表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞后,CCND2, hRAS,kRAS等癌基因的表達(dá)水 平?jīng)]有明顯上調(diào)(圖2B),再導(dǎo)入相應(yīng)gRNA后,目的基因仍能被成功敲除(圖3)。說明本 發(fā)明人提供的M-mir-Cas9表達(dá)載體相對于現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的Cas9表達(dá)載體具有同樣功能, 但安全性更高。
[0029] 本發(fā)明提供的一個(gè)新的Cas9表達(dá)載體(M-mir-Cas9),所轉(zhuǎn)錄出的mRNA與關(guān)鍵 microRNAlet-7的結(jié)合力弱,不能吸附let-7,同時(shí)依然能翻譯成完整的Cas9蛋白發(fā)揮作 用,增加 CRISPR-Cas9基因編輯工具的安全性。本發(fā)明不上調(diào)let-7抑制的癌基因,可以克 服現(xiàn)有Cas9表達(dá)載體增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)的弊端,涉及更加安全的CRISPR-Cas9基因編輯工具及 其應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的第四方面,提供一種減弱Cas9核酸分子與microRNA結(jié)合的方法,使得 Cas9的應(yīng)用中考慮其與microRNA的相互作用,從而對其進(jìn)行改進(jìn)。
[0031] 所述的方法包括以下步驟:
[0032] E.生物信息學(xué)方法分析現(xiàn)有的Cas9表達(dá)載體與microRNA結(jié)合的位點(diǎn);分析可與 Cas9的mRNA結(jié)合的microRNA的作用,確定關(guān)鍵的microRNA,作為一個(gè)特例,本發(fā)明主要研 宄Cas9與microRNA let-7的相互作用,也可以研宄Cas9與其他任何microRNA的相互作 用,如 mir-145, mir-22, mir-15 等;
[0033] F.分析Cas9對步驟A確定的microRNA所抑制的基因表達(dá)情況的影響;作為一 個(gè)特例,本發(fā)明主要研宄Cas9表達(dá)載體所轉(zhuǎn)錄出的mRNA對let-7所抑制的基因如CCND2, hRAS,kRAS 的影響。
[0034] G.步驟B確認(rèn)Cas9與相應(yīng)microRNA革巴基因的表達(dá)情況成正比(或反比)后,同 義突變Cas9中與相應(yīng)microRNA結(jié)合的位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成Cas9核酸分子;
[0035] H.構(gòu)建攜帶步驟C合成的Cas9核酸分子的重組表達(dá)載體。
[0036] 進(jìn)一步地,實(shí)驗(yàn)分析步驟D獲得的M-mir-Cas9表達(dá)載體所轉(zhuǎn)錄出的mRNA對相應(yīng) microRNA革巴基因的影響。
[0037] 進(jìn)一步地,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證步驟D獲得的M-mir_Cas9表達(dá)載體具有在gRNA的幫助下位 點(diǎn)特異性的切割靶DNA的功能。
[0038] 所述的同義突變,是利用遺傳密碼是簡并性,即決定一個(gè)氨基酸的密碼子大 多不止一個(gè),置換對應(yīng)同一個(gè)氨基酸的核酸三聯(lián)體密碼子,這