E3泛素連接酶基因OsPIW調(diào)控水稻根的功能與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體設(shè)及一個(gè)E3泛素連接酶基因OsPIW在 調(diào)控水稻根生長(zhǎng)發(fā)育中的功能及應(yīng)用。本發(fā)明所述的E3泛素連接酶基因OsPIW屬于水稻 RING-finger肥家族蛋白基因，我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)該基因在水稻根發(fā)育中的功能進(jìn) 行了分析，并提出其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的根是位于±壤表面W下并能對(duì)周?chē)h(huán)境因子變化做出快速應(yīng)答的最重要 器官。除此之外，根的正常生長(zhǎng)與植物地上部分的生物量和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性息息相關(guān)。對(duì) 水稻根發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究有助于探究根對(duì)水稻產(chǎn)量、礦質(zhì)元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收W及生物 和非生物脅迫中的作用。
[0003] 雙子葉模式植物擬南芥根系是由主根（PrimaryRoot/PR)及其側(cè)根（Lateral Root/LR)組成的直根系。而作為全球最重要的糧食作物水稻，其根系為須根系，其組成除 了主根及其產(chǎn)生的側(cè)根外，還具有在其一生中占有重要地位且發(fā)揮主要生物學(xué)功能的的 冠狀根（化ownRoot/CR)(也叫不定根）及其側(cè)根。到目前為止，水稻中已經(jīng)鑒定并分離 了一些調(diào)控冠根發(fā)育的基因，該些基因功能的研究對(duì)于我們進(jìn)一步了解水稻根系的組成、 發(fā)育及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等方面起到了十分重要的作用。Q皿是水稻中最早報(bào)道在根的 不活動(dòng)中屯、特異表達(dá)的WUSOlEktypehomeobox類(lèi)基因（在擬南芥中同源基因是W0X5)， 其超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中沒(méi)有冠根的形成（NorikoKamiyaetal.,Isolationand characterizationofariceWUSCHEL-typehomeoboxgenethatisspecifically expressedinthecentralcellsofaquiescentcenterintherootapical meristem.PlantJournal. 2003, 35, 429-441)。CI?L1在冠根起始部位合成，生長(zhǎng)素通過(guò)降 解AUXIN/IND0LE-3-ACETICACID蛋白從而誘導(dǎo)其表達(dá)，crll突變體表現(xiàn)為冠根缺失，根的 向重力性雙損（Inukaietal. ,Crownrootlessl.WhichIsEssentialforCrownRoot Formationin民ice.IsaTargetofanAUXINRESPONSEFACTO民inAuxinSignaling. PlantCell, 2005, 17:1387 - 1396)。C化4/OsGNOMl通過(guò)介導(dǎo)PIN家族蛋白的運(yùn)輸來(lái)調(diào) 控水稻冠根的發(fā)育，其突變體幾乎沒(méi)有冠根的形成并且對(duì)重力的敏感性降低（LiuSet al.，AdventitiousrootformationinricerequiresOsGNOMlandismediatedby 化eOsPINsfamily.CellResearch, 2009, 19:1110-9)。水稻W(wǎng)USOTE^relatedHomeobox geneWOXll通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因0sRR2影響冠根的發(fā)育（Zhaoetal.，化e WUSCHEL-relatedhomeoboxgeneWOXllisrequiredtoactivateshoot-bornecrown rootdevelopmentinrice.PlantCell,2009,21:736-48)〇AP2/ERF(APETALA2/ E^5dene-ResponsiveFactor)家族轉(zhuǎn)錄因子家族中C化 5(CROWNROOTLESS5)通過(guò) 調(diào)控細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因OsRRl影響水稻冠根的發(fā)育，其突變體中冠根的起始受到影 響，從而導(dǎo)致植株中冠根的數(shù)目變少化itomietaLfllieauxinresponsiveAP2/ERF transcriptionfactorCROWN民00TLESS5isinvolvedincrownrootinitiationin ricethroughtheinductionofOs民民1，atype-Aresponseregulatorofcytokinin si即aling.PlantJournal, 2011, 67:472-84)。從W上的研究結(jié)果來(lái)看，水稻根的發(fā)育與植 物激素生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)。
[0004] 植物在生長(zhǎng)過(guò)程中不但要按照正常的時(shí)序進(jìn)行分化發(fā)育，而且還要適應(yīng)不同 的環(huán)境條件，該就需要一個(gè)精確的調(diào)節(jié)機(jī)制及時(shí)合成相關(guān)的功能蛋白，同時(shí)也需要一定 的機(jī)制及時(shí)清除已完成使命的蛋白。因此，蛋白質(zhì)的降解及產(chǎn)生與其翻譯后加工過(guò)程 一樣，對(duì)植物器官的生長(zhǎng)發(fā)育起著非常重要的調(diào)節(jié)作用化ellmannandEstelle,Plant development:regulationbyproteindegradation.Science, 2002, 297:793-797)。 泛 素（ubiquitin)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的小蛋白，由76個(gè)氨基酸組成，在酵母及 動(dòng)、植物等真核生物中高度保守化ershkoandCiechanover,Theubiquitinsystem. AnnualreviewofbiochemistiT, 1998,67:425-479)，它的主要功能是標(biāo)記細(xì)胞中需要 分解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解。泛素/26S蛋白酶體途徑〇Jbiquitin/26Sproteasome system,UP巧是目前研究較多的植物蛋白高效降解系統(tǒng)中的一種機(jī)制，也是真核生物中 最精細(xì)的調(diào)控體系之一，主要負(fù)責(zé)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白的選擇性降解。植物中很多重要途徑 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白都受到泛素化修飾。該系統(tǒng)廣泛地參與植物激素信號(hào)、光形態(tài)建成、植 物衰老、自交不親和反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、花的發(fā)育、生物鐘節(jié)律和非生物脅迫響應(yīng)等功 能（ChenandHellmann,PlantE3ligases:flexibleenzymesinasessileworld. MolecularPlant, 2013, 6:1388-404)。泛素一蛋白酶體系統(tǒng)由泛素激活酶巧1)、泛素結(jié)合 酶巧2)、泛素連接酶巧3)和26S蛋白酶體組成。植物中的E3泛素連接酶根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的 不同可分為四大類(lèi)型：肥CT結(jié)構(gòu)域家族、RING-finger結(jié)構(gòu)域家族、U-box結(jié)構(gòu)域家族和 邸Ls(cullin-RINGLigases)家族。肥CT、RING、U-box結(jié)構(gòu)域家族一般為單亞基E3; 邸Ls家族為多亞基E3,包括APC、BTB、孤B和SCF等4種多亞基復(fù)合體。RING-finger家族 的E3發(fā)現(xiàn)較晚，數(shù)量龐大且功能復(fù)雜，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。其在結(jié)構(gòu)上和U-box結(jié)構(gòu)域 比較相似，U-box通過(guò)鹽橋、氨鍵或鋒離子馨合作用來(lái)轉(zhuǎn)移泛素，而RING結(jié)構(gòu)域家族均包含 相似的E2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異的底物結(jié)合部分，作為橋梁將活化的泛素從E2直接轉(zhuǎn)移到祀 蛋白，其本身并不與泛素發(fā)生作用（Joazeiroetal.,RINGfingerproteins:mediators ofubiquitinligaseactivity.Cell, 2000)。已經(jīng)報(bào)道水稻基因組中有 426 個(gè)RING fingerE3泛素連接酶，但是大多數(shù)的生物學(xué)功能還不是十分清楚。目前報(bào)道的E3泛素 連接酶主要參與水稻的非生物脅迫（如抗旱、抗病反應(yīng)），而在調(diào)控水稻根發(fā)育方面的研 究卻很少。最近報(bào)道了水稻中一個(gè)RING-肥膜固定的泛素連接酶化5,它可W與泛素結(jié) 合酶化UBC化互作。進(jìn)一步研究表明EL5在根原基起始后對(duì)維持分生區(qū)細(xì)胞活力起著重 要作用。EL5是一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可能被鋒指結(jié)構(gòu)域通過(guò)不依賴(lài)蛋白酶體的方式降 角軍(Takaietal. ,EL5,ariceN-acetylchitooligosaccharideelicitor-responsive RING-H2fingerprotein,isaubiquitinligasewhichfunctionsinvitroin co-operationwithanelicitor-responsiveubiquitin-conjugatingenzyme,OsUBCSb. PlantJournal, 2002,30:447-455.；Koiwaietal. ,RING-H2typeubiquitinligase ELSisinvolvedinrootdevelopmentthroughthemaintenanceofcellviability inrice.PlantJournal, 2007, 51:92-104.；Mochizukietal. ,UbiquitinligaseELS maintainstheviabilityofrootmeristemsbyinfluencingcytokinin-mediated nitrogeneffectsinrice.JournalofExperimentalBotany, 2014, 65:2307-2318)。
[0005] 綜上所述，水稻根的發(fā)育是受多種基因和植物激素的調(diào)控，而RINGfingerE3泛素 連接酶在調(diào)控水稻根發(fā)育中的作用機(jī)制并不是十分的清楚。
[0006] 本發(fā)明從水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到多個(gè)RINGfinger類(lèi)E3泛素連接酶基因，利用生物 信息學(xué)和qRT-PCR的方法分析了該些基因在水稻根發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。分離并克隆出 一個(gè)在根中表達(dá)量較高的RINGfinger類(lèi)E3泛素連接酶基因，命名為化PIW。通過(guò)轉(zhuǎn)基因 的方法，我們發(fā)現(xiàn)該基因被抑制表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因水稻植株主根長(zhǎng)度變短、冠根數(shù)減少。細(xì)胞 學(xué)研究表明該基因被抑制后，水稻根尖分生區(qū)變小，其細(xì)胞有絲分裂的頻率降低；另外冠根 的起始也滯后。該些結(jié)果表明該基因可能通過(guò)影響根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂頻率影響分生區(qū)的 大小，最終導(dǎo)致水稻根的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的是鑒定了一個(gè)參與調(diào)控水稻冠根發(fā)育的RINGfing