果梅PmARF基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及果梅PmARF基因及其應(yīng)用，具體涉及包括該基因 的重組載體和工程，以及在植物花器官形態(tài)培育和改良中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的花器官發(fā)育是植物發(fā)育過程中最引人注目的事件，花芽的形成意味生殖生 長的開始。而花器官發(fā)育不良也嚴(yán)重影響植物的產(chǎn)量，因此對植物花發(fā)育進行研宄對生 產(chǎn)具有重要而深遠的意義。生長素響應(yīng)因子（Auxin response factor，ARF)是Ulmasov 等（Ulmasov et al.1999)發(fā)現(xiàn)的能與生長素早期反應(yīng)基因啟動子中的生長素應(yīng)答元件 (AuxRE) TGTCTC序列特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)生長素反應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄激活或抑制的一類新的 轉(zhuǎn)錄因子。有關(guān)ARF生物學(xué)功能的主要資料最早來自擬南芥ARF基因功能缺失突變體表型 的研宄：缺失ARF5使得葉維管大大減少，并影響了胚軸的形成，暗示該基因在維管組織的 形成和發(fā)育中起作用（Hardtke et al 1998);缺失ARF3會導(dǎo)致蕊基部及頂端發(fā)育不良，其 最明顯的表型為雌蕊的背腹結(jié)構(gòu)混亂，說明ARF3可能與調(diào)節(jié)花器官的發(fā)育有關(guān)（Session RA. 1997);擬南芥共生同源生長素反應(yīng)因子arf6和arf8單個突變體都表現(xiàn)出花成熟期推 遲和生育率降低的現(xiàn)象，但arf6arf8雙突變會導(dǎo)致植株在幼苗發(fā)育之前就阻止花的發(fā)育 并且種子完全不育（Nagpal et al. 2005)，arf6和arf8雙突變體還能造成花芽敗育、花瓣 短、雄蕊細絲短、花藥不張裂，導(dǎo)致不釋放花粉和雌蕊不成熟。這些研宄都表明ARF對植物 的花器官，尤其是雌蕊發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。但這些研宄主要在模式植物開展，而木本 植物雌蕊形成與發(fā)育的分子基礎(chǔ)研宄報道較少，更沒有系統(tǒng)地研宄這些基因在木本植物雌 蕊形成和發(fā)育中的分子機理。
[0003] 梅（Prunus mume Sieb. et Zucc.)屬薔薇科（Rosaceae)李屬 Prunus L.)，原產(chǎn) 我國，栽培歷史悠久。在廣東和云南等地民間都有用梅做菜的傳統(tǒng)。在日本是作為佐餐的 必需品，梅酒和飲料也很暢銷，因此每年梅果實的需求量很大，需要從我國大陸和臺灣地區(qū) 等地進口，梅果實也是我國梅產(chǎn)區(qū)重要的出口創(chuàng)匯果品之一。但果梅產(chǎn)量偏低，嚴(yán)重制約 了果梅進一步發(fā)展。造成產(chǎn)量低的重要原因之一是花器官發(fā)育不良。主要表現(xiàn)為花器中缺 少雌蕊形成空心花或子房枯萎、花柱短縮或彎曲、子房瘦小，這樣的畸形花統(tǒng)稱為不完全花 (也稱為雌蕊敗育花）。梅雌蕊原基分化期的雌蕊畸形率大大低于花期雌蕊畸形率，說明梅 的不完全花可能主要是在雌蕊結(jié)構(gòu)分化期由于雌蕊發(fā)育異常而形成。果梅雌蕊敗育的現(xiàn)象 并不是整株花器官變異，而是同一植株上同時存在雌蕊發(fā)育正常和雌蕊沒有或發(fā)育不完全 的敗育花，因此DNA遺傳背景相同，但表型不同，可能的調(diào)控機理和相關(guān)的基因和擬南芥等 模式植物也不盡相同。但上述研宄為分離和鑒定果梅雌蕊敗育的相關(guān)基因提供參考依據(jù)。
[0004] 總體來看，中國果樹轉(zhuǎn)基因研宄已經(jīng)進入國際先進行列，在抗病、抗蟲、抗逆性等 轉(zhuǎn)基因研宄領(lǐng)域已經(jīng)取得了重要進展，為提高果樹育種效率，縮短果樹育種周期，加快果樹 產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進步和結(jié)構(gòu)調(diào)整提供了新的途徑。但是對于中國未來轉(zhuǎn)基因果樹研宄影響最大 的是中國克隆的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的功能基因較少，往往是一個基因在十幾個物種中開展 遺傳轉(zhuǎn)化；此外遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，也在一定程度上制約了中國轉(zhuǎn)基因果樹研宄取得更大 進展。因此，當(dāng)前的研宄重點應(yīng)放在利用中國豐富的果樹種質(zhì)資源克隆果樹自身重要功能 基因，提高基因轉(zhuǎn)化效率以及開發(fā)轉(zhuǎn)基因新技術(shù)上。'大嵌蒂'是中國果梅特有的種質(zhì)資源， 由于其不完全花比例高達76%，嚴(yán)重影響果梅的產(chǎn)量，從而為我們研宄花器官發(fā)育尤其是 雌蕊發(fā)育提供了良好的種質(zhì)資源。從'大嵌蒂'上克隆相關(guān)基因?qū)霟煵葜?，進而特異性研 宄其對花芽發(fā)育過程，乃至花器官形態(tài)建成的影響因素，尤其是為研宄雌蕊發(fā)育提供良好 契機。更為開發(fā)具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)的果樹抗逆性基因鑒定堅實了的基礎(chǔ)。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一個果梅基因 PmARF及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
[0007] 1.本發(fā)明提供一種果梅PmARF基因，該基因序列如SEQ ID NO. 1，該基因不僅參與 花器官的形態(tài)建成，還參與調(diào)控植物、植物葉片的衰老速度，是一個多效型轉(zhuǎn)錄因子。
[0008] 2.本發(fā)明還提供一種包括上述1提供的果梅PmARF基因的表達載體。
[0009] 3.上述2所述表達載體，其原始載體為PBI-121載體，在xbal和SmaI酶切位點引 入果梅PmARF基因的cDNA。
[0010] 4.本發(fā)明還提供一種含有上述2或3提供的表達載體的工程菌。
[0011] 5.上述4提供的工程菌，該工程菌為農(nóng)桿菌。
[0012] 6.本發(fā)明還提供上述1提供的基因或者上述2提供的表達載體在花器官形態(tài)培育 中的應(yīng)用。
[0013] 7.上述1提供的基因或者上述2提供的表達載體在植物改良中的應(yīng)用，其中，改良 方向包括延長植物存活期，提高植物產(chǎn)量。
[0014] 8.上述7提供的應(yīng)用，其中，所述植物為果梅或者煙草。
[0015] 9.本發(fā)明提供上述1提供的基因在煙草品種改良方法的應(yīng)用，該應(yīng)用包括如下步 驟：
[0016] 1)基因開放閱讀框的克?。焊鶕?jù)梅基因組序列Pm019941最大開放閱讀框兩端設(shè) 計引物，上游引物PmARFl 1-F，序列如SEQ ID NO. 2所示，下游引物PmARFl 1-R，序列如SEQ ID NO. 3所示；CTAB法提取果梅品種'大嵌蒂'的總RNA，根據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合 成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板，PmARFl 1-F、PmARFlI-R為引物，PCR擴增，獲得長度 為2136bp的cDNA序列，命名為PmARFll ;
[0017] 2)植物表達載體的構(gòu)建：設(shè)計含有xbal和SmaI酶切位點的特異引物，上游引物 PmARFll-MF :序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物PmARFll-MR :序列如SEQ ID NO. 5所示， 其中，PmARFlI-MF含有xbal酶切位點TCTAGA，PmARFlI-MR含有SmaI酶切位點CCCGGG ;以 PmARFll為模板，PmARFll-MF、PmARFll-MR為引物，PCR擴增，將酶切位點引入PmARFll的基 因序列中；PBI-121載體進行xbal和SmaI雙酶切，獲得酶切大片段；T4連接酶連接引入酶 切位點的PmARF 11和PB I -121載體大片段，獲得重組植物表達載體PB I -121，PCR酶切鑒定；
[0018] 3)遺傳轉(zhuǎn)化：凍融法將重組植物表達載體PBI-121轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,挑取單菌 落于50ml含Km 50mg/L+Rif 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中28°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)， 菌液PCR鑒定陽性克隆；待陽性克隆的菌體0D600值達到0. 5,5000rpm離心10min，棄上清， 沉淀用50ml的無菌MS液體培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得 轉(zhuǎn)基因煙草株系。
[0019] 10.上述9所述應(yīng)用，其中，步驟⑴中PCR擴增條件為，反應(yīng)體系，PCR緩沖液， 2.5 41^(1階13,2 41^;]\%(：12，1.5 41^;稀釋10倍的。0嫩，141^上游引物？11^1^11-卩，0.5 41^; 下游引物 PmARFll-R，0. 5yL ;rTaq 酶，0· 2yL ;ddH20，16.8yL ;其余用水補齊至 25yL ; 反應(yīng)流程，94°0,3〇8,72°0,21^11，5個循環(huán)；94°0,3〇8,62°0,4〇8,72°0,21^11，共5個循環(huán) ； 94°C，30s，6(TC，40s，72°C，135s 共 32 個循環(huán)；72°C，IOmin ;
[0020] 步驟（2)PCR擴增條件為，反應(yīng)體系，稀釋10倍的cDNA，I. 0 μ I ;5XPrimeSTAR GXL 緩沖液，5.0以1;(1階13,2 4 1^上游引物？11^1^11-]\^，0.3 4 1;下游引物？11^1^11-]\?，0.3 4 1; PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶，0. 5 μ I ;ddH20 補齊體系至 25 μ 1。
[0021] 有益效果：
[0022] 1.本發(fā)明首次從果梅品種'大嵌蒂'克隆得到了一個新的PmARF基因，通過NCBI 在線BLAST軟件將'大嵌蒂' PmARFll基因氨基酸序列與NCBI上登錄的其它物種進行序列 比對，PmARFll與桃、蘋果、草莓、毛果楊和擬南芥、同源性分別為91%、71%、67%、60%和 58%〇
[0023] 2.將本發(fā)明基因 PmARF轉(zhuǎn)入煙草中獲得轉(zhuǎn)基因煙草，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因 植株煙草花與野生型相比其花器官具有一定差異，具體表現(xiàn)為，轉(zhuǎn)基因植株花瓣深裂，顏色 較深，開花期明顯延長，轉(zhuǎn)基因雌蕊較野生型雌蕊稍長，葉片衰老加速和植株的生長周期延 長，表明轉(zhuǎn)PmARFll基因不僅參與花器官的形態(tài)建成，還參與調(diào)控植物葉片的衰老速度，故 得出結(jié)論PmARFll在植物體中是一個多效型轉(zhuǎn)錄因子。這為將該基因應(yīng)用于花器官形態(tài)培 育提供可能。同時，由于獲得PmARFll基因的煙草，其生長周期增長，衰老速度明顯減慢，因 此，可以預(yù)測，如果將PmARFll基因轉(zhuǎn)入植株中，可以延長植物存活期，提高植物的產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0024] 圖I :A :PBI121載體的酶切產(chǎn)物
[0025] M !Marker，P1-P2 :PBI121載體酶切后的大片段產(chǎn)物
[0026] B :PBI121-PmARFll 酶切鑒定
[0027] M :marker，1-4 :PBI121-PmARFll 質(zhì)粒
[0028] 圖2 :轉(zhuǎn)PmARFll基因煙草的獲得
[0029] A :轉(zhuǎn)基因煙草的愈傷組織，B :篩選的的陽性植株，C :生根培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0030]