控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-7A及其CAPS標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-7A及其CAI^S標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[000引小麥（TriticumaestivumL.)是世界上總產(chǎn)量位居第二的糧食作物，提高小麥產(chǎn) 量對國家糧食安全W及增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益都具有非常重要的戰(zhàn)略意義。千粒重是小麥產(chǎn)量 構(gòu)成S要素之一，具有較高的遺傳力佑iura和Saulescu，1996)，因此，小麥的育種過程在 很大程度上就是不斷提高粒重。然而，粒重的分子調(diào)控機(jī)理仍不清晰。
[0003] 總結(jié)前人報(bào)道，千粒重屬于數(shù)量性狀，受主效加微效多基因共同控制。目前，粒重 相關(guān)WL位點(diǎn)報(bào)道較多，廣泛分布在小麥21條染色體上（Araki等，1999 ;化址等，1999 ; Kato等，2000;Groos等，2003;Huang等，2003 ;Brese曲ello等，2006;Huang等，2006;Sun 等，2009;Marta等，2013;Simmonds等，2014)。其中主效WL位點(diǎn)位于 1A、3A、4B、5A、6A7A、 7B、7D(Campbell等，2003;Huang等，2003;Vasilis等，2010)。小麥中，調(diào)控粒重的部分功 能基因已經(jīng)被克隆。如Su等（2011)同源克隆了水稻中控制粒寬和粒重的主效基因TaGW2。 Ma等（2012)克隆了與小麥粒重相關(guān)的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因化CWI。綜合上述可知，千粒重的 遺傳機(jī)理較復(fù)雜，不同材料，遺傳背景不同，控制粒重的主效基因也有所差異。鑒定出更多 粒重相關(guān)基因，不僅有利于加快多基因聚合育種的進(jìn)程，同時(shí)有助于進(jìn)一步闡明產(chǎn)量形成 的分子機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供控制小麥千粒重的主效基因化TGW-7A及其CAPS 標(biāo)記方法。
[0005] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-7A，品種為京411，其序列如序列表。
[0007] 控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-7A，品種為紅芒春21，其序列如序列表。
[000引小麥千粒重的主效基因化TGW-7A的CAI^S標(biāo)記方法，步驟包括；
[0009] (1)小麥基因組DNA提?。?br>[0010] (2)對基因組DNA用限制性內(nèi)切酶化elll進(jìn)行酶切，對得到的酶切片段 用KlenowRra卵ent(3 ' - 5 'exo-)(肥B)和dATP在 37°C下進(jìn)行 3 '端加A處 理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，PCR擴(kuò) 增引物；FAATGATACGGCGACCACCGA，RCAAGCAGAAGACGGCATACG，文庫質(zhì)檢合格后用 Illumin址iSeqTM2500 進(jìn)行測序；
[0011] 做設(shè)計(jì)引物：
[0012] TaTGW-7A基因全長引物Q29F;GCAAGCCCGTCAACATGTACTAC， Q29R；AATTTCTGGACTTATGGGGAGCC,Q35F；TCTACCACGCAGCAAATCGCC；Q35R； CTGGACTTATGGGGAGCCTCT;Q37F;GCCCGTCAACATGTACTACTC，Q37R;GGTAGAGCTTCTCATAGCTGC， 拼接引物上游 29PF;AAGGTTTGGGGAGTAAAGTTTT，29PR;AGTCAGAATTGTGCCTAAGTGC; 下游 31PF;GAGGGGTAGGATGAAGGAAGA，31PR;ATTTCTGGACTTATGGGGAGC，mRNA序 列SRF;ACCCATCCCTCCATCCGTCG，SRR;ATCCGCCCACCTGGTAAAGC，酶切引物MQF; GCTACATACACGCACCAACCC,MQR；GACGAGAAGATAGGCGGACAG
[001引引物Q29、Q35、Q37用于擴(kuò)增化TGW-7A基因全長，PCR產(chǎn)物直接測序；引物29P和 31P分別擴(kuò)增TaTGW-7A基因上游和下游，PCR產(chǎn)物克隆測序，并拼接基因全長；引物SR用于 擴(kuò)增mRNA，產(chǎn)物克隆測序；引物MQ用于CAPS標(biāo)記開發(fā)，用BsmAI(肥B)在55°C下酶切化， 產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上分離，染色后在紫外光下觀察記帶。
[0014]進(jìn)一步地，（1)小麥基因組DNA提取的步驟包括：
[00巧]1)將小麥單巧粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-肥1(PH= 8. 5)， 0. 1M化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒溫下裂解45min，其間多次震蕩；
[0016] 2)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0017] 3)取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)至兩相不很 快分層；
[00化]4)在4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0019] 5)取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)數(shù)次；
[0020] 6)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0021] 7)取上清液加入等體積的異丙醇于-20°c冰箱靜置30min;
[002引 8)在4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0023] 9)用70%的己醇洗漆兩次；
[0024] 10)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0025] 11)沉淀自然風(fēng)干，4°C存，備用。
[0026] 進(jìn)一步地，（2)選用擬南芥作為對照進(jìn)行測序。
[0027]進(jìn)一步地，（3)CAI^S標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系；1yL2. 5mMdNTP, 0. 25yLlOuM引物， lyL10 禮aTapBuffer，0. 5UTaKaRaLaTap，100ngDNA模板，用雙蒸饋水補(bǔ)齊到lOuL。
[0028] 進(jìn)一步地，（3)CAI^S標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序；95°C變性5min;95°C變性45s;55°C退火 50s;72°C延伸 50s，72°C延伸lOmin。35 個(gè)循環(huán)。
[0029] 進(jìn)一步地，瓊脂糖凝膠電泳；1.5-2%瓊脂糖凝膠，緩沖體系為IXTAE溶液，在 100V恒壓下，電泳50min，漠化己錠巧B)染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存。聚丙締酷胺凝 膠電泳；6%的變性聚丙締酷胺凝膠，緩沖體系為1XTBE溶液，電壓1200V，電流55A，功率 55W，電泳 9〇-110min。
[0030] 本發(fā)明的主要原理是：
[0031](一）簡化基因組測序技術(shù)（1)基于生物信息學(xué)進(jìn)行方案系統(tǒng)設(shè)計(jì)利用生物信息 學(xué)方法，對小麥的參考基因組（或已知BAC序列）進(jìn)行系統(tǒng)分析，根據(jù)基因組的GC含量、 重復(fù)序列情況和基因特點(diǎn)等信息，設(shè)計(jì)標(biāo)記開發(fā)方案，W保證其分子標(biāo)記開發(fā)的密度、均勻 性、效率和關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。（2)SLAF-seq文庫構(gòu)建及測序選擇小麥作為研究材料，構(gòu)建 SLAF-seq文庫，根據(jù)前期信息學(xué)方法設(shè)計(jì)的方案，篩選特異性長度片段，應(yīng)用高通量測序技 術(shù)獲得海量標(biāo)簽序列。（3)SLAF-seq數(shù)據(jù)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估， 獲得測序深度和質(zhì)量滿足要求的SLAF片段，來代表小麥基因組信息。本發(fā)明利用SLAF-seq 技術(shù)鑒定了小麥粒重相關(guān)基因的熱點(diǎn)區(qū)域。
[003引（二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，反應(yīng)步驟；①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至 93°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈， W便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）；模板DNA經(jīng)加 熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；⑨引物的 延伸；DNA模板--引物結(jié)合物在化qDNA聚合酶的作用下，WdNTP為反應(yīng)原料，祀序列為模 板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈， 經(jīng)過30個(gè)循環(huán)左右，目的片段得到大量擴(kuò)增。本發(fā)明采用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)引 物，對粒重相關(guān)候選基因進(jìn)行克隆。
[0033] 本發(fā)明的有益效果；
[0034] 利用簡化基因組測序技術(shù)，鑒定出與小麥粒重緊密關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域，并克隆了該 區(qū)域的候選基因，經(jīng)人工群體和自然群體聯(lián)合驗(yàn)證，該基因是一種對粒重影響顯著的新的 主效基因，并開發(fā)了功能標(biāo)記（TaTGW-7A)。經(jīng)生物信息學(xué)分析，該基因?yàn)槌霸?3-甘油磯酸 合酶（IGP巧，是生長素色氨酸合成途徑和非色氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，直接影響生長素的 合成，從而進(jìn)一步影響粒重的形成。本發(fā)明為小麥高產(chǎn)育種提供了新的基因資源，同時(shí)進(jìn)一 步闡明了產(chǎn)量形成的分子機(jī)制。
【附圖說明】
[0035] 圖1為京411和紅芒春21觀察記帶示意圖；（1;京411 ;2;紅芒春21;a;酶切之 前；b;酶切之后）
[0036] 圖2為化TGW-7A的遺傳定位的示意圖；（紅線、綠線、藍(lán)線分別代表2011、2012、 2014年粒重?cái)?shù)據(jù)，LOD值取3. 0)
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面根據(jù)附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[00測（一）小麥基因組DNA提取
[0039] 用于DNA提取的試驗(yàn)材料為親本京411和紅芒春21、兩個(gè)高低混池、重組自交系 RIL(京411/紅芒春21)Fg群體各家系、256份種質(zhì)資源材料。具體方法為；
[0040] 1、將小麥單巧粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-HCl(PH= 8. 5)， 0. 1M化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒溫下裂解45min，其間多次震蕩。
[0041] 2、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0042] 3、取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)至兩相不很 快分層。
[0043] 4、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0044] 5、取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)數(shù)次。
[0045] 6、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0046] 7、取上清液加入等體積的異丙醇于-20°C冰箱靜置30min。
[0047] 8、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0048]9、用70%的己醇洗漆兩次。
[0049] 10、在 4°C12000;rpm條件下，離屯、lOmin。
[0050] 11、沉淀自然風(fēng)干，4°C存，備用。
[0化1](二）簡化基因組測序和酶切方案設(shè)計(jì)
[0052] 1、參考基因組確定：根據(jù)小麥的基因組大小W及GC含量等信息，最終選取小麥A 基因組作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測。
[0053] 2、酶切方案確定；利用酶切預(yù)測軟件對參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測，選擇最適酶切 方案。
[0054] 3、實(shí)驗(yàn)流程；根據(jù)選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組DNA用限制 性內(nèi)切酶化elll(New化glandBiol油S，肥B)，進(jìn)行酶切。對得到的酶切片段（SLAF標(biāo)簽