抗體的制作方法
【專利說明】抗ανβ6抗體
[0001] 本申請是申請日為2003年3月13日、發(fā)明名稱為"抗ανβ6抗體"的中國發(fā)明專 利申請No. 03808906. 8的分案申請，是直接基于前一分案申請No. 201210066438. 0提出的。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及抗ανβ6整聯(lián)蛋白抗體。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 整聯(lián)蛋白是一個細胞表面受體超家族，介導細胞-細胞和細胞-基質(zhì)粘附。這些 蛋白質(zhì)被認為在發(fā)育和組織損傷過程中為細胞的生長、遷移和分化提供錨定以及信號。整 聯(lián)蛋白還與細胞的去分化和侵入有關，特別是在細胞失去它們的特化形態(tài)，而成為轉移的 癌細胞時。
[0005] 整聯(lián)蛋白是由兩個非共價連接的亞基一 α和β組成的異源二聚體蛋白質(zhì)。整聯(lián) 蛋白的結合特異性是由18種不同α鏈中的一些與8種不同β鏈中的一些組合所規(guī)定的。 ανβ6整聯(lián)蛋白能夠結合多種配基，包括纖連蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白和最近鑒定的潛伏 相關肽（LAP)，即一種278個氨基酸的肽，其作為前體TGF-β蛋白的一部分合成（Munger等 人，Cell 96 (3) :319-328 (1999))。在分泌過程中，LAP作為N端肽從TGF-β的成熟形式上 切下，但是仍然與TGF-β非共價結合，從而保持潛伏狀態(tài)。該復合物不能與TGF-β受體結 合，因此無生物學活性。α νβ 6整聯(lián)蛋白能夠直接結合LAP內(nèi)所含的RGD基序，導致LAP的 釋放和TGF-β的激活。由于ανβ 6與LAP的結合對于TGF-β轉化為活性狀態(tài)可能非常重 要，因此阻斷這種結合可導致ανβ 6介導的TGF-β激活的抑制和相關的纖維化病理學。 [0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明是基于抗ανβ6高親和力抗體的發(fā)現(xiàn)和表征，包括這些抗體的互補決定區(qū) (CDRs)中關鍵氨基酸殘基的鑒定和分析。
[0008] 本發(fā)明包括一種單克隆抗體，其可以（a)特異性結合avi36;(b)抑制α νβ6與其 配體（如LAP、纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白）的結合，其ICJt低于10D5的IC50值（國 際專利申請公開文本W(wǎng)O 99/07405) ; (c)阻斷TGF-β的激活；⑷含有提供ανβ6結合特 異性的CDR中的某些氨基酸序列（如圖7Α和7Β所示）；(e)特異性結合β 6亞基；和/或 (f)在免疫染色程序，如石蠟包埋組織的免疫染色中識別ανβ 6。
[0009] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與ανβ6結合的抗體可以被分類為生物物理學上不同的類和亞類。一 類抗體顯示阻斷配體（如LAP)與ανβ6結合的能力（阻斷劑）。這類抗體可以被進一步 分為依賴陽離子的阻斷劑和不依賴陽離子的阻斷劑之亞類。一些依賴陽離子的阻斷劑含有 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)肽序列，而不依賴陽離子的阻斷劑不含RGD序列。另一 類抗體顯示與α νβ6結合的能力，并且不能阻斷α νβ6與配體的結合（非阻斷劑）。
[0010] 因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的一些抗體與ανβ6的結合是依賴二 價陽離子的，而有些是不依賴二價陽離子的。示例性的陽離子是Ca2+、Mg2+和Μη2+。
[0011] 在一些實施方案中，抗體包含與雜交瘤6. 1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、 6. 2A1、6. 2E5、7. 1G10、7. 7G5或7. 1C5產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
[0012] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的互補決定區(qū) (⑶R) 1、2和3分別基本（即除了一些保守性變異之外）由SEQ ID NOs: 1、4和7的序列組 成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs: 10、13和15的序列組成。
[0013] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分 別基本由SEQ ID N0s:3、5和8的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs: 11、14和17的序列組成。
[0014] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分 別基本由SEQ ID N0s:3、6和9的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs: 12、14和18的序列組成。
[0015] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分 別基本由SEQ ID NOs:2、46和47的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs:48、13和16的序列組成。
[0016] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分 別基本由SEQ ID N0s:49、51和53的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs: 55、57和59的序列組成。
[0017] 在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分 別基本由SEQ ID N0s:50、52和54的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs: 56、58和60的序列組成。
[0018] 在一些實施方案中，抗體包含SEQ ID NOs :19-36和61-62中任何一個的重鏈可變 域序列。
[0019] 在一些實施方案中，抗體分別包含下列重鏈和輕鏈可變域序列：
[0020] (I)SEQ ID NOs: 19 和 37 ;
[0021] (2) SEQ ID NOs: 20 或 21，和 SEQ ID NO: 38 ;
[0022] (3) SEQ ID NOs: 22 和 43 ;
[0023] (4) SEQ ID NOs: 23 和 44 ;
[0024] (5) SEQ ID NOs: 24 和 45 ;
[0025] (6) SEQ ID NOs: 25 或 26,和 SEQ ID NOs: 42 ;
[0026] (7) SEQ ID N0s27、28 或 29,和 SEQ ID NOs: 39 ;
[0027] (8) SEQ ID NOs: 34 或 35,和 SEQ ID NOs: 40 ;
[0028] (9) SEQ ID NOs: 36 和 41 ;
[0029] (IO)SEQ ID NOs: 61 和 63 ;或
[0030] (Il)SEQ ID NOs: 62 和 64。
[0031] 在一些實施方案中，抗體可特異性結合ανβ6，但是不抑制α νβ6與潛伏相關肽 (LAP)的結合。至少有些這樣的抗體能夠與石蠟包埋組織切片中的ανβ6結合，因此能夠 用于診斷用途。示例性的抗體包括6. 2Α1和6. 2Ε5。
[0032] 本發(fā)明也包括可結合與上述任何抗體相同表位的抗體。
[0033] 本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的一種或多種抗體和藥學可接受的載體的組合物。在一 些這樣的組合物中，抗體與細胞毒性劑（即影響細胞的存活力和/或功能的物質(zhì)）如毒素 或放射性核素偶聯(lián)。這些組合物中的抗體可以是依賴陽離子的抗體。這些組合物能夠對患 有或者具有患ανβ6介導的疾病危險的對象（例如哺乳動物，如人）施用，以治療（例如緩 解、減輕、降低、阻止、延遲發(fā)生）該疾病。這類疾病的例子包括，但不限于：纖維化（例如硬 皮病、結瘢、肝纖維化、肺纖維化和腎纖維化）；銀屑?。话┌Y（例如上皮癌；口腔、皮膚、子 宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結腸直腸癌）；奧爾波特綜合征；急性及慢性肺、肝、 腎和其它內(nèi)臟損傷；肺、肝、腎和其它內(nèi)臟的硬化?；歼@些疾病的危險可能是由于遺傳誘因； 某些生活方式，如吸煙和酗酒；接觸環(huán)境污染物，如石棉；生理疾病，如糖尿病、肝炎病毒感 染（例如丙型肝炎病毒感染）、自身免疫??；和醫(yī)學治療，如放射治療。
[0034] 本發(fā)明還包括檢測來自哺乳動物（例如人）的組織標本中α ν β 6的方法，包括使 組織標本接觸本發(fā)明的抗體，如6. 2Α1和6. 2Ε5。
[0035] 本發(fā)明還包括雜交瘤 6. 1A8、6. 2B10、6. 3G9、6. 8G6、6. 2B1、6. 2A1、6. 2E5、7. 1G10、 7. 7G5和7. 1C5的細胞；包含編碼SEQ ID NOs: 19-45和61-64中任何一種的序列的分離的 核酸；包含SEQ ID NOs: 19-45和61-64中任何一種的氨基酸序列的分離的多肽。
[0036] 本發(fā)明的抗體是指完整抗體，例如，含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體，或者是指完 整抗體的抗原結合片段，如Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段或F(V)片段。本發(fā)明的抗體 可以是鼠抗體或其同源物，或者是完整的人抗體。本發(fā)明的抗體也可以是人源化抗體、嵌合 抗體或單鏈抗體。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型和亞型的，如IgA(例如IgAl和IgA2)、 IgG(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ 型。
[0037] 在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在重鏈的一個或多個（例如2、3、4、5或6 個）特定位點處含有突變（例如缺失、置換或添加），使得該抗體的效應物功能（例如該抗 體結合Fc受體或補體因子的能力）發(fā)生改變，而不影響抗體的抗原結合能力。在另外一些 實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在作為糖基化位點的氨基酸殘基處含有突變，使得糖基化 位點消除。這種抗體可能具有臨床上有益的、降低的效應物功能或其它不希望的功能，而保 留其抗原結合親和力。糖基化位點的突變也可能有利于工藝發(fā)展（例如蛋白質(zhì)的表達和純 化）。在另外一些實施方案中，重鏈或輕鏈可能含有提高親和力或效能的突變。
[0038] 幾種融合#6和融合#7雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約保藏已在美國典型培養(yǎng)物保藏 中心（ATCC ;Ρ· 0· Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)。雜交瘤克隆 6. 1A8、6. 2B10、6. 3G9、 6. 8G6和6· 2Β1 于2001 年8 月 16 日保藏，保藏號分別是ATCC ΡΤΑ-3647、-3648、-3649、-3645 和-3646。雜交瘤克隆 6· 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5 和 7. 1C5 在 2001 年 12 月 5 日保藏，保 藏號分別是 ATCC PTA-3896、-3897、-3898、-3899 和-3900。見下文表 1。
[0039] 本發(fā)明的抗體可用于治療由ανβ6與配體（如LAP和纖連蛋白）結合介導的任何 臨床上不希望的病癥或疾?。ㄈ绱颂幩觯Ｓ捎诟叩挠H和力或親合力，