控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A及其CAPS標記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A及其CAI^S標記方法，屬于作物 遺傳育種的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[000引小麥（TriticumaestivumL.)是世界上總產(chǎn)量位居第二的糧食作物，提高小麥產(chǎn) 量對國家糧食安全W及增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益都具有非常重要的戰(zhàn)略意義。千粒重是小麥產(chǎn)量 構(gòu)成S要素之一，具有較高的遺傳力佑iura和Saulescu，1996)，因此，小麥的育種過程在 很大程度上就是不斷提高粒重。然而，粒重的分子調(diào)控機理仍不清晰。
[0003] 總結(jié)前人報道，千粒重屬于數(shù)量性狀，受主效加微效多基因共同控制。目前，粒重 相關(guān)WL位點報道較多，廣泛分布在小麥21條染色體上（Araki等，1999 ;化址等，1999 ; Kato等，2000;Groos等，2003;Huang等，2003 ;Brese曲ello等，2006;Huang等，2006;Sun 等，2009;Marta等，2013;Simmonds等，2014)。其中主效WL位點位于 1A、2A、3A、4B、5A、 6A7A、7B、7D(Campbell等，2003;Huang等，2003;Vasilis等，2010)。小麥中，調(diào)控粒重的 部分功能基因已經(jīng)被克隆。如Su等（2011)同源克隆了水稻中控制粒寬和粒重的主效基因 TaGW2-6A。Ma等（2012)克隆了小麥2A染色體上與粒重相關(guān)的細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因化CWI。 綜合上述可知，千粒重的遺傳機理較復(fù)雜，不同材料，遺傳背景不同，控制粒重的主效基因 也有所差異。鑒定出更多粒重相關(guān)基因，不僅有利于加快多基因聚合育種的進程，同時有助 于進一步闡明產(chǎn)量形成的分子機制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A及其 CAP'S標記方法。
[0005] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0006] 控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A，品種為京411，其序列如序列表。
[0007] 控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A，品種為紅芒春21，其序列如序列表。
[000引控制小麥千粒重的主效基因TaTGW-2A的CAI^S標記方法，步驟包括；
[0009] (1)小麥基因組DNA提??；
[0010] (2)對基因組DNA用限制性內(nèi)切酶化elll進行酶切，對得到的酶切片段 用KlenowRragment(3 ' - 5 'exo-)(肥B)和dATP在 37°C下進行 3 '端加A處理、 連接Dual-index測序接頭、PCR擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格 后用Illumin址iSeqTM2500 進行測序，PCR擴增引物；F;AATGATACGGCGACCACCGA，R; CAAGCAGAAGACGGCATACG)；
[0011] 做設(shè)計引物
[0012] TaTGW-2A基因全長克隆拼接引物；上游G2-27F;ATCTACAAGTGGTTCTCTCCTCTG， G2-27R;GCTACATCTATTTGGATTCTCATTC;下游G2-19F;GGTCGAGGAGGTCAACAAGCA，G2-19R; AAGCGTTCCAGTTCATTTCAG;mRNA克隆測序引物；2AR-1F;CTCTGTCTGATCCCTCTCGC， 2AR-1R；CCAGGCACTGTTCCAAAGTA；2AR-5F；TCTCCTCTGTCTGATCCCTCT,2AR-5R； ATGTAAAACATGACGGCTGTA，酶切CAI^S標記開發(fā)引物；B2A-1F;TTGGAATAAACTGGTCTGGAAAA， B2A-1R；AAAACTGCGACACTTACTATGGA；
[0013] 引物G2-27、G2-19用于擴增化TGW-2A基因上游和下游，PCR產(chǎn)物克隆測序，并拼 接基因全長；引物2AR-1、2AR-5用于擴增mRNA全長，PCR產(chǎn)物克隆測序；引物B2A用于CAPS 標記開發(fā)，用Msel在37°C下酶切化，產(chǎn)物在2 %的瓊脂糖凝膠電泳上分離，染色后在紫外光 下觀察記帶。
[0014] 進一步地，（1)小麥基因組DNA提取的步驟；
[00巧]1)將小麥單巧粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-HCl(PH= 8. 5)， 0.IM化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒溫下裂解45min，其間多次震蕩； [001引。在4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0017] 3)取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)至兩相不很 快分層；
[001引 4)在4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0019] 5)取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)數(shù)次；
[0020] 6)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0021] 7)取上清液加入等體積的異丙醇于-20°c冰箱靜置30min;
[0022] 8)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[0023] 9)用70 %的己醇洗漆兩次；
[0024] 10)在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin;
[00巧]11)沉淀自然風干，4°C存，備用。
[0026] 進一步地，（2)選用擬南芥作為對照進行測序。
[0027]進一步地，（3)CAI^S標記開發(fā)的PCR反應(yīng)體系；1yL2. 5mMdNTP, 0. 25yL10yM 引物，luL10 禮aTapBuffer，0. 5UTaKaRaLaTap，100ngDNA模板，用雙蒸饋水補齊到 10yL。
[0028] 進一步地，（3)CAI^S標記開發(fā)的PCR反應(yīng)程序；95°C變性5min;95°C變性45s;55°C 退火50s;72°C延伸50s，35個循環(huán)，72°C延伸lOmin。
[0029] 進一步地，（3)瓊脂糖凝膠電泳；1.5-2%瓊脂糖凝膠，緩沖體系為IXTAE溶液， 在100V恒壓下，電泳50min，漠化己錠巧B)染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存，聚丙締酷胺凝 膠電泳；6%的變性聚丙締酷胺凝膠，緩沖體系為1XTBE溶液，電壓1200V，電流55A，功率 55W，電泳 90-110min。
[0030] 本發(fā)明的主要原理是；
[0031](一）簡化基因組測序技術(shù)（1)基于生物信息學(xué)進行方案系統(tǒng)設(shè)計利用生物信息 學(xué)方法，對小麥的參考基因組（或已知BAC序列）進行系統(tǒng)分析，根據(jù)基因組的GC含量、 重復(fù)序列情況和基因特點等信息，設(shè)計標記開發(fā)方案，W保證其分子標記開發(fā)的密度、均勻 性、效率和關(guān)聯(lián)分析的準確性。（2)SLAF-seq文庫構(gòu)建及測序選擇小麥作為研究材料，構(gòu)建 SLAF-seq文庫，根據(jù)前期信息學(xué)方法設(shè)計的方案，篩選特異性長度片段，應(yīng)用高通量測序技 術(shù)獲得海量標簽序列。（3)SLAF-seq數(shù)據(jù)分析對數(shù)據(jù)進行基本處理，對測序數(shù)據(jù)進行評估， 獲得測序深度和質(zhì)量滿足要求的SLAF片段，來代表小麥基因組信息。本發(fā)明利用SLAF-seq技術(shù)鑒定了小麥粒重相關(guān)基因的熱點區(qū)域。
[00礎(chǔ)（二）聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)，反應(yīng)步驟；①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至 93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈， W便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）；模板DNA經(jīng)加 熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；⑨引物的 延伸；DNA模板--引物結(jié)合物在化qDNA聚合酶的作用下，WdNTP為反應(yīng)原料，祀序列為模 板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈， 經(jīng)過30個循環(huán)左右，目的片段得到大量擴增。本發(fā)明采用PrimerPremier5軟件設(shè)計引 物，對粒重相關(guān)候選基因進行克隆。
[0033] 本發(fā)明的有益效果；
[0034] 本發(fā)明利用簡化基因組測序技術(shù)，鑒定出與小麥粒重緊密關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域，并克 隆了該區(qū)域的候選基因，經(jīng)人工群體和自然群體聯(lián)合驗證，該基因是一種對粒重影響顯著 的新的主效基因，并開發(fā)了較SNP標記更易于檢測的CAI^S標記（TaTGW-2A)。本發(fā)明為小麥 高產(chǎn)育種提供了新的基因資源，同時進一步闡明了產(chǎn)量形成的分子機制。
【附圖說明】
[0035] 圖1為TaTGW-2A基因功能預(yù)測示意圖；（黃色氨基酸代表配體結(jié)合位點。3OTE_ D;釀酒酵母；gi1541040813 ;豬咖蟲；gi1429328500 ;己貝西蟲；gi1403340193 ;尖毛蟲屬； 1WC9_A;小家鼠；gi1190580260;絲盤蟲；gi1239876112 ;海洋派琴蟲；gi174882182 ;約氏 追原蟲；gi1146184553 ;嗜熱四膜蟲；Query;TaTGW-2A)
[003引 圖2為京411和紅芒春21觀察記帶的示意圖；（1、2;京411 ;3、4;紅芒春21;a;酶 切之前；b;酶切之后）
[0037] 圖3為TaTGW-2A的遺傳定位的示意圖。（TaTGW-2A與Xgwml22和Xgwm95兩側(cè)標 記緊密連鎖，L0D值取3. 0)
【具體實施方式】
[0038] 下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0039](一）小麥基因組DNA提取
[0040] 用于DNA提取的試驗材料為親本京411和紅芒春21、兩個高低混池、重組自交系 RIL(京411/紅芒春21)Fg群體各家系、262份種質(zhì)資源材料。具體方法為：
[00川 1、將小麥單保粒磨碎，取0.Ig加入0. 7血SDS提取液（0. 1MTris-肥1(PH= 8. 5)， 0. 1M化C1，0. 05M邸TA(PH= 8. 0) ,2%SD巧在60°C恒溫下裂解45min，其間多次震蕩。
[0042] 2、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0043] 3、取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)至兩相不很 快分層。
[0044] 4、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0045] 5、取上清液加入等體積的酪；氯仿；異戊醇（25:24:1)上下顛倒旋轉(zhuǎn)數(shù)次。
[0046] 6、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0047] 7、取上清液加入等體積的異丙醇于-20°C冰箱靜置30min。
[0048] 8、在 4°C12000巧m條件下，離屯、lOmin。
[0049]9、用70 %的己醇洗漆兩次。
[0050] 10、在 4°C12000;rpm條件下，離屯、lOmin。
[0051] 11、沉淀自然風干，4°C存，備用。
[0052](二）簡化基因組測序和酶切方案設(shè)計
[0053] 1、參考基因組確定：根據(jù)小麥的基因組大小W及GC含量等信息，最終選取小麥A 基因組作為參考基因組進行酶切預(yù)測。
[0054] 2、酶切方案確定；利用酶切預(yù)測軟件對參考基因組進行酶切預(yù)測，選擇最適酶切 方案。
[00巧]3、實驗流程；根據(jù)選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組DNA用限 制性內(nèi)切酶化eIII(New化glandBiol油S，肥B)，進行酶切。對得到的酶切片段（SLAF 標簽）用KlenowRragment(3 ' - 5 'exo-)(肥B)和dATP在 37°C下進行 3 '端加A 處理、連接Dual-ind