與小麥千粒重相關的Indel分子標記及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及與小麥千粒重相關的 Indel分子標記及應用。
【背景技術】
[0002] 小麥是世界上最重要的糧食作物之一，隨著人口的增長，耕地面積的減少以及糧 食生產(chǎn)成本的不斷提高，高產(chǎn)、超高產(chǎn)育種成為我國小麥育種中迫切解決的問題。穗數(shù)、穗 粒數(shù)和千粒重是小麥產(chǎn)量構成的三要素，粒重是主基因和微效基因共同調(diào)控的數(shù)量性狀， 因而弄清參與調(diào)控粒重各種過程的基因?qū)Ω弋a(chǎn)小麥品種的育成具有重要意義。
[0003] 糖原合成酶激酶（GSKs)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSKs家族 在植物中扮演著重要的角色，現(xiàn)有證據(jù)表明，植物GSKs可能參與植物的非生物脅迫應答、 傷害應答以及油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導，調(diào)節(jié)花的發(fā)育等一系列生命活動進程。將小麥糖原合 成酶激酶TaGSKl轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株進行耐鹽性分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力比宿 主菌高。此外，以敏鹽的小麥成熟胚愈傷組織為材料，使用構建成功的TaGSKl雙元載體 pBI12-gskl分別采用農(nóng)桿菌介導和基因槍轟擊兩種方法成功進行了TaGSKl基因的小麥遺 傳轉(zhuǎn)化。從篩選結(jié)果可以看出，對照愈傷組織在〇. 5%NaCl中大多褐化甚至死亡，而轉(zhuǎn)基因 愈傷組織則生長旺盛（徐濤等，2003,小麥耐鹽突變體TaGSKl基因的分離和鑒定，河北師 范學院碩士畢業(yè)論文）。因此，該基因家族成員可能具有影響小麥千粒重，提高小麥產(chǎn)量的 潛在價值。目前，尚未有關于該基因影響小麥千粒重的研究報道。
[0004] 隨著現(xiàn)代分子生物學技術的迅速發(fā)展，分子標記輔助選擇（MAS)被廣泛應用于分 子育種中，由于其不受環(huán)境和育種世代的影響，可以進行早代選擇和預測，大大縮短了小麥 育種年限。功能標記是一類基于基因特定序列開發(fā)的標記，與目標基因共分離，大大提高了 選擇的準確性。因此功能標記的開發(fā)為小麥分子輔助標記育種提供了依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供與小麥千粒重相關的Indel分子標記及應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的與小麥千粒重相關的Indel分子標記，所述 Indel分子標記與小麥TaGSKl基因共分離，用于擴增所述Indel分子標記的引物對為：
[0007] 上游引物F:5' -CGCAAATCAAAGCTCACC-3'（SeqIDNo. 1)
[0008] 下游引物R:5' -CCATCCTACAAAGGCACA-3'（SeqIDNo. 2)
[0009] 所述引物對擴增的與小麥較高千粒重相關的Indel分子標記特征條帶為624bp， 其核苷酸序列如SeqIDNo. 3所示；所述引物對擴增的與小麥較低千粒重相關的Indel分 子標記特征條帶為609bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 4所示。
[0010]根據(jù)NCBI上公布的小麥TaGSKl基因的序列（Genbank:AF525086)，利用Primer Premier5. 0軟件設計了一對在豫麥8679及和尚麥兩個品種間具有多態(tài)性的Indel引物， 并在千粒重差異顯著的小麥品種間進行篩選，進一步在重組自交系群體（RILs)和自然群 體中分析其對表型的作用，獲得了一對有特異性差異的引物。
[0011] 本發(fā)明還提供所述Indel分子標記在篩選較高千粒重的小麥種質(zhì)資源中的應用， 包括如下步驟：
[0012] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0013] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，進行PCR擴增反應；
[0014] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物，如果能夠擴增出如SeqIDNo. 3所示核苷酸序列的特征條 帶，則待測植株為具有較高千粒重的小麥資源。
[0015] PCR擴增體系以 10μ1 計為：模板DNA100ng，10yM引物F和R各 0·2μ1，2·5πιΜ (1犯130.8 4 1，51]/^1了39〇嫩聚合酶0.12 4 1，含2511111%2+的10\?0?反應緩沖液1.(^1， ddH20 補足至 10μ1。
[0016] PCR擴增程序為：94°C5分鐘；94°C50秒，54°C50秒，72°C3分鐘，36個循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0017] 優(yōu)選地，步驟3)中采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，然后銀染 顯色。
[0018] 本發(fā)明還提供用于鑒定較高千粒重小麥種質(zhì)資源的PCR檢測試劑盒，所述檢測試 劑盒包含用于擴增所述與小麥千粒重相關的Indel分子標記的引物F和R。
[0019] 本發(fā)明進一步提供與小麥千粒重相關的Indel分子標記在小麥分子標記輔助育 種中的應用。
[0020] 本發(fā)明在前人研究的基礎上，以NCBI上公布的小麥TaGSKl基因序列為模板 設計引物，根據(jù)不同千粒重小麥品種豫麥8679及和尚麥之間的序列差異開發(fā)了與小 麥千粒重相關的Indel分子標記，該標記不同的等位變異能夠解釋千粒重表型變異的 7. 9% -11. 8%，其中，擴增產(chǎn)物大小為624bp的條帶對千粒重的增加具有增效作用，擴增產(chǎn) 物大小為609bp的條帶對千粒重的降低具有增效作用。該分子標記的開發(fā)為高產(chǎn)小麥分子 輔助育種提供了一條可行的途徑。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例2中Indel分子標記在不同小麥品種中的等位類型分析；其 中，泳道1-23分別為和尚麥、白火麥、小玉花、藁優(yōu)9415、橫優(yōu)18、寶麥8、鄭麥366、西農(nóng) 979、豫麥8679、眾麥1號、新19、晉麥41、京冬10、御國、河農(nóng)638、白芒紅、鄭麥98、M013、 M016、白皮224、石新618、萬縣白麥子、邯5030。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實 施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&RussellDW， Molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0023] 以下實施例中測序由生工生物工程上海（股份）有限公司完成。
[0024] 實施例1小麥TaGSKl基因功能標記的開發(fā)
[0025] 根據(jù)NCBI上公布的小麥TaGSKl基因的序列（Genbank:AF525086)，利用Primer Premier5. 0軟件設計了一對在豫麥8679及和尚麥兩個品種間具有多態(tài)性的Indel引物， 并在千粒重差異顯著的小麥品種間進行篩選，進一步在重組自交系群體（RILs)和自然群 體中分析其對表型的作用，獲得了一對有特異性差異的引物，引物序列如下：
[0026] 上游引物F:5' -CGCAAATCAAAGCTCACC-3'（SeqIDNo. 1)
[0027] 下游引物R:5' -CCATCCTACAAAGGCACA-3'（SeqIDNo. 2)
[0028] 實施例2小麥TaGSKl基因不同的基因型與粒重的相關性
[0029] 1、小麥籽粒千粒重的測定