一種小麥粒重分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種小麥粒重分子標(biāo)記以及該標(biāo)記在分子育 種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物之一，隨著人口的增長(zhǎng)、耕地面積的減少以及糧食生 產(chǎn)成本的不斷提高，高產(chǎn)、超高產(chǎn)育種是我國(guó)小麥育種的永恒主題。小麥單位面積產(chǎn)量取決 于單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重，該三要素都是受多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán) 境影響。一般來說，粒重的遺傳力較其他兩者高，說明在協(xié)調(diào)產(chǎn)量三要素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步 提高粒重，是提高產(chǎn)量的有效途徑。
[0003] 傳統(tǒng)的育種主要依賴于植株的表現(xiàn)型選擇，但環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán) 境互作等多種因素會(huì)影響表型選擇效率。而分子標(biāo)記輔助選擇（MAS)不受環(huán)境和育種世代 的影響，可以進(jìn)行程序化早代選擇和預(yù)測(cè)。所以利用分子標(biāo)記尤其基因的功能標(biāo)記進(jìn)行關(guān) 鍵基因型的輔助選擇，可顯著提高目標(biāo)性狀的準(zhǔn)確性，大大縮短了小麥育種年限和提高育 種效率。
[0004] 小麥中已報(bào)道了多個(gè)與粒重有關(guān)的主效QTLs，主要位于1A，IBS，3A，4BS，5A， 6AS，7A，7B，7D上。但是這些QTLs存在某些不足之處：首先，大多數(shù)QTLs不是功能性標(biāo)記， 都沒有經(jīng)過育種過程進(jìn)行有效性的驗(yàn)證。而實(shí)用性分子標(biāo)記應(yīng)該可用于所有的育種材料的 檢測(cè)，而且應(yīng)該是建立在已經(jīng)被克隆的功能基因的序列基礎(chǔ)上開發(fā)的，需要建立標(biāo)記與性 狀的關(guān)系。其次，單一遺傳群體定位的QTL位點(diǎn)是一個(gè)很大的區(qū)域，可能包含多個(gè)數(shù)量性狀 基因，也有可能存在假陽(yáng)性的QTLs，降低了分子輔助選擇的實(shí)際效率。因此需要開發(fā)一種基 于基因序列的實(shí)用性功能標(biāo)記。
[0005] 由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，其基因組比較復(fù)雜，與粒重有關(guān)的功能基因鑒定的較少。 已克隆的功能基因主要位于2A，前者是從水稻中同源克隆的控制粒寬和粒重的主效基因 TaGW2,后者是與小麥粒重相關(guān)的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因 TaCWI。因此，尋求一種基于小麥粒重相 關(guān)基因序列的實(shí)用性功能標(biāo)記，將為利用分子手段選育高產(chǎn)小麥新品種提供支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種小麥粒重的分子標(biāo)記， 以輔助小麥高產(chǎn)分子育種。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種小麥粒重的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記位于小麥3DL染色體，與SSR 標(biāo)記Xwmc418緊密連鎖，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
[0009] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了所述的小麥粒重分子標(biāo)記在小麥育種中的應(yīng)用。 [0010] 本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，上述的應(yīng)用是利用其判斷植株是否含有增加千粒重效應(yīng) 的基因位點(diǎn)TaGW3-3D，具體步驟為：
[0011] 利用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)植株的葉片DNA，電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段以檢測(cè)是否為具有 較高千粒重的品種；
[0012] 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：具有$父尚千粒重的品種擴(kuò)增出如序列表中序列4所不的333bp的目 標(biāo)條帶，具有較低千粒重的品種擴(kuò)增出如序列表中序列5所示的328bp的目標(biāo)條帶。
[0013] 其中，上述應(yīng)用中所用到的其特異性引物為：
[0014] 上游引物序列：5' -CGTCCCAACCTCGCTCTT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0015] 下游引物序列：5' -ATCCTTCCTGCCATCACC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 3 所示）。
[0016] 本發(fā)明通過克隆了一個(gè)控制粒重主效基因的部分片段，并開發(fā)了一對(duì)基于這個(gè)特 定的基因序列的功能標(biāo)記。該位點(diǎn)是前人未曾報(bào)道過的存在主效基因的位點(diǎn)。由于該功能 標(biāo)記是基于這個(gè)特定的基因序列設(shè)計(jì)的，是與該基因共分離的，相對(duì)一般SSR分子標(biāo)記，有 助于提高育種選擇的目標(biāo)性和針對(duì)性大大提高了選擇的準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于小麥育種領(lǐng)域。 加上不受環(huán)境等其他外界因素的影響，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，節(jié)約了生產(chǎn)成本，加快 育種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0017] 圖1為利用特異性引物擴(kuò)增出的15個(gè)不同品種的小麥的電泳結(jié)果圖；該圖中最右 泳道為分子標(biāo)記物，1為矮抗58的擴(kuò)增條帶，2為臨優(yōu)8159的擴(kuò)增條帶，3為中麥1195的擴(kuò) 增條帶，4為寶麥8號(hào)的擴(kuò)增條帶，5為邯4564的擴(kuò)增條帶，6為中麥1196的擴(kuò)增條帶，7為 蘇麥3的擴(kuò)增條帶，8為內(nèi)麥8號(hào)的擴(kuò)增條帶，9為煙農(nóng)19的擴(kuò)增條帶，10為中優(yōu)989的擴(kuò) 增條帶，11為煙農(nóng)24的擴(kuò)增條帶，12為京411的擴(kuò)增條帶，13為紅芒春21的擴(kuò)增條帶，14 為豫麥867919的擴(kuò)增條帶，15為和尚麥的擴(kuò)增條帶；以及
[0018] 圖2為TaGW3_3D基因標(biāo)記在小麥3D染色體上的遺傳連鎖圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0020] 實(shí)施例1小麥粒重相關(guān)基因功能標(biāo)記的獲得
[0021] 在NCBI上搜索小麥的多個(gè)ESTs序列，對(duì)千粒重差異顯著的小麥品種進(jìn)行篩選，克 隆測(cè)序有差異的片段，得到序列SEQ ID NO. 1，具體操作參見常規(guī)的分子生物學(xué)操作步驟。 然后以該序列為模板，利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)-H對(duì)特異性引物：
[0022] 上游引物序列：5' -CGTCCCAACCTCGCTCTT-3'
[0023] 下游引物序列：5' -ATCCTTCCTGCCATCACC-3'
[0024] 實(shí)施例2小麥粒重相關(guān)基因功能標(biāo)記的檢測(cè)
[0025] 一、小麥籽粒千粒重的測(cè)定
[0026] 隨機(jī)取小麥的1000粒完整小麥籽粒，兩次重復(fù)，用千分之一的天平稱重，兩次平 均值記為最終的千粒重值。
[0027] 二、SDS-Tris飽和酚法抽提小麥葉片基因組DNA
[0028] (1)分別取矮抗58、臨優(yōu)8159、中麥1195、寶麥8號(hào)、邯4564、中麥1196、蘇麥3、內(nèi) 麥8號(hào)、煙農(nóng)、中優(yōu)989、煙農(nóng)、京411、紅芒春21、豫麥867919、和尚麥15個(gè)小麥品種的新鮮 幼嫩葉片2g，液氮研磨成細(xì)粉后置于2ml滅菌離心管中。
[0029] (2)每個(gè)樣品加入 I. 2ml DNA 提取緩沖液（200mM Tris-cl, ρΗ8· 0, 250mM NaCl, 25mM EDTA, pH8. 0, 0. 5% SDS, 2% β -ME 混合均勻，β -ME 臨用前新鮮加入）。
[0030] (3) 55°C水浴45min，期間間歇振蕩以充分提取。
[0031] (4)室溫下，12000rpm，lOmin。
[0032] (5)轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml滅菌離心管中，加入預(yù)冷的等體積Tris飽和酷/氯仿 異/戊醇（體積比為25 :24 :1)，于冰上顛倒混勻15min，期間間歇振蕩。
[0033] (6)室溫下，12000rpm，lOmin。
[0034] (7)轉(zhuǎn)移上清液至新的2ml滅菌離心管中，重復(fù)步驟（5)，（6)，以充分除去蛋白。
[0035] (8)轉(zhuǎn)移上清液至新的I. 5ml滅菌離心管中，加入0· 6倍異丙醇（300 μ 1)和1/10 倍體積（50 μ I) NaAc (ρΗ5. 2)，充分混合混勻后冰上靜置17min。
[0036] (9)出現(xiàn)白色絮狀 DNA 沉淀，4°C，lOOOOrpm，lOmin。
[0037] (10)棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇漂洗2遍，然后用無(wú)水乙醇漂洗1遍，室溫晾 干，加入100μl其中含2μll0mg/mlRNase酶的lXTE緩沖液（或雙蒸水）過夜溶解，10 倍稀釋備用。
[0038] (11)用1 %瓊脂糖檢測(cè)提取的小麥基因組DNA的質(zhì)量以及濃度。
[0039] 三、目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小麥粒重分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記位于小麥3DL染色體，與SSR標(biāo)記 Xwmc418緊密連鎖，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的小麥粒重分子標(biāo)記在小麥育種中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，利用其判斷植株是否含有增加千粒重效 應(yīng)的基因位點(diǎn)TaGW3-3D，具體步驟為： 利用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)植株的葉片DNA，電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段以檢測(cè)是否為具有較高 千粒重的品種； 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：具有較高千粒重的品種擴(kuò)增出如序列表中序列4所示的333bp的目標(biāo)條 帶，具有較低千粒重的品種擴(kuò)增出如序列表中序列5所示的328bp的目標(biāo)條帶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，其特異性引物為： 上游引物序列：5' -CGTCCCAACCTCGCTCTT-3' ； 下游引物序列：5' -ATCCTTCCTGCCATCACC-3'。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種小麥粒重分子標(biāo)記及其應(yīng)用，標(biāo)記位于小麥3DL染色體，與SSR標(biāo)記Xwmc418緊密連鎖，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。該位點(diǎn)是前人未曾報(bào)道過的存在主效基因的位點(diǎn)，由于該功能標(biāo)記是基于這個(gè)特定的基因序列設(shè)計(jì)的，是與該基因共分離的，相對(duì)一般SSR分子標(biāo)記，有助于提高育種選擇的目標(biāo)性和針對(duì)性，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于小麥育種領(lǐng)域。將該分子標(biāo)記用于小麥育種不受環(huán)境等其他外界因素的影響，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，節(jié)約了生產(chǎn)成本，加快育種進(jìn)程。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104805081
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510218332
【發(fā)明人】朱曉峰, 馬剛, 紹輝, 劉鵬, 常成, 張海萍, 馬傳喜, 司紅起
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日