小鼠nrdp1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)的降解主要通過兩種途徑:溶酶體降解途徑和泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途 徑。溶酶體降解途徑是一個非選擇的蛋白質(zhì)降解途徑，主要降解通過攝粒作用或胞飲作用 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源蛋白質(zhì);而泛素介導(dǎo)的途徑是一個受到嚴(yán)格的時空調(diào)控的特異性蛋白質(zhì) 降解途徑，被降解的蛋白通過￡1(泛素激活酶，1]1^911；[1：；[11-301：；^31：；[1^61^71116)42(泛素偶 聯(lián)酶，Ubi quit in-con jungating enzyme)和 E3(泛素連接酶，Ubi quit in ligase)-系列的 作用與多個泛素共價結(jié)合后被蛋白酶復(fù)合體(Proteasome)識別并降解。此為生物大分子在 胞質(zhì)中降解的泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitim proteosome pathway)。該途徑廣泛參與到 細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、抗原提呈等許多生命過程中。
[0003] Nrdpl(neuregulin receptor degradation protein-l)是一種E3泛素連接酶。 Nrdpl能雙向調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的兩條信號通路(降解MyD88抗炎，激活TRIF和TBK1促生干擾素）， 最終介導(dǎo)抗炎和抗病毒的雙重效應(yīng)。過表達(dá)Nrdpl可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎性因子 IL-6和TNFa的mRNA和蛋白的表達(dá)，但是可以促進(jìn)I型干擾素（IFN-β)的產(chǎn)生;干擾Nrdp 1則促 進(jìn)了炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但是抑制了 IFN-β的產(chǎn)生。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Nrdpl可以促進(jìn)MyD88和 TBK1分子的泛素化，誘導(dǎo)MyD88的降解，但是促進(jìn)TBK1的活化，從而抑制MyD88依賴的NF-kB 的活化，引起炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少；同時促進(jìn)IRF3的磷酸化，增加 I型IFN的產(chǎn)生。進(jìn)一 步的驗(yàn)證表明，Nrdpl和E3泛素酶活性缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠的巨噬細(xì)胞受到TLR配體刺激后， 促進(jìn)MyD88依賴的前炎性因子的產(chǎn)生，但抑制TRIF依賴的IFN-β的產(chǎn)生。因此，Nrdpl在TLR的 信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮一雙向II調(diào)節(jié)機(jī)制，一方面通過降解MyD88抑制TLR誘導(dǎo)的炎癥因子的 產(chǎn)生，另一方面通過促進(jìn)TBK1-IRF3的活化促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，為TLR的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研 究提供了新的思路。因此，Nrdpl是一個可能在各種病原體感染的治療中均具有潛在應(yīng)用價 值的藥物靶標(biāo)，在抗炎和抗病毒感染方面前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對小鼠 NRDP1基 因的定點(diǎn)修飾。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞或 胚胎NRDP1基因修飾中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的還一目的在于提供一種NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施方式首先提供了一種小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修 飾系統(tǒng)，該基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)為剪切小鼠 NRDP1基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶 TALENs。其中，上述小鼠 NRDP1基因靶序列如SEQ ID N0.1所示，具體來說，在SEQ ID N0.1序 列中：20~40位核苷酸為識別模塊TALNRD-2F、與57~74位核苷酸的互補(bǔ)序列為識別模塊 TALNRD-2R、40~56核苷酸為間隔序列。上述轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識別上述 識別模塊TALNRD-2F的核酸酶TALEN-L和識別上述識別模塊TALNRD-2R的核酸酶TALEN-R組 成 ;核酸酶TALEN-L為SEQIDN0.2所示核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，核酸酶TALEN-R為SEQID NO.3所示核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
[0008] 進(jìn)一步地，在本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)中，核酸酶 TALEN-L由所述識別模塊TALNRD-2F的識別結(jié)構(gòu)域TALEN-L與經(jīng)過人工改造的DNA切割蛋白 Fok-I融合而成;所述核酸酶TALEN-R由所述識別模塊TALNRD-2R的識別結(jié)構(gòu)域TALEN-R與經(jīng) 過人工改造的DNA切割蛋白Fok-I融合而成。
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施方式還提供上述小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞或胚 胎NRDP 1基因修飾中的應(yīng)用。
[0010] 具體來說，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的上述小鼠 NRDP1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)在哺乳 動物細(xì)胞或胚胎NRDP 1基因修飾中的應(yīng)用，是指建立NRDP 1基因敲除小鼠模型。
[0011] 本發(fā)明的實(shí)施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，包括下述步驟： (1)根據(jù)如SEQIDN0.1所示的小鼠 NRDP1基因靶序列，構(gòu)建具有SEQIDN0.2所示核苷酸序 列的pTALEN-L質(zhì)粒和SEQIDN0.3所示核苷酸序列的pTALEN-R質(zhì)粒；（2)通過體外轉(zhuǎn)錄獲得 以所述PTALNRD-L質(zhì)粒和pTALNDR-R質(zhì)粒為模板的mRNA混合物，顯微注射至小鼠胚胎的卵周 隙中；（3)將步驟(2)得到的小鼠胚胎移植到受體小鼠子宮，產(chǎn)仔獲得NRDP 1基因修飾的小 鼠；（4)使步驟(3)得到的NRDP1基因修飾的小鼠與野生型小鼠交配，得到的仔鼠經(jīng)過PCR和 Western-Blotting測得到敲除雜合子個體，雜合子間交配得到純合子小鼠，即完成NRDP1基 因敲除小鼠模型的建立。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的實(shí)施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法中，還包 括對步驟（1)中得到的pTALNRD-L質(zhì)粒和pTALNDR-R質(zhì)粒進(jìn)行活性檢測的步驟，選擇對小鼠 NRDP1基因具有修飾活性的pTALNRD-L質(zhì)粒和pTALNDR-R質(zhì)粒為模板進(jìn)行所述步驟(2)中的 體外轉(zhuǎn)錄。具體來說，述對步驟（1)中得到的pTALNRD-L質(zhì)粒和pTALNDR-R質(zhì)粒進(jìn)行活性檢 測的步驟為：將所述pTALEN-L質(zhì)粒和pTALEN-R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至小鼠細(xì)胞中，PCR擴(kuò)增目的基 因，通過測序鑒定目的基因是否發(fā)生突變。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的實(shí)施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法中，步驟 (4)之后還包括對所述NRDP1基因敲除小鼠模型進(jìn)行鑒定分析的步驟。具體來說，上述對 NRDP1基因敲除小鼠模型進(jìn)行鑒定分析的步驟為：（1)對NRDP1靶位點(diǎn)進(jìn)行DNA測序，鑒定小 鼠動物模型的基因型；（2)通過Western-Blotting檢測小鼠各組織器官NRDP1蛋白的缺失； (3) 利用Western-Blotting監(jiān)測因?yàn)镹RDP1蛋白缺失而引起各個信號通路蛋白表達(dá)的改變； (4) 觀察小鼠各組織器官或組織是否因?yàn)镹RDP1蛋白缺失而發(fā)生病變。
[0014]此外，本發(fā)明的實(shí)施方式也提供上述小鼠 NRDP 1基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)編碼基因的重 組表達(dá)載體、重組菌或重組細(xì)胞系。
[0015]綜上，本發(fā)明涉及的NRDP 1基因敲除小鼠模型的制備方法，其是根據(jù)小鼠 NRDP1基 因序列，設(shè)計能夠有效識別、修飾小鼠 NRDP1基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶 TALENs，構(gòu)建表達(dá)載體并通過體外轉(zhuǎn)錄獲得靶向NRDP1基因的mRNA混合物，將其注射至小鼠 胚胎并回移至受體母鼠獲得NRDP1基因修飾的小鼠。本發(fā)明利用TALENs介導(dǎo)的基因敲除技 術(shù)，設(shè)計合成了可特異識別并修飾小鼠 NRDP1基因的一對TALENs，并通過體外轉(zhuǎn)錄mRNA注射 小鼠胚胎，一步法獲得了NRDP1雙等位基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠。試驗(yàn)周期短，高效且節(jié)省成 本。本發(fā)明制備的NRDP1基因敲除小鼠模型，不僅可以加深對NRDP1在免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病過 程中基因調(diào)控的認(rèn)識，而且可以為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)提供高水平的試驗(yàn)動物模型。
【附圖說明】
[0016] 圖1為TALENs定點(diǎn)修飾小鼠 NRDP1基因的作用原理示意圖；
[0017] 圖2為TLANEs體外轉(zhuǎn)錄mRNA產(chǎn)物電泳圖；
[0018] 圖3為NRDP1基因敲除小鼠 F0代S84小鼠的基因測序峰圖；
[0019] 圖4為NRDP1基因敲除小鼠 F0代S86小鼠的基因測序峰圖；
[0020] 圖5為NRDP1基因敲除小鼠 F0代s87小鼠的基因測序峰圖；
[0021] 圖6為NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl68小鼠的基因測序峰圖；
[0022] 圖7為NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl68小鼠的基因測序峰圖；
[0023] 圖8為NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl70小鼠的基因測序峰圖；
[0024] 圖9為NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl73小鼠的基因測序峰圖；
[0025]圖10為NRDP1基因敲除小鼠 F3代部分純合子小鼠 PCR檢測結(jié)果電泳圖；
[0026]圖11為樣品編號為55的NRDP 1基因敲除小鼠 F3代部分純合子小鼠的基因測序峰 圖；
[0027]圖12為樣品編號為58的NRDP1基因敲除小鼠 F3代部分純合子小鼠的基因測序峰 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實(shí) 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0029] NRDP1基因與機(jī)體抗炎和抗病毒有關(guān)，可能是各種病原體感染的治療中均具有潛 在應(yīng)用價值的藥物靶標(biāo)。本實(shí)施例應(yīng)用TALENs技術(shù)，針對小鼠 NRDP 1基因 exon 1的AGCT位點(diǎn) 進(jìn)行密碼子突變操作，從而實(shí)現(xiàn)小鼠 NRDP1基因的修飾。
[0030]實(shí)驗(yàn)方案涉及如下：
[0031 ]第一步，根據(jù)需敲除的基因序列設(shè)計出具有特異性的序列TALEN革巴點(diǎn)；
[0032] 第二步，根據(jù)設(shè)計出的TALEN祀點(diǎn)構(gòu)建出TALEN質(zhì)粒；
[0033]第三步，TALEs質(zhì)粒修飾目的基因的效率的檢測；
[0034] 第四步，體外轉(zhuǎn)錄獲得高效修飾目的基因的TA